报告基因选择.doc

碧云天生物科技携程提供各种报告基因载体详情请访问（/product-index-d2006.htm）1961年，华盛顿大学Friday Harbor 实验室的Osamu Shimomura和Frank Johnson首次从水母Aequorea victoria中分离出依赖钙离子的生物发光蛋白，命名为aequorin。在分离过程中，还发现第二种蛋白，它缺乏发射蓝光的生物发光成分，但是在紫外光照射时可以发出绿色荧光，故命名为绿色荧光蛋白（GFP）。在随后的20年里，研究者测定aequorin和绿色荧光蛋白在水母体内共同作用，将依赖钙离子的生物发光信号转换为发绿色荧光特性。图1 虽然编码绿色荧光蛋白的基因在1992年就被克隆出来，但是直到几年之后它才作为一种重要的分子探针在细菌和线虫的基因中表达得以应用。在这些前期研究基础上，绿色荧光蛋白已经利用基因工程手段改造成为很多不同颜色的突变体，融合蛋白和生物传感器，被统称为荧光蛋白。近来，从其他物种中也分离出来荧光蛋白，丰富了已有荧光蛋白的颜色。随着荧光蛋白技术的飞速发展，这些荧光蛋白的应用更为广泛，并不仅仅局限于活细胞中标记生物分子中。绿色荧光蛋白和它改造过的衍生物，蓝色、青色和黄色荧光蛋白都用来构建荧光嵌合蛋白载体转染后在活细胞、组织、和整个器官中表达。红色荧光蛋白在其他生物体内包括珊瑚体内分离出来，也有着广泛的应用。荧光蛋白技术避免了纯化、标记和转入细胞内部的问题，也不用制作特定的抗体或内部抗原等。一、绿色荧光蛋白Aequorea victoria的特性和改造在绿色荧光蛋白各个方面特性最重要的是它保持荧光的特性的蛋白结构大小为27 kD。最基本的荧光基团是来自于一个三联体的氨基酸：Ser65，Tyr66和Gly67。虽然这个简单的结构在自然界中普遍存在，但是都没有荧光产生。荧光蛋白唯一不同的是这个三联体残基的位置在一个稳定的由11个折叠组成的桶状结构的中心。绿色荧光蛋白中心的疏水环境中，Ser65的羧基碳和Gly67的氨基氮相互反应，生成imidazolin-5一个杂环氮环结构。进一步氧化使imidazoline环和Tyr66结合以及一些荧光蛋白种类的改造。要注意原始的绿色荧光蛋白的荧光基团存在两个状态。一个质子化状态，最大吸收激发光波长为395nm，另一种的激发光波长为475nm。无论激发光波长是多少，荧光激发的最大波长为507nm。图2 荧光蛋白荧光基团的两种主要的特性在做探针的时候有重要的应用。首先，绿色荧光蛋白的光物理特性是很复杂的，因此荧光分子适合多种改造。已有很多研究集中在对原始绿色荧光蛋白的精细改造上。绿色荧光蛋白另一个重要的特性是荧光的发生极为依赖于环绕在三肽荧光基团的分子结构。绿色荧光蛋白变性会破坏荧光，在三肽荧光基团周围的残基的突变会强烈改变荧光蛋白的特性。折叠桶氨基酸残基的包装非常稳定，量子产率可高达80%。这种紧密的蛋白结构使得其本身可以抵抗pH变化，温度改变和变性剂（如尿素）等。虽然这些缺陷可以通过其他的突变来克服，但是衍生的荧光蛋白通常比原始蛋白对环境更加敏感。这些限制因素要在设计实验时充分考虑到。为了将荧光蛋白应用于哺乳动物系统中，对野生型绿色荧光蛋白进行了一些基本的修饰，这些改造过的衍生物在目前普遍被使用。第一步就是要使荧光蛋白改造成可以在37环境下正常发光。对野生型荧光基团的改造在28下很有效，但是温度增加到37时所有突变体的荧光都会减弱。将Phe64的苯丙氨酸突变为亮氨酸提高了荧光基团在37的荧光，至少会跟在28是荧光强度一致。这一改造后的突变体是来源于Aequorea victoria的荧光蛋白最常用的，但是不是唯一的，因为后来也发现了很多其他的突变体。除了要提高它在37的发光情况，还提高了绿色荧光蛋白在哺乳动物细胞中整体的亮度（通过密码子使用优化）。在人体组织中，共有190多个无义突变引入提高其表达的编码序列。一个Kozak的翻译起始位点（包括A/GCCAT序列）通过插入缬氨酸引入到荧光蛋白序列中。这一插入和其他改造荧光蛋白方法使得绿色荧光蛋白成为活细胞观察中非常常用的荧光探针。二、颜色多样的荧光蛋白已经有大量的荧光蛋白的基因改造突变体被开发出来，它们的荧光颜色几乎具有涵盖所有可见光的色谱（表一）。对原始Aequorea victoria水母中的绿色荧光蛋白的改造产生了很多新的蛋白，颜色从蓝到黄，这些荧光蛋白都已经广泛用于生命科学的研究中。长波长的荧光蛋白（发射光在橙色和红色光谱区域内），已经从海葵Discosoma striata和珊瑚类Anthozoa中开发出来。另外还发现有一些种类中有类似青色、绿色、黄色、橙色、和深红色荧光蛋白。正在进行的研究工作集中在开发更稳定，荧光强度更大的荧光蛋白上。表一 Fluorescent Protein PropertiesFluorescent Protein PropertiesProtein (Acronym)Excitation Maximum (nm)Emission Maximum (nm)Molar Extinction CoefficientQuantum Yieldin vivo StructureRelative Brightness (% of EGFP)GFP (wt)395/47550921,0000.77Monomer*48Green Fluorescent ProteinsEGFP48450756,0000.60Monomer*100Emerald48750957,5000.68Monomer*116Superfolder GFP48551083,3000.65Monomer*160Azami Green49250555,0000.74Monomer121mWasabi49350970,0000.80Monomer167TagGFP48250558,2000.59Monomer*110TurboGFP48250270,0000.53Dimer102AcGFP48050550,0000.55Monomer*82ZsGreen49350543,0000.91Tetramer117T-Sapphire39951144,0000.60Monomer*79Blue Fluorescent ProteinsEBFP38344529,0000.31Monomer*27EBFP238344832,0000.56Monomer*53Azurite38445026,2000.55Monomer*43mTagBFP39945652,0000.63Monomer98Cyan Fluorescent ProteinsECFP43947632,5000.40Monomer*39mECFP43347532,5000.40Monomer39Cerulean43347543,0000.62Monomer*79CyPet43547735,0000.51Monomer*53AmCyan145848944,0000.24Tetramer31Midori-Ishi Cyan47249527,3000.90Dimer73TagCFP45848037,0000.57Monomer63mTFP1 (Teal)46249264,0000.85Monomer162Yellow Fluorescent ProteinsEYFP51452783,4000.61Monomer*151Topaz51452794,5000.60Monomer*169Venus51552892,2000.57Monomer*156mCitrine51652977,0000.76Monomer174YPet517530104,0000.77Monomer*238TagYFP50852464,0000.60Monomer118PhiYFP525537124,0000.39Monomer*144ZsYellow152953920,2000.42Tetramer25mBanana5405536,0000.7Monomer13Orange Fluorescent ProteinsKusabira Orange54855951,6000.60Monomer92Kusabira Orange255156563,8000.62Monomer118mOrange54856271,0000.69Monomer146mOrange254956558,0000.60Monomer104dTomato55458169,0000.69Dimer142dTomato-Tandem554581138,0000.69Monomer283TagRFP555584100,0000.48Monomer142TagRFP-T55558481,0000.41Monomer99DsRed55858375,0000.79Tetramer176DsRed256358243,8000.55Tetramer72DsRed-Express (T1)55558438,0000.51Tetramer58DsRed-Monomer55658635,0000.10Monomer10mTangerine56858538,0000.30Monomer34Red Fluorescent ProteinsmRuby558605112,0000.35Monomer117mApple56859275,0000.49Monomer109mStrawberry57459690,0000.29Monomer78AsRed257659256,2000.05Tetramer8mRFP158460750,0000.25Monomer37JRed58461044,0000.20Dimer26mCherry58761072,0000.22Monomer47HcRed158861820,0000.015Dimer1mRaspberry59862586,0000.15Monomer38dKeima-Tandem44062028,8000.24Monomer21HcRed-Tandem590637160,0000.04Monomer19mPlum59064941,0000.10Monomer12A0000.04Tetramer11* Weak Dimer1. 绿色荧光蛋白虽然绿色荧光蛋白产生很重要的荧光而且荧光也非常稳定，但是激发光的最大值与紫外线区非常接近。因为紫外光需要特殊的光学考虑而且对细胞有毒害作用，所以通常不适宜活细胞光学观察。幸运的是，通过点突变，将绿色荧光蛋白的65位上的丝氨酸变为苏氨酸，因此绿色荧光蛋白的激发光的最大值很容易的改变为488 nm（在青色区域）。这一改造后的突变体被广泛应用，被命名为EGFP（增强的绿色荧光蛋白），还可以购买到含有编码这个蛋白序列的载体（BD公司）。此外，EGFP可以用普通的滤光片观察，它是目前可以利用的荧光蛋白中最亮的。这些特征使得EGFP成为最受欢迎的荧光探针，是单一荧光标记实验中最好的选择。唯一的确定就是EGFP对pH值较敏感和易于二聚化。除了EGFP，另外一些改造过的荧光蛋白也用于活细胞观察中。光稳定性和亮度最好的就是Emerald变种，但是并没有商业应用。一些人源化的绿色荧光蛋白在FRET实验中显示出很大的优势。将64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸产生的突变体在400nm处达到最大激发峰值，可以和增强的黄色荧光蛋白一起使用。另一种突变S65C（将65位的丝氨酸替换为半胱氨酸）在474nm处达到最大激发峰值，这一突变体已经在FRET实验中广泛应用。最后，一种叫ZsGreen1珊瑚分离蛋白（发射峰值为505nm）已经成为EGFP的替代物。在哺乳动物细胞中表达时，ZsGreen1比EGFP亮度高，但是不能产生融合突变体，像其他珊瑚分离蛋白一样易于形成四聚体。2. 黄色荧光蛋白在绿色荧光蛋白的晶体结构研究中发现203位苏氨酸接近生色团后，对黄色荧光蛋白家族的研究才开始。将203位苏氨酸突变为色氨酸可以稳定生色团在激发状态的偶极矩，这样可以使激发光和发射光的波长均增加20nm。并进一步改造成增强黄色荧光蛋白（EYFP）。EYFP是目前应用最广最亮的荧光蛋白之一。EYFP的亮度和发射光谱的有机结合使得这一荧光探针在荧光多色成像中得到很好的应用。EYFP还可以与增强青色荧光蛋白（ECFP）或GFP2一起应用到FRET中。然而，黄色荧光蛋白也存在一些问题，如对酸性条件非常敏感，pH6.5时会失去近50%的荧光。除此之外，EYFP对氯离子非常敏感，而且光漂白现象比绿色荧光蛋白还严重。图3 对黄色荧光蛋白的结构研究已经解决了上述问题。Citrine变种的亮度与黄色荧光蛋白相当，而且可以抗光漂白、酸性条件和其他环境因素的改变。一种珊瑚蛋白，ZsYellow1，产生的真正的黄光是多色荧光实验中的理想选择。像ZsGreen1一样，这个衍生物也不能像EYFP产生融合蛋白，还易于产生四聚物。越来越多黄色荧光蛋白的衍生物已经用于FRET研究中，在其他研究中也表现出巨大的潜力。3. 蓝色和青色荧光蛋白蓝色和青色荧光蛋白变种是将绿色荧光蛋白的66位的酪氨酸残基突变为组氨酸形成的。这一转变使蓝色发射光最大波长为450nm，而突变为色胺后，荧光的峰值在480nm。这两个荧光蛋白的荧光都很弱，需要改造来提高折叠效率和荧光亮度。尽管进行了改造，两者的荧光蛋白亮度仅为增强型绿色荧光蛋白的25-40%。除此之外，蓝色和青色荧光蛋白在不常用的光谱区应用起来很有效，所以需要特殊的滤光片和激光光源。除了以上缺点，在多颜色荧光标记和FRET实验中这两种荧光蛋白得到了较多的应用。尤其是增强型青色荧光蛋白，可以被氩离子激光激发脱离峰值（用457nm光谱线），而且比蓝色衍生物更能抵抗光漂白作用。跟其他荧光蛋白相比，对可见光蓝色区域的荧光蛋白并没有引起很高的重视，在这一组荧光蛋白中主要研究集中在青色荧光蛋白中。图4 在所有改进过的青色荧光蛋白中，AmCyan1和Cerulean两个变种最有应用前景。AmCyan1荧光蛋白变种来源于Anemonia majano。跟增强型青色荧光蛋白在哺乳动物表达中相比，已经人源化产生了亮度相对高并可以抵抗光漂白的荧光蛋白。与其他的珊瑚蛋白相似，这种荧光探针也易于形成四聚体。Cerulean荧光探针已经通过对增强型青色荧光蛋白定点突变开发出来，产生了一个高消光系数和量子产量提高的变种。Cerulean的亮度至少为增强型青色荧光蛋白的两倍；在TRET中，也证实与黄色荧光蛋白一起使用时，大大提高了信噪比。4. 红色荧光蛋白荧光蛋白开发的主要目标已经变成构建红色荧光衍生物，使它的特性相当于或者超过绿色荧光蛋白。在诸多的红色荧光蛋白的优点中，最突出的是它可以跟现在的共聚焦显微镜和宽视场显微镜兼容（和它们的滤光片配置），还有就是可以对整个动物成像，使动物在红光下更透明。因为以Aequorea victoria水母的绿色荧光蛋白为基础构建红色转化突变体的成功率已经远高于构建黄色转化突变体，因此研究人员的研究方向转移到这种热带珊瑚上来。第一个广泛应用的荧光蛋白是从Discosoma striata中分离得到的，通常被叫做DsRed。一旦成熟，DsRed的荧光发射光谱峰值为583nm而激发光谱主要峰值为558nm，其他次要峰值在500nm附近。然而，DsRed也有一些问题存在。当荧光发射在绿光区域时，DsRed的成熟缓慢，需要一段时间。说到绿色状态，这一问题在与其他绿色荧光蛋白一起在多标记实验中会遇到很多问题，因为光谱重叠了。此外，DsRed易于形成四聚体，也可以形成大的蛋白在活细胞中聚集。虽然这些缺点在DsRed作为报告基因应用时并不重要，但是作为表位标签应用时就受到了很大的限制。与绿色荧光蛋白相比，DsRed结合物不像绿色荧光蛋白那样成功而且毒性更大。DsRed荧光蛋白应用的一小部分问题已经通过突变技术得到了克服。第二代DsRed，即大家所熟知的DsRed2，它的多肽氨基末端已经进行了一些突变改造，这样就可以组织蛋白凝集和降低了毒性。除此之外，通过这些修饰，荧光基团的成熟时间也变短。DsRed2蛋白还是会形成四聚体，但是由于它成熟加快，所以在多色荧光标记实验中可以更好的跟绿色荧光蛋白结合使用。在第三代DsRed的突变体中，成熟时间更短，荧光强度也增强。DsRed-Express的红色荧光发射光在表达后一个小时就可以观察到，而DsRed2要在表达后6个小时观察，DsRed则需要11个小时。一个叫做RedStar的酵母中使用的变种，成熟率和亮度均有增加。DsRed-Express和RedStar两个变种中绿色状态并不明显，这一特性使得这两种荧光蛋白成为多色标记实验中的橙色-红色区域最好的选择。因为这些探针还是倾向于形成四聚体，所以他们不是标记蛋白质的最好选择。图5 另外有一些很有希望应用的红色荧光蛋白已经从珊瑚组织中分离出来。第一个适合哺乳动物的是从紫点海葵Heteractis crispa分离出来的HcRed1，已经商业化应用。HcRed1最初来自于一个通过突变改造可以吸收红光的非荧光生色蛋白，改造后可以产生微弱的荧光二聚体，最大吸收值在588nm，最大发射光为618nm。虽然这个蛋白的荧光发射谱可以与DsRed分开，但是它易于跟DsRed共凝集，亮度也不够。将两个分子纵列起来改造HcRed原则上可以克服二聚化，但是两个分子配对更易于产生单体标签。因为这两个蛋白的光亮度仍然没有提高，所以在常规活细胞观察中并不是一个很好的选择。荧光蛋白最有意思的开发之一就是这些探针作为分子或光学记号笔使用，它们在内部光子激发或者时间流逝时颜色改变或者发射光强度变化。举例来说，在原始的水母多肽序列的单点突变就产生了一个具有光活性的绿色荧光蛋白（PA-GFP），经过400nm范围的光照射后，它的激发峰值从紫外光变为蓝光。没有转变的PA-GFP的激发光峰值与野生型蛋白的相似（大约395-400nm）。光转化之后，激发光峰值在488nm，大约增加了100倍。PA-GFP的转化和未转化形式之间差异非常大，这样的变化在追踪细胞内分子的亚群动态过程非常有用。图6是一个含有PA-GFP转染的哺乳动物活细胞，首先用488nm氩离子激光照射后转化为405nm的蓝二极管激光照射。表二Properties of Selected Optical HighlightersProperties of Selected Optical HighlightersProtein (Acronym)Excitation Maximum (nm)Emission Maximum (nm)Molar Extinction Coefficient Quantum Yieldin vivo StructureRelative Brightness (% of EGFP)PA-GFP (G)50451717,4000.79Monomer41PS-CFP (C)40246834,0000.16Monomer16PS-CFP (G)49051127,0000.19Monomer15PA-mRFP1 (R)57860510,0000.08Monomer3CoralHue Kaede (G)50851898,8000.88Tetramer259CoralHue Kaede (R)57258060,4000.33Tetramer59wtKikGR (G)50751753,7000.70Tetramer112wtKikGR (R)58359335,1000.65Tetramer68mKikGR (G)50551549,0000.69Monomer101mKikGR (R)58059128,0000.63Monomer53dEosFP-Tandem (G)50651684,0000.66Monomer165dEosFP-Tandem (R)56958133,0000.60Monomer59mEos2FP (G)50651956,0000.84Monomer140mEos2FP (R)57358446,0000.66Monomer90Dendra2 (G)49050745,0000.50Monomer67Dendra2 (R)55357335,0000.55Monomer57CoralHue Dronpa (G)50351895,0000.85Monomer240Kindling (KFP1)58060059,0000.07Tetramer12Table 2图6 三、荧光蛋白载体构建和基因转入荧光蛋白的功能非常多，在从微生物学到系统生理学的整个生命科学领域中得到了成功的应用。这些独有的探针在培养的细胞核组织和活体动物中作为基因表达的报告基因得到了非常多的应用。在活细胞中，荧光蛋白是追踪蛋白质、组织和其他细胞成分定位和动态变化最常用的工具。已经有很多技术被开发出来用于构建荧光蛋白融合产物和提高他们在哺乳动物和其他系统中的表达。最主要的引入荧光蛋白方法就是将荧光蛋白的基因序列构建到细菌质粒和病毒载体中，然后转入细胞体内。荧光蛋白融合表达产物可以通过适当的载体瞬时或者稳定的转入到哺乳动物和其他细胞中。在瞬时转染中，基因转染实验（通常指的是瞬时转染），质粒或者病毒的DNA并不需要跟寄主组织的染色体整合，但是需要在一个短时期内在细胞质中表达。基因融合产物的表达情况可以很容易的通过检测荧光发射情况观察，一般在质粒DNA转染到哺乳动物细胞后72-96h后即可观察。在很多情况中，质粒DNA可以和基因组永久稳定的整合到一起。瞬时或者稳定转染主要依赖于所研究的目标生物的种类。图7 在荧光蛋白基因转移实验中的基本的质粒载体结构中有几个是必须具备的。质粒中必须含有编码细菌DNA复制起始原点的核苷酸序列和抗性基因。这些组成部分通常叫做穿梭序列，可以使质粒在细菌寄主中选择和繁殖，以产生用于哺乳动物转染的多种载体。除此之外，质粒还必须含有一个或多个真核的基因序列来控制mRNA转录起始，哺乳动物的多聚腺苷酸化信号，一个内含子（可选），和一个在哺乳动物细胞中共选择的基因。转录元件在哺乳动物寄主表达感兴趣的基因融合产物是必要的，选择性基因通常是抗生素抗性基因，是含有质粒的细胞可以再抗生素存在条件下生长。这些组成部分会根据质粒设计的不同而改变，很多载体有很多别的组成部分可以适用于特殊的用途。图7所展示的是一个商用的改造过的包括酶切位点和基因分布细菌质粒的图谱。这个质粒中包含有增强型黄色荧光蛋白的编码序列，它同内质网钙结合蛋白融合到一起（一个常驻蛋白）。这个基因在易感哺乳动物细胞中的表达产物和含有EYFP的嵌合肽定位在内质网膜上，专门用于这个组织的荧光标记。主载体是一个pUC的多拷贝（大约500）质粒改造的来的，它包含细菌的复制起点，可以在特定E. coli菌株的复制。卡那抗性基因可以在细菌中表达可以作为筛选标记。这个EYFP载体还包括人类巨细胞病毒的启动子（CMV）用于基因在人类和哺乳动物细胞中启动基因的表达，和一个f1噬菌体单链DNA产物的复制起点。载体的骨架还包括一个猴病毒（SV40）的复制起点，它在表达SV40的T抗原时有活性。抗生素G418用于筛选未定的转化子，它可以被新霉素抗性表达框（包括SV40的早期启动子，新霉素抗性基因和HSV-TK的多聚腺苷酸化信号）激活。6个单一的限制性酶切位点在图中标示出，可以使载体的用途更为广泛。荧光蛋白表达载体的繁殖，分离和转染成功的哺乳动物细胞转染实验依赖于高质量的细菌内毒素相对少的质粒或病毒DNA载体。在原始状态下，环形质粒DNA分子三级超螺旋结构。多年来，超螺旋质粒和病毒DNA的纯化主要是通过氯化铯密度梯度离心实现的。这个技术的设备和材料都很贵，根据浮力密度来将质粒（超螺旋）DNA从线性染色体和缺口的环状DNA中分离出来。近来，简化的离子交换柱吸附的方法（mini-prep）可以快速的提取出高质量的质粒DNA。特殊的细菌突变体，叫做感受态细胞，它已经用于质粒载体的扩增和繁殖中。此种细菌有很多突变体用于质粒的复制，通过化学渗透法将DNA通过细胞膜和细胞壁转入到细胞内，这一过程叫做转化。转化后，细菌在含有抗生素的培养条件下生长到对数生长期。细菌培养物离心收集，用含有RNA酶的碱裂解液裂解。裂解后加入中和液中和离心，再将上清液过离子交换柱，其他杂质如RNA，DNA和蛋白都被洗掉，溶解在高盐溶液中，然后用乙醇或异丙醇沉淀溶解的质粒