生猪肉中沙门氏菌的分离与鉴定.pdf

2 9 5 2 食品安全质量检测学报第7 卷 沙门氏菌在自然界分布广泛，可在人与人、人与动 物、动物和动物之间传播，其中有的专对人类致病，有的只 对动物致病，也有对人和动物都致病。人感染后会在其毒 素的作用下引发食物中毒，表现症状有恶心、呕吐、腹痛、 头痛和腹泻等，严重时会出现抽搐和昏迷等症状。对于老 人、儿童或体弱者如不及时救治也可导致死亡。食物传播 是引起人类沙门氏菌感染的主要途径，其中蛋、家禽和肉 类产品是它的主要传播媒介【2 ，3 】。据调查，美国在肉及其制 品中沙门氏菌的检出率为2 0 2 5 、英国为9 9 、我国 肉类的检出率为1 1 一3 9 5 。因此，对食品中沙门氏菌的 高效、准确检测，对及时了解本地区食品中沙门氏菌的污 染情况、有效管理食品的安全问题，保护消费者健康都具 有重要意义。 传统的沙门氏菌鉴定方法主要是根据菌株的形态学 特征、培养特征和生理生化特征进行，其特点是操作简单、 试验过程无需昂贵仪器、成本较低、结果容易判断，被广 泛应用于微生物菌株的分离与鉴定。但传统沙门氏菌的检 测全过程至少需3 5d ，且生化鉴定结果容易出现中间色， 造成判读误差，降低了鉴定结果的准确性和可靠性【4 5 】。目 前，应用较多的分子生物学鉴定是从菌株遗传进化的角度， 以基因序列为依据对菌株进行分离、鉴定。其中，1 6 Sr D N A 序列是细菌鉴定和系统分类研究中最常用的分子钟，针对 1 6 Sr D N A 的保守区进行引物设计可实现不同菌种间的分 离和鉴定，其鉴定结果较传统方法准确性大大提高，且鉴 定结果可重现【6 引。利用1 6 sr D N A 基因测序可将沙门氏菌 的检测周期缩短至2d ，提高了菌株的鉴定效率。但基因鉴 定过程需昂贵的试剂和仪器，成本较高。因此，菌株的分离 鉴定常将传统方法和分子生物学方法结合，在实现鉴定结 果准确性的同时降低试验成本。因此，本研究利用菌株培 养特征和生理生化鉴定试验对本地区采集的3 0 个样品进 行沙门氏菌的初筛，再对疑似菌株进一步进行1 6 sr D N A 基因测序，通过构建系统发育树确认该疑似菌株是否为沙 门氏菌，拟通过研究为丰富沙门氏菌数据库资料和流行病 学的研究提供一定的理论依据，为进一步对该地区肉及肉 制品中沙门氏菌的风险评估奠定基础。 2 材料与方法 2 1 样品的采集 在本地区分别选择两个最大的屠宰场、农贸市场和超 市，并对该地点的白条猪肉进行随机样品的采集，共获得 3 0 份样品。样品的来源和编号见表1 。 2 2 主要试验仪器 D H P 一9 2 7 2 型电热恒温培养箱( 上海一恒科技有限公 司) ；G e n e A m p P C RS y s t e m9 7 0 0P c R 扩增仪( 美国A B I 公 司) ；D Y Y - 1 0 c 型电泳仪( 北京市六一仪器厂) ；U v P 凝胶成 像系统( u v P 美国) 。 表1 采集样品的来源 1 a b I e1T h es o u r c eo ft h es a m p l e s 样品编号样品来源 分离自A 屠宰场不同白条猪肉样品 分离自B 屠宰场不同白条猪肉样品 分离自A 农贸市场不同白条猪肉样品 分离自B 农贸市场不同白条猪肉样品 分离自A 超市不同白条猪肉样品 分离自B 超市不同白条猪肉样品 2 3 主要试剂及制备 缓冲蛋白胨水( B P w ) ：称取蛋白胨1 0g ，N a c l5g ， N a 2 H P 0 4 1 2 H 2 09 Og ，K H 2 P 0 41 5g ，加蒸馏水1L ，混合 至完全溶解，1 2 1 灭菌1 5m in 后备用。 四硫磺酸钠亮绿( T T B ) 培养基：称取四硫磺酸钠亮绿 1 8 7 2g ，加蒸馏水2 0 0m L ，搅拌至完全溶解，1 2 l 灭菌 1 5m in 后备用。 沙门氏菌显色培养基：称取沙门氏菌显色琼脂3 4 5g ， 加1L 蒸馏水，1 2 1 灭菌1 5m in 后备用。 沙门氏菌生理生化鉴定试剂盒( 北京陆桥有限责任公 司) ；细菌基因组D N A 提取试剂盒( 北京天根生物技术有限 公司) ；T a q 连接酶( 北京天根生物技术有限公司) ；D L2 0 0 0 D N Am a r k e 利E 京天根生物技术有限公司) 。 2 4 试验方法 样品采集时，对于屠宰场多选择猪肉的边角料部分 或加工环境较差地方生产的猪肉，因为该部分容易引起沙 门氏菌的污染。而农贸市场和超市可随机对猪肉个体进行 选择。样品采集约5 0 0g 左右，采集后应迅速放人准备好的 无菌袋中，保存备用。 2 - 4 1 可疑菌株的分离 2 4 1 1 样品的处理 样品处理过程在超净台中进行，将采集的样品从无 菌袋中取出，用灭菌的剪刀进行剪碎后备用。 2 4 1 2 菌株的分离 ( 1 ) 在无菌条件下称取2 5g 绞碎后的样品，加入2 2 5 m L B P W ，3 7 培养1 0 h 进行前增菌。 ( 2 ) 无菌条件下用移液器吸取lm L 增菌液，接种于 T T B 液体培养基，3 7 、1 0h 进行选择性增菌培养。 ( 3 ) 无菌条件下用接种环蘸取选择性增菌液划线接种 于制备好的显色平板上，3 7 倒置培养2 4h 后，观察结果。 沙门氏菌在显色培养基上菌落呈( 浅) 紫红色，大肠杆菌和 大肠菌群显蓝绿色，其它细菌显黄色或无色。 2 4 2 生理生化鉴定 鉴定试验采用沙门氏菌生理生化鉴定试剂盒。首先从 显色平板上挑取可疑菌落，接种于2m L 无菌水试管，涡旋 ， 5 O 5 0 o 小 q 也 也 q ， 西 M n 拍 第7 期柴云雷，等：生猪肉中沙门氏菌的分离与鉴定 2 9 5 3 振荡制成0 5 个麦氏浊度的均匀菌悬液。然后按照试剂盒 说明书依次接菌进行生化鉴定试验( 包括三糖铁试验、吲哚 试验、V P 半固体琼脂试验、赖氨酸脱羧酶试验、尿素酶试 验、氰化钾试验、卫矛醇半固体试验和丙二酸盐试验) 。接 菌完毕后，将安瓿瓶用封口膜封好，3 7 培养2 4h 后对 试验结果进行判读。结果判定见下表2 。 2 4 31 6 Sr D N A 测定 ( 1 ) 基因组D N A 模板的制备 挑取可疑菌落接种子T T B 培养基，3 7 培养1 0h 后， 吸取1m L 的菌悬液，按照细菌基因组D N A 提取试剂盒使 用说明进行菌体基因组D N A 的提取，提取产物在1 的琼 脂糖凝胶上电泳检测，提取物在2 0 保存备用。 ( 2 ) 1 6 sr D N A 序列扩增 以提取的可疑菌落D N A 为模板，采用通用引物对其 1 6 sr D N A 序列进行P c R 扩增，通用引物的核苷酸序列为 2 7 f ( 5 一A G T C T C T G A T C A T G C C T C A G 3 ) 和 1 4 9 2 r ( 5 一A A G G A G G T G C T C C A G C C 一3 ) 。 P c R 扩增体系采用5 0 “L 。其中1 0 B u 虢r5 0p L ， d N T P ( 1 0m m o l L ) 2 0 此，正反向引物( 1 0 ”m o n ，) 分别为1 p L ，T a q 连接酶( 2 5u 肛L ) 1 p L ，D N A 模板( 约2 0 5 0n g ) 1 旺， 其余用无菌水补齐。P C R 扩增条件：9 5 5m in 预变性； 9 5 3 0s 变性，5 8 3 0s 退火，7 2 lm in 延伸，循环数 为3 0 个；7 2 5m in 终延伸，最后4 保存。 最后将P C R 扩增产物在1 的琼脂糖凝胶( 含E B ) 上进 行电泳检测，1 0 0 V 电压和1 0 0 A 电流电泳3 0 m in ，在凝胶 成像系统下观察，检测是否有扩增条带和条带大小，并将 P C R 产物保存于2 0 。 ( 3 ) 测序 将可疑菌株的1 6 sr D N AP c R 扩增产物和引物，送到 上海立菲生物技术有限公司进行双向测序。测序结果用 C 1 1 r o m a s1 4 5 软件进行查阅，并用D N A M A N5 2 9 软件对 双向测序结果进行剪切与拼接，最后将序列在N C B I 数据 库中进行B L A s T 序列比对，利用M E G A4 软件构建系统 发育树。 3 结果与分析 3 1 可疑菌株的分离及生理生化鉴定 利用T T B 选择性培养和显色培养基对3 0 个样品进行 筛选，发现分离自A 屠宰场的白条猪肉2 号样品培养菌落 为紫红色，疑似遭沙门氏菌感染。挑取可疑菌落接种于显 色培养基进一步纯化，培养结果如图l 所示。同时，对3 0 个检测样品均进行生理生化鉴定试验，其中对可疑菌株的 生化鉴定结果如图2 所示( 图中从左至右的反应依次为表2 结果判定表中的试验顺序) 。 图1可疑菌株的显色培养 F ig 1 C h r o m o g e n icc u l t u r ef o rs u s p ic io u ss t r a in 2 9 5 4 食品安全质量检测学报 第7 卷 吲2 生理，# 化鉴定结果 F 培2P h y s i0 1 0 9 ic a la n d b io c h e m ic a lid e n t m c a t io nr e s u l t s 由图1 可知，通过样品培养筛选的可疑菌株在显色培 养基上形成紫红色菌落，符合沙门氏菌菌落形态特征。由 图2 可知，根据表2 结果判定表依次判读，该反应结果符合 沙门氏菌生化鉴定试验现象。为进一步验证生化鉴定结果， 确认可疑菌株还需对其进行基因鉴定。 3 21 6 Sr D N A 序列测定 用试剂盒对可疑菌株的基因组D N A 进行提取，并对 提取后的D N A 进行1 6 sr D N A 序列扩增，D N A 提取结果和 扩增产物均用1 的琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结果 如图3 。 b p 2 0 0 0 1 0 0 0 图3可疑菌株基因组D N A 提取和1 6 sr D N AP c R 产物电泳图 F i23A g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s iso fg e n o m icD N Ae x t r a c t io na n d 1 6 Sr D N AP C Rp r o d u c t so fs u s p ic io u ss t r a in 注：M ：n 谢泔咖；l ：可霸射糟妪阳研蚺提晚2 ：1 6 sr D N A 扪静嘞 N 0 t e ：M ：m a r k e rD 2 0 0 0 ；l ：s u s p ic io u ss t r a ing e n o m icD N A e x 仃a c t io n ：2 ：1 6 Sr D N Aa m p l if ic a t io np r o d u c t s 由图可知，可疑菌株基因组D N A 提取效果良好，其 P C R 扩增产物的片段大小在1 5 0 0b p 左右，与预期片段大 小一致，且条带单一，可送去测序。 3 3 构建系统发育树 将可疑菌株的1 6 sr D N A 测序结果在N C B I 数据库中 经B L A S T 比对，结果显示与勋，m 伽8 ，肠的同源性达9 9 ， 因此可疑菌株被鉴定为沙门氏菌。从G e l l B a I l l 【数据库中获 取沙门氏菌属菌种及亚种的模式菌株【8 】。利用M E G A4 软 件按N e ig h b o r - J o in in g 构建系统发育树，结果如图4 所示： 叫 0 0 0 5 图4 根据1 6 sr D N A 序列构建的系统发育树 F ig 4 D e n d r o g r a mc o n s n l l c t e db a s e do nl6 Sr D N As e q u e n c e 第7 期柴云雷，等：生猪肉中沙门氏菌的分离与鉴定 2 9 5 5 由系统发育树可知，可疑菌株与肠道沙门氏菌 N 1 3 0 1 2 9 0 在同一系统发育分之下，并将两株菌株进行双 重序列分析比对，其同源性可达9 9 7 。结合分离菌株的 生理生化鉴定结果，证明该可疑菌株为肠道沙门氏茵。 4 讨论 细菌的分离和鉴定方法主要包括基于菌株特征代谢 反应的生理生化鉴定和利用分子生物学技术的基因鉴定。 这两种方法各有一定的优势，生化鉴定反应作为传统的鉴 定方法具有操作简单、成本低、结果容易判断等优势。基 因鉴定则具有鉴定周期短、鉴定结果准确可靠等优势。在 实际检验工作中，常将两种方法结合使用。在基因鉴定方 面，针对1 6 sr D N A 序列的分析是细菌系统鉴定和分类研 究中最常用的工具，原因是1 6 sr D N A 序列具有高度保守 的特性，在生物进化的过程中，保留了r D N A 结构和功能 的同源性。针对1 6 Sr D N A 的保守区进行引物设计可实现 不同菌种间的分离和鉴定，而对1 6 Sr D N A 的特异性区域 设计引物还可对同种菌株间进一步分型鉴定。本研究为节 约试验成本，故对采集的样品首先进行选择性培养、筛选 和生理生化鉴定。当出现可疑菌株，为进一步确认鉴定结 果，对其进行1 6 sr D N A 序列测定，保证鉴定结果的准确 可靠。由于国家规定猪肉中沙门氏菌不得检出，故本研究 仅对沙门氏菌1 6 Sr D N A 序列利用通用引物进行扩增测序， 若进一步鉴定该菌株的分类，可对1 6 Sr D N A 的特异性区 域扩增【9 】，或对沙门氏菌的加厦、 f 朋、廊柑和s 聊等特异 性靶基因扩增【l o 】。目前，该分离菌株已被中国工业微生物 菌种保藏管理中心( C I C C ) 收录，编号为2 1 4 9 6 。 该研究从本地区的6 个猪肉产地共收集3 0 个样品。 通过对这些样品的分离培养，生理生化鉴定和1 6 sr D N A 序列比对，共鉴定出l 株沙门氏菌。结果表明该地区生猪 肉中沙门氏菌的检出率为3 3 ，而国内肉类沙门氏菌的 检出率在1 1 3 9 5 ，说明该地区猪肉沙门氏菌的污染 率较低。但为防止污染的进一步扩大，仍需对该地区肉及 肉制品中的沙门氏菌进行风险评估，找出菌株污染源，从 而保证猪肉及其制品的质量安全。追溯样品来源可知，该 分离菌株来自于某屠宰场的2 号样品，表明屠宰场的污染 率要高于超市和农贸市场。分析原因是屠宰场的卫生条件 和操作环境比较差，更容易造成污染。因此加强对环境卫 生条件的控制可降低猪肉中沙门氏菌的污染率。另外，在 产业链中，猪肉是从屠宰场向农贸市场和超市传递，为保 证销售产品的质量安全，应加强屠宰猪肉的检验检疫，同 时政府和相关部门应加强对猪肉产业链的生产卫生监督， 确保卫生措施有效执行【l1 1 。 参考文献 1 】M iaT 1 jM a r i枷eN S ，D o n h eS ，甜口，G 锄o t y p icc h a r a c 劬恸io no f S a l m o n e u ab ym I l l 6 l o c 岫s 。q u e n c et y p in g ，p u l s e d f ie l dg e le l e c 廿( p h o r e s is 锄d 锄p l if ie d 曲舯e n tl g 山p o l y I n o r p h is m 【J 】JM ic r o b io lM e t l l ，2 0 0 5 ， 6 3 ：1 7 3 一1 8 4 2 王毳，闫磊，曾庆祝沙门氏茵的检测技术与方法 J 】现代食品科技， 2 0 0 7 ，2 3 ( 5 ) ：8 2 - 8 5 W 抽gC ，Y 缸L ，z gQ 乙S a l m o n e l l ad e t e c t io nt c c h n o l o g ya n dm e t h o d s J 】JM o d F o o dS c iT e c b n o l ，2 0 0 7 ，2 3 ( 5 ) ：8 2 8 5 3 】陆承平兽医微生物，第三版 M 】北京：中国农业出版社，2 0 0 l ， 2 2 3 2 3 1 L uC P l e r in a r ym ic r o b io l o g y ，t h ir de d ib o n M 】B e 妇in g ：C h i皿 A 酣c u J t mP T e s s ，2 0 0 1 ，2 2 3 - 2 3 1 4 】王高产，孙振均，沙门氏菌的检测方法 J 】猪业科学，2 0 0 9 ，( 1 2 ) ： 3 0 一3 1 w 抽gG c ，S mz J 勋b ，1 0 n e 妇d e t e 嘶o nm c 也0 d J 】JP 培I n dS c i，2 0 0 9 ， ( 1 2 ) ：3 0 一3 1 【5 】文均，任保国，李锦瑞聚合酶链反应快速鉴定沙门氏菌的研究 J 中 华流行病学杂质，1 9 9 5 ，1 6 ( 3 ) ：1 8 6 w J ，R e nB G ，“瓜P o l y 眦啪ec h a inr e a c h o nm p idid 曲c a t io no f s a l m n e l l as n J d y 【J 】JC h inE p id e I n io lI m p I l r it 1 9 9 5 ，( 3 ) ：1 8 6 6 】M a c m A n e l l s eo f l 6 Sr D N A m t h o d s 访s o iI I l l ic r o b 谢e c o l o g y m B r a 五U 蛆JM ic r o b io l ，2 0 0 0 ，31 ：7 7 8 2 【7 】G B4 7 8 9 4 2 0 1 0 ，食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验 s 】 G B4 7 8 9 42 0 l O ，F o o d h y g ieI I l ic r o b io l o g ic a lt e s t 妇加彻e 妇t c s t S 】 【8 马广强，杨少华，王宏梅，等通过1 6 sr D 州A 全序列分析及鉴定牛沙 门氏菌【J 】家畜生态学报，2 0 0 6 ，2 7 ( 6 ) ：1 3 7 一1 4 0 M a G Q ，Y 抽gS H ，w a n g I 蹦，甜，n u g h1 6sr D N A m us e q u e n c e 衄a l y s is 如did 6 f ic a t io no f 船h 伽P 砌 _ ，】JA n imE c o l ，2 0 0 6 ，2 7 ( 6 ) ： 1 3 7 1 4 0 【9 】杨捷琳，袁辰刚，顾鸣，等进出口食品及饲料中沙门氏菌硒b o t y p e