生物工程PPT课件.pptx

PCR在检验食品微生物中的应用,.,PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应，又称多聚酶链反应、基因的体外扩增法、无细胞克隆技术等。这是一种在生物体细胞外通过酶促合成特异DNA或DNA片段的方法。,概念,PCR仪就是我我就是PCR仪,利用PCR技术,能使极其微量的目的基因或某一特定的DNA片段在几小时后迅速扩增数百万倍,且无需通过繁琐费时的基因克隆程序,便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。PCR技术优点：特异性强,灵敏度高、快速和准确等,技术优势,食品在生产、运输、销售过程中易受到微生物的污染,所以微生物检验是食品检验中的一项重要内容。目前常规方法(尤其是对致病菌的检验)操作繁琐,耗时长。随着PCR技术的发展,人们尝试利用该技术来进行微生物检验,取得了较好的效果。,在食品微生物检测方面的应用,沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧，不耐热，可感染人和动物，极易引起人类的食物中毒。乳、蛋、家禽和肉类产品是其主要传播媒介。由于沙门氏菌的含量水平在污染食品中较低，加上食品本身性质的干扰和食品加工过程的影响,使得检测沙门氏菌相对困难。传统方法一般需要47d才能完成。PCR技术以其敏感性强、特异性高、简便、快速等优点,已广泛应用于沙门氏菌的检测。,沙门氏菌,1993年，Song等人利用PCR技术成功的检测到血液中的伤寒沙门氏菌DNA。1997年，沈孝民等人用PCR技术对各种不同血清型的沙门菌和已知被该菌污染的鱼粉和动物产品的肉汤培养物进行了检测，结果显示该方法特异性高，且灵敏、快速，可检出0.05pg水平的DNA，并可在1d之内完成。2008年，钟伟军等人将荧光定量PCR应用于快速检测鲜猪肉和鲜鸡蛋等食品中的沙门氏菌含量的检测，实验在12h内完成。,研究进展,我们虽然长相不一样但我们都是荧光定量PCR哦！么么哒！,恒温荧光检测仪,革兰氏阳性菌，耐碱不耐酸，在低温下仍能生长。是李斯特菌属中引起食物中毒的菌种，它能致病和产生毒素，其毒素具有溶血性质。来源于动物和植物的新鲜食品。传统方法：克隆培养法：需要34周才能得出结果血清学检测方法(如ELISA等)：存在着特异性、敏感性差等问题,单核细胞增生李斯特菌,姜永强等根据发表的单核细胞增生性李斯特菌的重要毒力基因hlyA的全基因序列，设计出引物，建立了该菌的PCR诊断方法。孙焕冬等通过半套式PCR的方法检测模拟阳性牛奶的致病菌,在有10个活菌存在时即可扩增出特异性产物,灵敏度比常规PCR提高了10倍,建立起了一套快速检测食物中李斯特菌的方法。巢国祥等通过扩增hly基因PCR法建立快速检测单核细胞增生李斯特菌方法检测模拟污染生猪肉、水和牛奶,检测限达10cfu/5g(mL)。,研究进展,革兰氏阳性兼性厌氧菌，能耐受较低水分活性。对热、高糖有一定的耐受能力。本菌产生的食物中毒发生频率高，主要通过污染食品如肉色拉和奶制品等引发食物中毒，因此对食品和食品制造环境中的金黄色葡萄球菌进行鉴定是食品卫生检验的重要内容。该菌能在食物内增殖并产生体外毒素肠毒素，该毒素是引起食物中毒的主要原因。,金黄色葡萄球菌,传统方法（免疫学方法）：常出现假阳性或假阴性假阴性：有些菌株检测分析虽然含有毒素基因，但基因表达不好，或是缺乏稳定的遗传成分，这就容易出现假阴性假阳性：有些菌株的血清型容易产生交叉反应,因而又常常出现假阳性。Johenson等建立了检测葡萄球菌肠毒素毒素基因的PCR技术，可在较短的时间内检测出葡萄球菌毒株，并且具有极高的特异性、敏感性。Scherrer等分别从罐装牛奶,羊肉当中用PCR的方法检测出了金黄色葡萄球菌的存在。,检测技术,革兰氏阴性杆菌，致病性大肠杆菌主要有肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌。肠出血性大肠杆菌已经成为世界性的重要的公共卫生和食品安全问题,曾在日本、美国、加拿大等国造成了暴发流行和大规模食物中毒事件。大肠杆菌O157:H7可引起出血性腹泻,严重的可引起溶血性尿毒综合症、血栓形成性血小板减小性紫癜,其中并发两病者死亡率高达80%左右,危害十分严重,大肠杆菌,薄清如等建立了五重和四重PCR方法,同时检测大肠杆菌O157:H7的O抗原、H抗原和4种毒素基因，可在较短的时间内检测、鉴定大肠杆菌O157:H7,并有较高的特异性,解决了传统细菌检测方法耗时长、灵敏度低,并有交叉反应等问题。张险朋等尝试应用荧光PCR方法检测冻肉产品中的0157:H7,结果与生化鉴定检测一致,而且从增菌到出结果可以在10h内完成,而且操作简便,在检测过程中可以进行实时监控杨小鹃等对大肠杆菌O157:H7进行特异性检测的多重PCR技术,可在910h内完成,与传统检测方法相比,该多重PCR方法省时、省力、高效。,研究进展,是由黄曲霉、寄生曲霉、模式曲霉这一类真菌产生的毒素。可引起动物急性中毒死亡与致癌，是致癌力最强的毒素。由黄曲霉毒素污染食品及油料作物引起对人的危害的报道很多，是国内外科学界研究的热点。,黄曲霉毒素,传统检测法（鉴别培养基法或免疫学法）缺点：样品需纯化，费时、费力PCR：能快速检测微量黄曲霉毒素DNA片段。秦文彦等建立了快速灵敏检测食品和饲料中产黄曲霉毒素真菌的多重PCR体系。,黄曲霉毒素,蔡亦红以福氏志贺菌侵袭性质粒抗原H基因为研究对象建立一种稳定的、高敏感性和特异性的PCR体系,力图快速、准确检测食品中志贺菌感染。罗兆飞等，根据奇异变形杆菌抗亚碲酸盐基因的保守序列设计Q248F/R,确定PCR条件,利用标准菌株检验方法的特异性和敏感度。引物Q248对奇异变形杆菌检测具有良好的特异性,对人工布菌样品的检测敏感度达112102cfu/100g，适用于动物性食品中奇异变形杆菌检测的快速筛选检验。,其他致病菌,翁文川等根据副溶血弧菌gyrase基因序列设计合成副溶血弧菌荧光定量PCR诊断试剂盒,该方法特异性强、敏感性高,操作简便快速,检验周期仅需36h,扩增与检测在封闭单管进行,可避免常规PCR方法易污染缺陷,具有很