血液样本采集和血涂片制备PPT医学课件.pptx

,血液标本采集和血涂片制备,（一）血液的组成血液由（红细胞、白细胞、血小板）和血浆组成血浆：血液加抗凝剂后分离出的淡黄色液体血清：离体后的血液自然凝固析出的淡黄色透明液体血浆与血清的区别：血清缺少某些凝血因子，如：凝血因子（纤维蛋白原）、（凝血酶原）、等。,一、血液生理概要,（二）血液的理化性质血量：成人约4-5L，约占体重的6%-8%，血浆占55%，血细胞45%颜色：红色，动脉呈鲜红色，静脉血呈暗红色。严重贫血者红色变浅。一氧化碳或氰化物中毒者血液呈樱红色酸碱度：成人PH7.37.45，动脉血PH7.40静脉血pH7.35比密和渗透量：男性约1.0551.063，女性约1.0511.060相对粘度为45；血浆比密约1.0251.030。血液比密与红细胞含量、红细胞内血红蛋白含量有关血浆比密与血浆内血红蛋白有关。血浆渗透量:约290310mOsmkgHO,(三)血液特性悬浮稳定性红细胞在血浆中的悬浮稳定性均匀混悬状态粘滞性全血粘度为生理盐水的45倍，血浆粘度为生理盐水的1.6倍左右凝固性血液从血管中流出可自行凝固（四）血液生理功能运输功能协调功能维护机体内环境稳定防御功能,二、采血方法,（一）静脉采血法1、采血部位：肘部静脉、手背静脉、内踝静脉或股静脉小儿可采颈外静脉血液,2、操作方法：准备试管检查注射器选择静脉消毒扎压脉带穿刺抽血放血与混匀,3、注意事项：（1）采血前应向患者耐心解释，以消除疑虑和恐惧心理（2）所用针头应锐利、光滑、通气、针筒不漏气若静脉暴露不明显，可用左手食指消毒后，触摸采血部位，发现静脉后凭手感的方向性穿刺（3）抽血时只能往外抽，不能往里推,（二）皮肤采血法：1、概述：又称为毛细血管采血法，是采集微动脉、微静脉和毛细血管的混合血，同时含细胞间质和细胞内液。采血部位：世界卫生组织（WHO）推荐采集左手无名指指端内侧血液，婴幼儿可采集大踇趾或足跟内侧缘血液，严重烧伤患者，可选择皮肤完整处采血。目前可用激光无痛采指血仪采血。,2、操作方法：准备取合适试管，加适量稀释液取微量试管与乳胶吸头相连并检查是否漏气，或取一次性微量采血管按摩按摩左手中指或无名指指端内侧，使局部组织充血消毒用75%的乙醇棉签擦拭采血部位，待干,针刺左手捏紧采血指端，右手持一次性消毒采血针自指端腹内刺入，深度23mm拭血血液流出后，用无菌棉球擦去第一滴血吸血用一次性微量吸管吸血，止血。若血流不畅，可用左手自采血部位远端向指端施压使血液流出,稀释用无菌干棉球擦去吸管外部血液，将吸管伸入装有稀释液的试管底部，慢慢排试管内的出血液，并用上清液清洗管内余血23次，最后将试管内的血液混匀,3、注意事项（1）所选采血部位皮肤应完整，无烧伤、冻疮、发绀水肿或炎症，除特殊情况外，不要耳垂采血（2）应严格无菌操作，防止采血部位感染，做到一人一针一管，避免交叉感染。（3）消毒后，待乙醇挥发后采血，否则流血不易成滴（4）因第一滴血混有组织液，应擦去，应向结果的准确性,（三）真空采血法：真空采血装置有套筒式、头皮静脉式两种。封闭式采血避免了容器之间的转移，减少溶血现象，能有效保护血液有形成分，保证待检样本原始性状的完整性，是检验结果更可靠。能有效避免医护人员与患者之间的交叉感染。各种真空采血容器根据需要标有不同的色码，适用于不同检验项目（表1-1-1）。,（四）方法学评价1、皮肤采血法：缺点易溶血、凝血、混入组织液，局部皮肤揉擦、刺针深度不一等影响检验结果；结果重复性差、准确性不好2、静脉采血法：开放式采血法，操作环节多、难于规范、易造成血液污染；封闭式采血法，操作规范，利于样本运送和保存，防止院内血源性传染病。,（五）质量控制1、患者患者活动情况、精神状态、药物等会影响检测结果2、采血止血带结扎应1min3、溶血容器不洁净、剧烈震荡、操作不当引起溶血使血细胞计数、血浆、血清化学成分改变等多项指标检验结果发生变化,4、样本处理采血后立即送检，标本保存不当直接影响检验结果5、实验结果分析应考虑药物、饮食等因数对结果的影响，同时密切结合临床,三、抗凝剂的选择,抗凝：是用物理或化学的方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固。抗凝剂或抗凝物质：能够阻止血液凝固的物质常用的抗凝物质如下：,1、乙二胺四乙酸（EDTA）盐钠盐（EDTANaHO）钾盐（EDTAKHO），能与血液中的钙离子结合成螯合物，使钙离子失去凝血作用，阻止血液凝固。其有效抗凝浓度为12mg/ml血液。血细胞分析仪用EDTA-K2作抗凝剂，用量为EDTA-K22H2O1.52.2mg/ml血液,2、草酸盐草酸根离子能与样本中的钙离子形成草酸钙沉淀，使钙离子失去作用，阻止血液凝固。草酸盐：溶解度好、廉价，但对凝血因子的保护作用差，影响凝血酶原时间测定，因此草酸盐不适用于凝血检查。,3、草酸盐双草酸盐：不影响红细胞形态和体积，可用于血细胞比容、红细胞计数、网织红细胞计数可使血小板聚集、影响白细胞形态，不适用于血小板计数、白细胞分类数,4、肝素加强抗凝血酶（AT）灭活丝氨酸蛋白酶，阻止凝血酶的形成，并阻止血小板聚集等作用，从而阻止血液凝固。肝素具有抗凝力强、不影响红细胞体积、不易溶血等优点，绝大都数检查都可用肝素做抗凝剂，是红细胞渗透脆性试验的的理想抗凝剂。可影起白细胞聚集瑞，氏染色后产生蓝色背景，不适用于CBC、细胞形态学检查,5、枸橼酸盐常用有枸橼酸钠，能与血液中的钙离子结合形成螯合物，阻止血液凝固。应用范围：血沉、凝血象、血小板功能检查及血液保养液。凝血:109mmol/L水溶液,与血液之比为1:9；血沉:106mmol/L水溶液,与血液之比为1:4。,四、血液涂片制备,（一）载玻片的清洁1.新玻片1mol/LHCl泡24小时水洗干燥。2.旧载玻片肥皂水或其他合成洗涤剂水中煮沸20分钟热水洗自来水洗干燥。(95%乙醇泡1小时蒸馏水洗干后备用)。,（二）血涂片的制备,方法1.取血滴。2.散开血滴。3.推片。4.干燥,1、手工推片法：取血液一滴，置于载玻片一端以边缘平滑的推片（推片两端应平整光滑，比载玻片稍窄或磨去两角）的一端，放在血滴前方，逐渐后移接触血滴，血液立即沿推片散开。,1、手工推片法：,将推片与载片保持30-45夹角，平稳向前推进至载玻片的另一端，残片上即留下一薄层血膜。,1、手工推片法：血膜的影响因素1.血滴大小、2.推片与载玻片之间的角度、3.推片时的速度有关。血滴愈大、角度愈大、推片时速度愈快，则血膜愈厚；反之血膜愈薄。,2、厚血膜涂片法载玻片中央置血1滴镜检用推片角将血由内向外旋染色转涂成厚薄均匀、直径约1.5cm的圆形血膜待干待干加蒸馏水使红细胞溶解待干镜,一张良好的血涂片的要求厚薄适宜头体尾分明细胞分布均匀血膜边缘整齐，并留有一定空隙,五、血液细胞染色,（一）瑞氏染色法瑞氏染液是有酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料溶于甲醇而成。甲醇的作用：溶解亚甲蓝和伊红固定细胞形态,1、染色原理,伊红系不易解离的弱酸性染料，通常用伊红钠盐（+），其有色部分是伊红，为阴离子，所以伊红是酸性染料。,1、染色原理,【原理】美蓝又名亚甲蓝，为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构，通常为氯盐，即氯化美蓝（+-）。其有色部分是美蓝，为阳离子，所以是一种碱性染料。,1、染色原理,【原理】细胞的受色既有化学亲和作用，也有物理吸附作用。细胞中的嗜酸性物质（如血红蛋白、嗜酸性颗粒）易与酸性染料伊红结合，染成粉红色；细胞中的嗜碱性物质（如核染色质、嗜碱性颗粒）易与碱性染料美蓝或天青结合，染成蓝色；中性颗粒呈等电状态，与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色。,2、PH对细胞染色的影响1.在酸性环境中，染色偏红；2.在碱性环境中,染色偏蓝。染色时应用pH6.46.8的缓冲液维持恒定的酸碱环境。,3、试剂调配（1）液：瑞氏染料1.0g、纯甲醇（AR级以上）600ml、甘油15ml。染料放入清洁干燥的乳钵中，加入少量甲醇慢研30min以上，将充分溶解的染料后倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止，最后加入15ml甘油，密封保存。,试剂调配（2）夜：磷酸盐缓冲液（PH6.46.8）由磷酸二氢钾（KHPO）0.3g、磷酸氢二钠（NaHPO）0.2g、蒸馏水加至1000lm。配好后用磷酸盐溶液矫正pH，塞紧瓶口保存。,4、染色方法采血在距离载玻片一端1cm处加血液1滴血液。推片左手拿载玻片，右手持推片，制成舌状、头、体、尾分明的血涂片。干燥在空气中晃动，使其快速干燥，天气寒冷或潮湿时，可置37温箱中保温促干。标记在载玻片一端做好标记。,4、染色方法染色将血涂片平置于染色架上，滴加夜35滴使其迅速盖满血涂片，约0.51min后，滴加等量或稍多的夜，用吸球吹气，使染料充分混合。冲洗510min后用流水洗去染液，待干镜检。,5、注意事项（1）血涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。（2）加染料应适量，过少易蒸发形成沉淀，使细胞不易检查。（3）不能先倒染料，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过长，以防脱色。（4）染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，后加染液。,（二）吉姆萨染色法1、染色原理吉姆萨染液由天青、伊红组成。染色原理和结果与瑞氏染色基本相同,2、试剂配制吉姆萨染料1.0g、甘油66ml、甲醇66ml。将染料倒入盛有66ml甘油的圆锥烧瓶内，在56水浴锅上加热90120min，使染料与甘油充分溶解然后加入60预热甲醇，充分摇匀后置棕色瓶中，在室温下放置7天，过滤后使用。,3、染色方法采血在距离载玻片一端1cm处加血液1滴血液。推片左手拿载玻片，右手持推片，制成舌状、头、体、尾分明的血涂片。干燥在空气中晃动，使其快速干燥，天气寒冷或潮湿时，可置37温箱中保温促干。标记在载玻片一端做好标记。,3、染色方法固定将干燥血涂片用甲醇固定35min。染色将血涂片置于磷酸盐缓冲液（PH6.46.8）稀释1020倍的吉姆萨染料中，浸泡1030min。冲洗取出用流水冲洗，待干镜检。,六、方法学评价,（一）血涂片制备手工推片法，用血量少、操作简