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各位老师好！,结直肠癌c-erbB-2、CD44v6及nm23表达与临床病理特征及预后的相关性研究,引言,肿瘤的复发和转移是当今肿瘤治疗最棘手的问题之一。据统计，有90%以上的癌症病人死于肿瘤的复发或转移。研究肿瘤细胞转移的分子基础及其与癌基因及抑癌基因的关系，已成为目前肿瘤防治研究的热点问题。真核细胞增殖调控是一个多因素、多环节、涉及到细胞内众多分子事件的复杂过程。在细胞增殖调控中，大多数癌基因是促进与发挥正调作用，而抑癌基因则是抑制与负调作用。它们在正常细胞中可能有调节细胞正常生长、抑制肿瘤形成的作用，它们的失活或缺失会导致细胞增殖失控或癌变。,癌基因c-erbB-2又称为neu或HER-2。c-erbB-2编码分子量为185ku的穿膜蛋白，与表皮生长因子受体（EGFR）同源，该蛋白可以抑制酪氨酸激酶活性，c-erbB-2过度表达和扩增可见于多种肿瘤。已有很多研究表明，乳腺癌c-erbB-2的高水平表达常常与较大的原发瘤体积、较多的腋下淋巴结转移及较差的内分泌治疗反应性有关，预示着更早、更多的术后复发及较短的生存期1，2。,粘附分子CD44是淋巴细胞的一种归巢受体，为高度异质性的单链跨膜糖蛋白，参与细胞与细胞间、细胞与基质间的粘连，有标准型（CD44s）和变异型（CD44V）两型。据报道，其变异体CD44v6过表达与结直肠癌的侵袭能力有关3，4。,核苷二磷酸激酶（NDPK/nm23）属NME基因家族，被认为参与了同恶性肿瘤转移相关的多种调节活动。nm23异常改变一方面可引起微管聚合而成的纺锤体异常，导致非整倍体形成；另一方面可通过细胞骨架及细胞素等信号反应性的改变引起细胞运动，从而参与侵袭和转移过程。研究发现啮齿动物实验性肿瘤的转移能力与nm23基因的表达呈密切负相关5，Bertheau等6在甲状腺恶性肿瘤中研究证实nm23及基因产物的表达与肿瘤的转移和预后相关密集，nm23的mRNA下调与肿瘤的淋巴结转移和低生存率有关。,结直肠癌（colorectalcarcinoma）是人类常见恶性肿瘤之一，对人类的健康构成了极大威胁。近年来对结直肠癌相关基因产物的检测已逐步和早期诊断、发病机制、病理特征、估计预后等密切联系起来，但研究结果不尽一致7-10。目前分子病理学研究认为，结直肠癌的发生是个多阶段、多因素作用的过程，主要是由于癌基因激活、抑癌基因及DNA修复基因突变或功能缺失所致。我们应用免疫组织化学方法同时检测结直肠癌中癌基因蛋白c-erbB-2、CD44v6及nm23的表达，并探讨其与病理特征和临床预后的相关性。,材料和方法,1.1材料1.1.1临床资料：92例结直肠癌：28例：有十年以上随访结果64例：无随访结果以上病例均为结直肠原发性腺癌，不含腺瘤癌变的病例，都只作了结直肠癌根治手术，未作化疗、放疗等辅助治疗。男性49例，女性43例，年龄2475岁（中位55岁）。结肠癌27例，直肠癌65例。根据国际抗癌联盟（UICC）的TNM分期标准11（见表1）作临床分期：期19例，期28例，期37例，期8例。,表1UICC结直肠癌TNM分期标准,A.TNM定义分期描述原发肿瘤（T）Tx原发肿瘤资料不详T0原发灶不能确定Tis原位癌T1肿瘤侵入粘膜下层T2肿瘤侵入肌层.T3肿瘤穿过肌层到浆膜下或至无腹膜的结肠周围或直肠周围组织T4肿瘤穿过脏层腹膜或直接侵入其它器官组织,表1UICC结直肠癌分期,A.TNM定义分期描述区域淋巴结（N）Nx区域淋巴结资料不详No无淋巴结转移N1肿瘤转移至13个结肠（直肠）周围淋巴结N2肿瘤转移至4个结肠（直肠）周围淋巴结N3肿瘤转移至主要血管沿途的任何淋巴结,表1UICC结直肠癌分期,A.TNM定义分期描述远处转移（M）Mx不能确定有无转移M0无远处转移M1有远处转移,表1UICC结直肠癌分期,B.分期标准,期别TNM0TisN0M0T1,T2N0M0T3,T400ny1,2,30nyny1,1.1.2病理资料：92例结直肠癌中，高分化腺癌16例，中分化腺癌45例，低分化腺癌21例，粘液腺癌10例。对全部病例观察了镜下肿瘤生长方式（推进式为主34例，图1；浸润性为主58例，图2）以及瘤周淋巴样细胞聚集情况（21例见有大量淋巴样细胞浸润，图3；71例无大量淋巴样细胞浸润，图2）。,1.1.3主要试剂及实验材料：c-erbB-2单克隆抗体（克隆系TAB250），工作浓度1：100；CD44v6单克隆抗体（克隆系2F10）,工作浓度1：100；nm23单克隆抗体（克隆系M-0421），工作浓度1：80。抗原修复液为0.01M、PH6.0枸橼酸盐缓冲液，DAB显色。以上试剂、二抗及SP试剂盒均为DAKO公司产品。免疫标记阳性对照组织来自乳腺癌、胃癌。,1.2方法1.2.1标本及玻片的处理：所有标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，34m连续切片。每例选取四张切片贴于经多聚赖氨酸处理的玻片上，70oC烘烤2小时，1张进行HE染色，其余3张进行免疫组织化学染色。,1.2.2HE染色：,主要步骤：石蜡切片脱蜡梯度乙醇水化苏木素染色盐酸乙醇分化返蓝伊红染色梯度乙醇脱水透明封固,1.2.3c-erbB-2、CD44v6及nm23免疫组织化学染色：,主要步骤：石腊切片脱蜡至水去内源性酶抗原修复（高压锅煮沸放气3分钟,nm23不需）一抗二抗SP复合物DAB显色水洗，苏木素复染，封片。,1.1.2.4免疫组织化学检测结果分析方法：c-erbB-2、CD44v6阳性定位在细胞膜出现棕黄色颗粒，nm23阳性定位在细胞浆出现棕黄色颗粒。着色细胞10%为阴性，10%为阳性。,1.2.5统计学处理方法：,运用Stata7.0统计软件（美国计算机资源中心研制）进行统计学处理。不同组间表达率的比较采用Fisher精确检验；对有随访结果的病例用Cox比例风险模型进行单因素和多因素生存分析，并对有预后意义的指标作出Kaplan-Meier生存曲线。,结果,2.1结直肠癌癌基因蛋白表达与临床病理参数的关系92例结直肠癌中，44例c-erbB-2阳性（图4、5），阳性率47.8%；51例CD44v6阳性（图6、7），阳性率55.4%；39例nm23阳性（图8、9），阳性率42.4%。c-erbB-2、CD44v6及nm23表达与组织分型、UICC分期、肿瘤生长方式及瘤周淋巴样细胞浸润的关系见表2。,表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系,NC-erbB-2阴性阳性阳性率%组织类型高分化腺癌1610637.5中分化腺癌45232248.9低分化腺癌2191257.1粘液腺癌106440.0p=0.658,表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系,NCD44V6阴性阳性阳性率%组织类型高分化腺癌168850.0中分化腺癌45212453.3低分化腺癌2171466.7粘液腺癌105550.0p=0.696,表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系,Nnm23阴性阳性阳性率%组织类型高分化腺癌169743.8中分化腺癌45271840.0低分化腺癌2113838.1粘液腺癌104660.0p=0.690,表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系,NC-erbB-2阴性阳性阳性率%UICC分期、期47311634.0期37152259.5期82675.0p=0.018*,表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系,NCD44V6阴性阳性阳性率%UICC分期、期47281940.4期37102773.0期83562.5p=0.009*,表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系,Nnm23阴性阳性阳性率%UICC分期、期47291838.3期37181951.4期86225.0p=0.300,表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系,NC-erbB-2阴性阳性阳性率%肿瘤生长方式推进式为主34211338.2浸润性为主58273153.4p=0.197,表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系,NCD44V6阴性阳性阳性率%肿瘤生长方式推进式为主34171750.0浸润性为主58243458.6p=0.516,表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系,Nnm23阴性阳性阳性率%肿瘤生长方式推进式为主34231132.4浸润性为主58302848.3p=0.190,表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系,NC-erbB-2阴性阳性阳性率%瘤周淋巴样细胞浸润有大量淋巴样细胞浸润2116523.8无大量淋巴样细胞浸润71323954.9p=0.014*,表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系,NCD44V6阴性阳性阳性率%瘤周淋巴样细胞浸润有大量淋巴样细胞浸润2113838.1无大量淋巴样细胞浸润71284360.6p=0.084,表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系,Nnm23阴性阳性阳性率%瘤周淋巴样细胞浸润有大量淋巴样细胞浸润21111047.6无大量淋巴样细胞浸润71422940.8p=0.622注：p为Fisher精确检验值*示P0.05*示P0.01,由表2可见，c-erbB-2表达与UICC分期及瘤周淋巴样细胞浸润有关（P0.05），而与组织分型及肿瘤生长方式无明显关系。CD44v6表达与UICC分期有关（P0.01），而与其余参数无关。nm23表达与上述各项参数间均无明显关系。,2.2结直肠癌的单因素和多因素生存关系分析随访十年以上的28例结直肠癌临床病理特征、癌基因蛋白表达与随访结果见表3。,表328例结直肠癌临床病理特征、癌基因蛋白表达与生存资料,生存时间（例）5年（%）510年（%）10年（%）组织类型高、中分化腺癌（20）3(15.0)10(50.0)7(35.0)低分化、粘液腺癌（8）6(75.0)2(25.0)0UICC分期、期（17）2(11.8)8(47.0)7(41.2)、期（11）7(63.6)4(36.4)0肿瘤生长方式推进式（10）2(20.0)3(30.0)5(50.0)浸润性（18）7(38.9)9(50.0)2(11.1),表328例结直肠癌临床病理特征、癌基因蛋白表达与生存资料,生存时间（例）5年（%）510年（%）10年（%）瘤周淋巴样细胞浸润有大量淋巴样细胞（6）02(33.3)4(66.7)无大量淋巴样细胞（229(40.9)10(45.5)3(13.6)c-erbB-2(16)2(12.5)7(43.75)7(43.75)(12)7(58.3)5(41.7)0CD44v6(14)4(28.6)3(21.4)7(50.0)(14)5(35.7)9(64.3)0nm23(15)7(46.7)7(46.7)1(6.6)(13)2(15.4)5(38.5)6(46.1),对表3进行单因素Cox模型分析，结果见表4。,表4.结直肠癌单因素生存分析(Cox比例风险模型)结果,风险比标准误z统计量P值95可信区间组织分型4.3164852.0702723.050.0021.68607511.05054UICC分期6.158393.0699483.650.0002.31816616.36025肿瘤生长方式3.2363921.6779922.270.0231.1714778.941054瘤周淋巴样细胞浸润5.9772814.4844262.380.0171.37370626.00839c-erbB-25.5192182.7565473.420.0012.07371414.68947CD44v62.5768881.2320541.980.0481.0095356.577633nm23.2552479.1230412-2.830.005.0992302.6565691,由表4可见，结直肠癌组织分型、UICC分期、肿瘤生长方式、瘤周大量淋巴样细胞浸润及c-erbB-2、CD44v6、nm23表达均与预后有关（P0.05）。,对表3进行多因素Cox模型分析结果见表5,表5.结直肠癌多因素生存分析(Cox比例风险模型)结果风险比标准误z统计量P值95可信区间UICC分期10.888776.412644.050.0003.43310934.53587c-erbB-25.7247493.2123253.110.0021.90599717.19454nm23.3072231.1580824-2.290.022.1120639.8422513,由表5可见，只有UICC分期、c-erbB-2和nm23表达具有独立的预后意义（P0.05），即UICC、期，c-erbB-2过表达及nm23表达减少与结直肠癌的不良预后有关（图1a-3a）。,讨论,31c-erbB-2的表达及其意义C-erbB-2癌基因位于17号染色体q21区带上，与表皮生长因子受体（EGFR）基因具有同源性，编码具有抑制酪氨酸激酶活性的穿膜蛋白（分子量185ku）。通过分析肿瘤细胞中c-erbB-2基因在DNA、mRNA或其产物的不同水平上质和量的变化与肿瘤侵袭转移表型之间的相关性，或通过基因转染使转染肿瘤细胞获得转移能力的实验，已证明该基因与一些肿瘤的进展和转移有关。,目前已有较多证据表明c-erbB-2基因过表达与乳腺癌的较差预后有关1，2，但有关该基因与结直肠癌关系的研究较少。Yamaguchi等12和Yang等13报道发生肝转移的结直肠癌c-erbB-2蛋白的阳性率显著高于无肝转移的结直肠癌。Nakae等14报道c-erbB-2蛋白的阳性率在DukesD期显著高于DukesA、B、C期。,本组92例结直肠癌免疫酶标结果显示，c-erbB-2阳性率与UICC分期呈正相关（P0.05）,与瘤周大量淋巴样细胞浸润呈负相关（P0.05）,但与组织类型及肿瘤生长方式无明显相关性(P0.05)13,15。对有10年以上随访资料的28例结直肠癌研究表明,c-erbB-2阴性者5年生存率(87.5%)明显高于c-erbB-2阳性者(41.7%,P0.05)，并且经作多因素Cox回归模型分析提示，c-erbB-2过表达与结直肠癌的不良预后有关。,32CD44v6的表达及其意义CD44是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白分子,主要参与细胞-细胞、细胞-基质之间的特异性粘附过程。人类CD44基因定位于11号染色体短臂，全长约50kb，共由20个高度保守的外显子组成。外显子按照转录方式不同可分为组成型外显子（c）和变异性拼接外显子(v)两大类,变异性拼接外显子共有10个,其中较为重要的第6位变异性拼接外显子(CD44v6)的过度转录已被发现与一些上皮性肿瘤的进展和转移有关。,有作者报道CD44v6过表达的结直肠癌易于转移3，4,还有作者报道CD44V6表达减少与结直肠癌的更强侵袭性和不良预后有关9，16，17，但Morrin等10和Jungling等18的最近报道认为CD44v6的表达与结直肠癌进展没有明显关系。本组92例结直肠癌进行CD44v6标记的阳性率与UICC分期之间具有相关性（P.01），即、期CD44v6阳性率明显高于、期，但期阳性率（73.0%）却高于期（62.5%）。此外，CD44v6表达与组织类型、肿瘤生长方式及瘤周淋巴样细胞浸润间无明显相关性。,在有10年以上随访资料的28例结直肠癌中，CD44v6的表达与10年生存率间无明显相关性。Weg-Remers等17及Chun等19的研究表明，CD44v6在正常结肠粘膜内很少表达，而在结直肠癌组织中的阳性率显著增高。因此，CD44基因可能只是在结直肠癌的肿瘤形成过程中发挥一定作用9,19。,33nm23的表达及其意义人类nm23基因定位于17号染色体长臂（17q21），该基因全长8.5Kb，由5个外显子及4个内含子组成，编码蛋白质分子量约17000（17KDa）。nm23基因产物NDPK与微管聚集、G蛋白信号传递、细胞与周围组织粘附力、完整的基底膜形成及转录调节等有关20，21。现已发现nm23基因主要有H1、H2两种类型，多数研究认为H1亚型与肿瘤转移的关系最密切。在人类肿瘤中，该基因的改变有基因丢失、突变、表达异常22.,起初，人们通过动物实验发现nm23基因具有抑制肿瘤转移的作用，以后不少研究报道结直肠癌中nm23表达减少与肿瘤晚期及远处转移有关23-25，并且Tannapfel等26研究认为nm23表达减少可作为评价结直肠癌具有淋巴结转移潜能的一项独立指标。Cheah等27报道nm23表达与结直肠癌临床分期呈反比（分期越晚，表达越少），但与性别、年龄、肿瘤分化程度及5年生存率等无明显关系。,最近，Katakura等28报道nm23表达可作为预测非小细胞肺癌良好预后的一项独立指标，但Forte等29认为nm23尚不能作为结直肠癌的一项独立预后指标。本组92例结直肠癌的nm23表达与组织类型、UICC分期、肿瘤生长方式及瘤周淋巴样细胞浸润均无明显相关性，但经对有随访结果的结直肠癌中nm23表达作多因素Cox回归模型分析提示，nm23阴性病例预示更差的预后。因而我们赞同nm23基因具有抗肿瘤转移的潜能28，认为nm23表达减少预示结直肠癌更强的侵袭性和易于转移扩散。,34其它临床病理因素341UICC分期：本研究发现该分期与C-erbB-2、CD44v6的表达具有明显相关性，提示c-erbB-2、CD44v6癌基因过表达的结直肠癌可能具有更强的侵袭性。通过对有随访资料的结直肠癌UICC分期作多因素Cox回归模型分析证实，该分期具有显著独立的预后意义18，29。342组织类型：本研究发现组织类型与C-erbB-2、CD44v6及nm23基因蛋白表达无明显相关性13，18，27。虽然单因素Cox模型分析显示低分化腺癌、粘液腺癌的预后明显差于高、中分化腺癌30，但经作多因素Cox模型分析发现组织类型不能作为独立的预后指标31。,343肿瘤生长方式：近年研究认为结直肠癌肿瘤的推挤式（膨胀性）生长比浸润性生长的预后好31,32。并且Jass等33提出的结直肠癌分期方法中将肿瘤生长方式作为预后的重要指标之一。本组研究显示，结直肠癌肿瘤生长方式与C-erbB-2、CD44v6及nm23的表