DNA重组技术基本工具.ppt

专题1基因工程,1-1DNA重组技术的基本工具,基因工程的概念,基因工程：指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术或基因拼接技术。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,定向改造生物的遗传性状,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,基因工程的概念理解,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想：需要做哪些关键工作？,普通棉花抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与运载体DNA“缝合”,关键步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,1-1DNA重组技术的基本工具,“分子手术刀”限制酶,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要从原核生物分离纯化出来,4000种。,1、来源：,2、种类：,3、作用：,5、结果：,形成两种末端,一、“分子手术刀”限制性核酸内切酶,4、切割方式：,错位切和平切,G,限制酶切割磷酸二酯键,限制性内切酶作用过程,1、大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端。2、Sma能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端。,常见的两种限制酶,Sma,平末端平末端,EcoR,黏性末端,黏性末端,什么叫黏性末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,寻根问底,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,寻根问底,1、要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。,2、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端。,3、是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了?,实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。,思考与探究,G,连接酶连接磷酸二酯键,DNA连接酶的作用过程：,二、分子缝合针DNA连接酶,作用部位：,是磷酸二酯键（扶手）不是氢键（梯子）,DNA连接酶将两条DNA链连接起来的酶。,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,连接酶种类：,两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来,DNA连接酶的缝合作用,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？,T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,DNA连接酶的缝合作用,AATTG,C,A,A,T,T,A,A,T,T,DNA聚合酶的作用,都能催化形成磷酸二酯键,都是蛋白质,不需要,需要,形成完整的重组DNA分子,形成DNA的一条链,基因工程,DNA复制,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,1、外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？,“分子运输车”载体。,2、载体的作用有哪些？,作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。作用二：利用载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。（随载体的复制而复制）,三、基因进入受体细胞的载体,“分子运输车”载体,常用的载体主要有两类：1）细菌细胞质的质粒2）噬菌体或某些动植物病毒,原理：病毒，细菌等的侵染性。,认识常用的载体质粒,质粒主要存在于细菌和酵母菌体内。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于染色体或细菌拟核之外，能自我复制的小型环状双链DNA分子。,质粒的特点：,1、细菌染色体外双链环状DNA分子2、能自我复制并在受体细胞中稳定存在3、有一个或多个限制酶切点4、有特殊的遗传标记基因,议一议,2、能否用SARS病毒作为基因载体？,3、作为载体，若没有切割位点将怎样？,4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？,5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？,1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？,双链DNA,不能,不能进行DNA的重组,载体上应有标记基因,可能造成基因丢失,1）能够在宿主