炎症反应实验报告

1 / 13 炎症反应实验报告 实验题目：糖皮质激素对炎症的治疗 班级： 12 级临七 3 班 姓名：廖梦宇 学号：2016021320 一、 实验原理： 二甲苯涂于小鼠耳部，可致局部组织炎症，释放某些炎症物质，造成耳部急性渗出性炎性水肿。糖皮质激素可明显抑制各种致炎因素引起的炎症，从而改善红、肿、热、痛等症状。通过测定小鼠耳片的重量，观察炎症的发生及糖皮质激素的抗炎作用。 二、 实验目的： 观察糖皮质激素对二甲苯所致小鼠耳部水肿及毛细血管渗透的影响。 三、 实验步骤： 1. 分组：取 6只小鼠，随机分为 2组。分别称重并标记编号。观察一般活动。 2. 给药： 1#, 2#, 3# 小鼠给地塞米松， /10g 4#, 5#, 6# 小鼠给生理盐水， /10g 给药途径：腹腔注射 3. 致炎： 30分钟后，两组小鼠于左耳前后两面均匀涂二甲苯，记录时间。另 侧做对照。 2 / 13 4. 耳片：致炎后 30 分钟，小鼠颈椎脱臼处死，沿耳廓基线剪下两耳，用打孔器分别 在两耳同一部位打下耳片，称重，记录 。 5. 计算：肿胀程度 =/右耳片重量 *100% 6. 统计学检验 四、 实验结果： 编号 2 3 4 5 6 给药 地塞米松 地塞米松 生理盐水 生理盐水 生理盐水 左耳片重量 右耳片重量 肿胀程度 五、 讨论： 根据实验结果，生理盐水没有明显的药理作用，小鼠因耳部涂抹二甲苯而产生炎症反应，出现“红、肿、热、痛”的现象；地塞米松属于 糖皮质激素的一种，有显著的抗炎作用。本实验中，由于操作失误， 1 号小鼠在涂抹二甲苯时用力过大致死，实验数据丢失。 流式细胞术 3 / 13 背景：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定和一些疾病发生过程等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸又脂膜内侧翻向外侧。在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的 PS 从而将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程中并不伴随局部的炎症反应，而在细胞坏 死的过程中则常常伴随着炎症反应。 AnnexinV 是一种分子量为 35-36kD的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的 PS 高亲和力特异性结合。 PS 外翻发生在细胞核破裂， DNA片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得 AnnexinV与 PS的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。 检测原理：用标记了 FITC 的 AnnexinV 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。细胞坏死的过程中也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞会结合AnnexinV-FITC。正常 细胞核早期凋亡的细胞膜是完整的，Propidium iodide 是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞， PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将 AnnexinV 与 PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同时与 AnnexinV-FITC和 PI结合显色，而 PI则被4 / 13 排除在活细胞和早期凋亡细胞之外。在没有巨噬细胞的情况下，凋亡的最后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体，从而使凋亡晚期的细胞也同时被 FITC 和 PI结合染色呈现双阳性。 在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为；而右下象限为凋亡细胞，显现。 样品染色： 1、离心收集悬浮细胞，弃培养基。贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。 2、用冷 PBS洗涤细胞两次，尽可能吸尽 PBS。 3、用 400ul1xAnnexinV 结合液悬浮细胞，浓度大约1x10*6cells/ml。 4、在细胞悬浮液中加入 5ulAnnexinV-FITC 染 色液，轻轻混匀后于 2-8 度避光条件下孵育 15分钟。 5、加入 10ulPI 染色液后轻轻混匀于 2-8 度避光条件下孵育 5分钟。 6、立即用流式细胞仪或荧光显微镜检测。 注意事项： 1、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。 5 / 13 2、细胞处理要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。 3、 AnnexinV-FITC和 Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露在光下 的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。 4、由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。 5、使用 AnnexinV-FITC试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不需要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。 6、如果细胞样品中含有血小板，如血液样品，请使用含有 EDTA 的缓冲剂并 200g 离心洗去血小板。因为血小板含有 PS，能与 AnnexinV结合。 7、流式细胞仪检测时，细胞数量应不低于 1x10*5。 8、如果细胞 收集过程中使用了胰酶，需注意用 PBS洗 净去 除残留的 胰酶 。残留的 胰酶 会消化并 降解AnnexinV-FITC，最终导致染色失败。 9、对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色；处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞，胰酶的消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤， PI摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与6 / 13 AnnexinV-FITC 的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰 酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应不用 EDTA， EDTA影响 AnnexinV 与PS的结合。 10、成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上 PS的密度、发生凋亡时 PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间以及实验过程中机械损伤的程度等，把这些影响因素进行优化对试验成功与否至关重要。务必根据每次实验样本类型和操作流程对这些步骤进行优化。 11、有极少数细胞株其细胞膜上 PS的密度极低，难以染色，此时不适合用 AnnexinV方法检测凋亡。 细胞、组织基因组 DNA提取试剂盒 样品预处理： 动物组织： 1、切取 5-20mg 的动物组织材料，在液氮中将组织研磨成粉末，并转移至的离心管中。 2、然后加 400ul ACL Solution 入和 10ul 的Proteinase K。如有凝结块，可以用枪头吹吸打碎。 3、震荡混匀 1分钟，然后置于 55C放置 20分钟 3小时，在此期间间或取出混匀，有助于充分裂解。裂解完全7 / 13 的样品应澄清透明。不同来源的组织，完全裂解时间可能差异较大。 4、取出样品，待降至室温时轻轻震荡混匀。 啮齿类动物尾巴： 1、从动物尾部末端切取 1cm 的组织材料，在液氮中将组织研磨成粉末，并转移至的离心管中。 2、然后加入 400ul ACL Solution 和 10ul 的Proteinase K。 3、震荡混匀 1 分钟，然后置于 55C 水浴 10 20 分钟，在此期间可以适当取出混匀，有助于充分裂解。 4、取出样品，待降至室温时轻轻震荡混匀。 培养成熟的动物细胞： 1、在 5001000rpm 下离心约 35 分钟，收集细胞。 2、加入 400ul ACL Solution 和 10ul的 Proteinase K。 3、震荡混匀 1 分钟，然后置于 55C 水浴 10 20 分钟，在此期间可以适当取出 混匀，有助于充分裂解。 4、取出样品，待降至室温时轻轻震荡混匀。 DNA 提取： 经过上面预处理的样品按照下面步骤提取基因组DNA。 5、在经过预处理好的样品中，依次加入 300ul Ext 8 / 13 solution 和 300ul AB solution,用力摇匀，然后 12000rpm离心 5分钟。溶液将分层，上层为蓝色的抽屉层，下层为透明水相，两层溶液中间可能会有部分沉淀层， DNA 在下层水相中。 注：如样品量较少或溶液澄清不粘稠，可不添加 Ext solution ，只添加 300ulAB solution,摇匀后离心。 6、将枪头穿过上层溶液，深入到下层溶液，将下层溶液仔细吸出到 GenClean Column 中，尽量避免吸到上层溶液及中间层的沉淀。 7、 8000rpm 离心 1 分钟，取下 GenClean Column，倒掉收集管中废液。 8、将 GenClean Column 放回收集管中，加入 500ul Wash Solution,8000rpm,室温离心 1 分钟。 9、重复步骤 8一次。 10、取下 GenClean 柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中， 12000rpm，室温离心 1 分钟，以除去残留 Wash Solution。 11、将柱放入新的洁净的离心管中，在柱中央加入50100ul Elutionn Buffer,室温或 55C 放置 2 分钟。然后12000rpm,室温离心 1分钟。离心管中的液体即为基因组 DNA。根据用途，样品可于 4C或 -20C保存。 乳酸脱氢酶测定试剂盒 9 / 13 一、试剂盒组成及配制： 试剂一：基质缓冲液 试剂二：辅酶 1，配制：每支粉剂加双蒸水溶解，溶解后冷冻可保存 2 周，如需多次使用建议分装冷冻。 试剂三： 2,4-二硝基苯肼 试剂四： 4mol/l NaOH，配制： 10倍稀释。 试剂五： 2umol/l丙酮酸标准液。 二、测定步骤： 三、计算及举例： 血清中 LDH活性 =测定 OD值 -对照 OD 值 /标准 OD值 -空白 OD值 x 标准品浓度 xNx1000 乳酸脱氢酶释放率 =培养基中酶活性 /培养基中酶活性 +细胞层酶活性。 试验中需要同时检测培养基和细胞裂解后细胞悬液中的乳酸脱氢酶。 四、测定原理： LDH 乳酸 丙酮酸 37C水浴 丙酮酸 +2,4-二硝基苯肼丙酮酸二硝基苯腙 碱性 根据比尔定律，可测乳 酸脱氢酶活性。 10 / 13 五、标准曲线制备： 1、前处理：将 2umol/ml 的丙酮酸标准品用双蒸水分别 200 倍、 100 倍、 50倍、 20倍、 10倍、 5倍、 2 倍稀释后按照操作表制作标准曲线。 混匀，室温放置 5 分钟，波长 450nm，酶标仪测定吸光度。 免疫细胞化学 一、试剂及材料： 六孔板、盖玻片、移液枪、枪头、丙酮、 PBS、 triton X-100、 H2O2、 BSA、一抗、二抗、湿盒、甘油。 二、方法： 将已灭菌的盖玻片 置于 6 孔培养板中，按10*410*5/ml 的密度将细胞接种于培养板中进行爬片，培养612小时，待细胞贴壁后， 35天进行免疫细胞组织化学染色鉴定。 PBS清洗时将玻片置于小培养皿中。 步骤如下： 1、 PBS清洗标本 3次，各 3min. 2、 95%酒精固定 15min. 3、空气干燥 5min。 4、 PBS清洗标本 3次，各 3min。 5、 % triton X-100 孵育 1 次 15min. 6、 PBS清洗标本 3次，各 3min. 11 / 13 7、 3%H2O2 、血红蛋白 、白细胞 总数及 分类，此外还有 血小板计数。 红细胞计数正常参考值： 男性： X 10 的 12次方 / L; 女性： X 10的 12次方 / L; 临床意义 红细胞增多 1.提示先天性心脏病，肺心病，肺气肿，高原地区适应不全等病 ; 2.腹泻、大汗虚脱等引起机体脱水，血液浓缩的病变 ; 3.某些恶性肿瘤，如小脑成血管瘤，肾癌，肝细胞癌，雄激素分泌细胞肿瘤等。 红细胞减少 1.不同原因引起的贫血 ; 2.血液稀释所致的红细胞相对减少，如输液不当，喝低渗性溶液过多等。 血红蛋白正常参考值 1.男性： 120 160g/L; 2.女性： 110 150g/L; 3.新生儿： 170 200g/L。 临床意义 与红细胞计数类似，但血红蛋白测定更加精确。贫血时，两者均下降，但下降程度并不完全平行。一般而言，12 / 13 缺铁性贫血时血红蛋白减少比红细胞减少明显，而恶性贫血则红细胞比血红蛋白减少更多。 白细胞总数正常参考值 1.成人： 4-10X10的 9 次方 /L;2.儿童： 12X10的9 次方 /L;3.新生儿： 15 20X10的 9 次方 /L。 临床意义 白细胞分类计数正常参考值 1.中性粒细胞： 50%-70%;杆状核： 1% 5%;分叶核：50% 70%;2.嗜酸粒细胞： % 3%;3.嗜碱粒细胞： 0% %;4.淋巴细胞： 20%-40%;5.单核细胞： 1%-8%;6.嗜酸粒细胞计数： X 10的 9 次方 /L。 临床意义 1.中性粒细胞增加 急性感染：如大叶性肺炎、化脓性脑膜炎、细菌性心内膜炎、败血症、胆囊炎、肾盂肾炎、乙型脑炎、麻疹、钩端螺旋体病、回归热、急性血吸虫病等 ;白血病及恶性肿瘤：如慢性粒细胞白血病、恶性肿瘤骨转移等。急性中毒：糖尿病酮中毒、慢性肾炎尿毒症、妊娠中毒症 ;急性汞、铅中毒、安眠药中毒、某些药物过敏或过敏性休克 ;急性失血：尤其是内出血 ;严重创伤：如车祸、烧伤、移植术后的排斥反应等 ;生理