15.李智明答辩讲稿

,猪背最长肌总蛋白的一维、二维电泳比较分析,作者：李智明指导老师：王翀副教授华南农业大学动物科学学院2005年6月10日,学士学位论文答辩,2,简介,前言与综述蛋白质组学研究通用技术路线图、SDSPAGE凝胶电泳与双向电泳试验设计、以及目前研究进展材料与方法实验材料的采集总蛋白质的抽提和定量SDSPAGE凝胶电泳与双向电泳2DE结果与讨论蛋白质定量标准曲线的制作凝胶图像扫描凝胶图像初步分析主要结论,前言与综述,4,蛋白质组学研究通用技术路线图,前言与综述,5,SDSPAGE凝胶电泳与双向电泳试验设计,蛋白质组的概念一个基因组所表达的蛋白质蛋白质学的概念以蛋白质组为研究对象的新的研究领域,前言与综述,6,蛋白质组学研究的主要技术手段,主要是采用SDSPAGE凝胶电泳与双向电泳。电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gelelectrophoresis）。,前言与综述,7,实验目的,近几年来，在猪肉产业化生产的激烈竞争形势下，西方猪种因其生长速度快、产肉率和瘦肉率高，在我国养猪业中盛行；我国本地猪虽然产肉率低、胴体太肥，但其繁殖性能、肉品品质和风味特色等是最受国际关注、最具特色和国际竞争力的经济性状，并蕴藏着丰富的有益基因，也是我国养猪业持续发展的坚实基础和巨大的潜在优势。为了进一步探讨我国地方品种和引进品种的肉质特性，本实验选择了最具代表性的广东地方品种蓝塘猪和引进的猪种大白猪。直接从体现生命现象和生物功能的执行者蛋白质入手，借助蛋白质组学的研究技术和手段进行研究。蓝塘猪具有生长速度慢、背膘厚、胴体瘦肉率低、肌肉品质好、产仔数高等特点大白猪具有生长速度快、胴体瘦肉率高、产仔数较低等特点,前言与综述,材料与方法,9,实验材料组成,材料与方法,本实验所用的纯种蓝塘猪眼肌组织样品采自广东省板岭原种猪场，共4头（公母各2头）；纯种大白猪眼肌组织样品采自广东省农业科学院畜牧研究所原种猪场，共4头（公母各2头），均为达到体成熟的健康猪。于屠宰后15min内取样，放入一次性封口袋内，做好标记后立即投入液氮速冻，然后转入80冰箱保存。,10,主要方法,总蛋白质抽提蛋白质定量SDSPAGE凝胶电泳染色（银染、考马斯亮蓝染色）双向电泳2DE,材料与方法,结果与讨论,12,蛋白质定量标准曲线制作,结果与讨论,13,标准曲线,结果与讨论,根据上表的数据我们做出下列曲线,14,凝胶图像扫描,利用SharpAR-M205扫描仪高精度扫描、AdobeImageReady7.1扫描并保存图像。由于不能自定义成高分辨率的灰度状态，所以先用真彩色模式，8bit深度，300dpi分辨，存成JPG格式。（在下列图像1中M代表蛋白质Marker，标号分别表示：1、2是Y1；3、4是LT3；5、6是Y1；7、8是LT）上图是考马斯亮兰染色,下图是银染。,结果与讨论,15,双向电泳凝胶图像,Y1（500ug）Y1（1.6抽提80ug）,LT3（1.4抽提500ug）LT（1.6抽提80ug）,结果与讨论,结论,17,主要结论（一）,根据本研究采用的抽提方法，100mg、50mg背最长肌获得的总蛋白质浓度分别约为10g/L、7.8g/L。每次抽提后用12.5变性聚丙稀酰胺凝胶证实，总蛋白质的抽提结果较为理想，见图3的条带。经定量后的平行比较，以取50mg肉样的抽提浓度较一致，可能是蛋白质溶解较为充分的原因。,结论,18,主要结论（二）,提高上样量是有利于低丰度蛋白质检测，但上样量过高，高丰度的蛋白质点过大反而影响到其他蛋白质点的分离和分辨，尤其在银染中还易产生拖尾现象。实验中分别以80g、500g做对比进行分析型2DE，蛋白表达谱如图3.2。80g上样量较少拖尾，图谱清晰。,结论,19,主要结论（三）,由于蛋白质的迁移率与分子量成正比例关系，因而可以用SDSPAGE测定蛋白质分子量。通过已知蛋白质的分子量绘制出标准曲线，未知蛋白质的分子量则可由标准曲线上查出。,结论,20,主要结论（四）,实验中共采用了2种染色方法：银染和胶体考马斯亮兰染色。胶体考染可能在后续鉴定时与质谱较兼容。针对20g上样量的SDSPAGE凝胶电泳，采用银染法获得了理想的结果，图的分辨率说明银染适合分析型电泳显色。目前常用的适于质谱鉴定的凝胶蛋白染色方法为考马斯亮蓝染色，其灵敏度为100ng。针对500g、80g上样的制备型电泳（步骤3.2中的图像扫描），从展现的蛋白点数量来看，考染未见理想结果；与单一的银染相比，未发现显著的分辨率差异，反而出现烂胶。原因很可能是猪背最长肌看家蛋白或结构蛋白占了太大丰度比例，影响了低丰度蛋白的呈现。胶体考染法染色过程大约要2448小时，在试验中胶表现较软、易烂。所以在后续的制备型电泳中，仍多数直接选用银染法。,21,主要结论（五）,电泳的结果保存方式有原始凝胶保存和图像保存。本实验采用了湿凝胶保存法，一是因为其方便易行，只需加少量双蒸水用密实袋置4冰箱，二是因为本实验的凝胶厚度1.5mm，作干胶易龟裂；图像结果采用高精度扫描仪扫描存成j