球孢白僵菌蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶活性与其毒力相关性

2 4 ( 3 ) 2 9 0 2 9 2 中国生物 防治C h i n e s e J o u r n a l o f B i o l o g i c a l C o n t r o l 2 0 0 8 年 8月 球孢 白僵菌蛋 白酶、 几 丁质酶、 脂肪酶活性与其毒力相关性 林 海萍 ，魏锦瑜 ，毛胜凤 ，陈 喜 ，张立钦 ，马 良进 ( 1 南京林业大学森林资源 与环境学院 ， 南京 2 1 0 0 3 7 ； 2 浙江林学院林业与生物技术学 院，临安 3 1 1 3 0 0 ) Co r r e l a ti o n Be t we e n Pr o t e a s e，Ch i t i n a s e a n d Li p a s e Ac tiv i ti e s a n d Vi r u l e nc e o f Be a u v e r i a b a s s i a n a a g a i n s t M o n o c h a mu s a l t e r n a t u s L I N H a 1 p i n g ， ，WE I J i n y u ，MA O S h e n g f e n g 2 ，C HE N X i ，Z H AN G L i q i n ，MA L i a n g - j i n ( 1 C o U e g e o f F o r e s t R e s o u r c e s a n d E n v i r o n m e n t ， N a n j i n g F o r e s t r y u n i v e r s i t y ， N a n j i n g 2 1 0 0 3 7 ， C h i n a ； 2 S c h o o l o f F o r e s t r y a n d Bi o t e c h n o l o g y ，Z h e j i a n g F o r e s t r y Un i v e r s i t y ，L i n a n 3 1 1 3 0 0，C h i n a ) 关 键 词：球孢 白僵菌；蛋 白酶；几丁质酶；脂肪酶 ；毒力 中图分类号：$ 4 7 6 1 3 文献标识码 ： A 文章编号 ：1 0 0 5 9 2 6 1 ( 2 0 0 8 ) 0 3 0 2 9 0 0 3 松墨天 牛 ( Mo n o c h a m u s a l t e r n a t u s H o p e ) ， 又名 松 褐天 牛 ， 是 我 国松 林 目前 最 重要 的 害虫 ， 也 是传播毁灭性病害病原线虫松材线虫( B u r s a p h e l e n c h u s x y l o p h i l u s N i c k l e ) 的媒介 昆虫 ， 是松材线 虫病新 疫点 的最 重要成 因之 一 ， 因此大 力防 治松 墨天 牛是保 护我 国松林 的关 键 _ l I 2 。 球 孢 白僵菌 ( B e a u v e r i a b a s s i a n a ) 是 一类广 谱 性 昆虫 病原 真菌 ， 能 侵染 1 5个 目 1 4 9个科 7 0 0 多种 昆虫 _ 3 j ， 对 环境和 温血 动物无 害 ， 易 于培 养 ， 致 病性 强 ， 已成 为国 内应用 最广 泛 的昆虫病 原 真 菌 。 目前 已有 大量 的报道证 明球 孢 白僵菌 防治 松墨天 牛完 全 可行 _ 4 6 3 。 国 内外均 有研 究 发 现球孢 白僵菌蛋 白酶、 几丁质酶、 脂肪酶 、 淀粉酶等产生水平与其菌株毒力之 间存在一定 的相 关性 。 。但球孢 白僵菌酶活性与其对松墨天牛毒力相关性 尚未见报道。本文研究球孢 白 僵 菌 蛋 白酶 、 几丁 质酶 、 脂肪酶 活性 ， 以及 与菌株 对 松墨 天牛 毒力 的相关 性 ， 以找 出球 孢 白僵 菌 菌 株 的毒力 表达 因子 ， 从 而 为 白僵 菌防 治松墨 天 牛提供 理论 依据 与实用 技术 。 1 材料和方法 1 1 供试昆虫与菌株采 白浙江余杭的松墨天牛幼虫 ， 实验室人工培养至 4龄幼虫作为供试 昆虫。1 5个球孢白僵菌供试菌株( 表 1 ) 接种到 P P D A斜 面培养基上 ， 2 7 下培养 1 2 d ， 收集孢 子 配制 成浓 度为 1 1 0 个 m l 的孢 子悬 浮液 。 1 2 培 养基 蛋 白酶 诱 导 培 养基 ：1 明 胶 ( m V) ， K 2 H P 0 4 、 N a C 1 和 M g S 04 7 H 2 O各 0 3 g L 。 各 组分 溶入 p H 7 0的 0 0 2 m o l L磷 酸缓 冲 液 。几 丁 质 酶诱 导培 养 基 ：蛋 白胨 0 5 ， K H 2 P 04 、 K C 1 、 M g s o 4 7 H ， 0各 0 0 5 ， Z n S 04 7 H 2 O 0 1 ， 脱矿几丁质 1 ， p H 6 0 。S D A培养基 ： 葡萄糖 4 0 g L 、 蛋 白胨 1 0 g L 、 酵母浸 膏 1 0 g L 。P P D A培养基 见参 考 文献 _ o 。 收稿 日期：2 0 0 7 1 0 1 8 基金项 目：国家 自然科学基金项 目( 3 0 2 4 0 0 7 0 ) 作者 简介 ：林海萍( 1 9 7 3) ， 女 ， 博士生， 副教授 。 2 90 维普资讯 第 3期 林海萍等 ： 球孢 白僵 菌蛋 白酶 、 几丁质酶 、 脂肪酶活性与其毒力相关性 表 1 球孢 白僵菌菌株来源 菌株 寄主 采集地 形式 菌株 寄 主 采集地 形式 B 4 ， B 5 ， B 7 - B l 2 ， B l4 ， B l 5 松墨天牛 江苏 自然感 染 B 生产菌株福建 白僵菌厂菌粉中分离 B 6 松墨天牛P P D A培养基 B 5 的分离子株 B 生产 菌株 浙 江白僵菌厂菌粉中分离 B 松墨天牛 浙江象山 自然感染 B 松墨 天牛 浙江余杭 自然感染 1 3 不同菌株蛋白酶活性测定采用 F o l i n 一 酚法一 ， 将孢子悬液按 1 的量( 体积分数 ， 下同) 接种 到蛋 白酶诱 导 培养 基 中 ， 2 5 、 1 5 0 r m i n旋 转 式 摇 床培 养 5 d ， 滤 纸 过 滤 ， 所 得 滤 液 即为 酶 液 。将 2 酪蛋 白 l m l 加 到 l m l 酶液 中 ， 4 0 C反应 1 0 m i n ， 加 2 m l 0 4 m o l L三 氯 醋酸溶 液 中止反 应 ， 保 温 至完 全沉 淀 。过滤 后用 F o l i n试剂 检 测 ， 以每 分钟 催 化 分解 生 成 1 g 酪 蛋 白的 酶量 为 一 个活性 单 位 ( U m 1 ) 。重复 3次 。 1 4 不同菌株几丁质酶活性测定采用 D N S 法 ， 将孢子悬液按 1 的量接入几丁质酶诱导 培养基中， 2 7 、 2 0 0 r m i n旋转式摇床培养 7 d ， 滤纸过滤 ， 所得滤液 即为酶液。在 1 O m l 胶体几 丁 质 中 ， 加入 酶液 0 5 m l ， 5 0 反应 1 h ， 用 D N S法 测定 产生 的还 原糖 。 以每分 钟产 生相 当于 1 g N A G ( J3 一 N 一 乙酰葡糖 苷 ) 所需 的酶 量定 义为 一个 酶活 力单 位 ( u m 1 ) 。重 复 3次 。 1 5 不同菌株脂肪酶活性测定参照姚剑等_ l 0 _ 方法 ， 将孢子悬液按 1 的量接入 S D A培养基 中 ， 2 5 、 1 5 0 r m i n旋转 式摇 床培 养 5 d ， 滤 纸过 滤 ， 滤 液用 来测 定脂 肪 酶活性 。以橄 榄 油 4 m l 为 底物， 加入 l m l 酶液 ， 4 0 C， 精确保 温 3 0 m i n ， 用酸碱滴定法测定催化产生的脂肪酸。以每分钟 水解产生 1 0 m o l 脂肪酸的酶量定为一个脂肪酶单位 ( u m1 ) 。重复 3次。 1 6 不同菌株对松墨天牛的毒力测定采用浸渍法接种E J ： 将试虫头朝上 ， 把胸部以下部分 浸 于 1 1 0 个 m l 孢 子悬 浮液 中 3 s 进行 接 种 ， 每 管 1头置 于 小试 管 中 2 5 继 续 培 养 ， 对 照组 浸 无菌水 。每 处理 3 0头 松 墨天牛 ， 3 个 重 复 。记 录松墨 天牛 幼虫死 亡情 况 ， 每 隔 1 d观察一 次 ， 连续 观察 1 6 d 。 2 结果与分析 由表 2可 知 ， 1 5个不 同菌 株 的蛋 白酶 、 几 丁质 酶 、 脂 肪 酶活性 存 在较 大差 异 。 表 2 1 5个菌株球孢白僵菌蛋白酶 、 几丁质酶 、 脂肪酶活性与对松墨天牛的校正死亡率 ( 1 6 d ) 菌株蛋白 ( U n il 酶 ) 几 丁 ( U 麟m1 ) 菌株(蛋白 Um 酶 1 ) 几丁 ( U 质酶 m i ) 篙 B d 5l 4 2 00 7 4 7 5 O 3 3 62 I l 3 l 0 0 0 60 2 2 5 8 5 62 0 BI 2 5 8 7 6 40 6 8 3 5 2 6 4 4 1 8 4 4 6 3 2 50 1 2 0 9 4 42 0 B 6 7 5 0 3 1 3 7 7 5 8 11 2 1 6 8 0 1 1 2 5 60 3 6 7 1 0 0 00 0 B1 4 4 9 3 4 8 1 8 4 9 5 3 6 91 1 3 11 1 0 5 6 30 23 6 9 5 62 0 B 6 4 5 1 1 02 0 6 2 4 5 6 3 6 1 3 3 0 9 6 9 40 4 7 3 6 4 42 0 B I 5 6 5 8 2 1 2 2 0 6 4 4 2 3 81 2 8 2 7 4 3 20 、 2 0 8 6 8 9 1 9 B 7 4 7 4 7 02 1 9 9 51 1 2 0 1 1 3 2 7 6 82 0 1 31 8 3 30 0 B 6 8 2 2 8 1 1 0 4 5 4 3 6 7 1 91 6 1 2 3 6 90 3 2l 1 0 0 00 0 B 6 7 2 4 82 51 2 51 26 5 1 1 5 6 9 5 3 60 1 9 9 91 1 2 0 B f 4 5 3 8 9 1 32 5 4 4 2 8 6 1 1 63 5 0 3 20 l 7 3 6 7 8 1 9 6 4 31 7 1 03 9 5 6 3 28 1 o 0 2 l 2 9 9 20 4 63 1 0 0 00 0 B 4 0 1 7 4 1 49 0 38 2 5 3 1 3 8 4 5 0 0 60 1 97 4 7 8 z t：1 9 Bl o 5 O 6 0 3 1 8 3 3 4 8 69 4 1 3 0 2 9 9 4 0 0 2 5 9 8 4 4 2 0 B y 2 4 9 6 8 00 90 6 6 0 0 2 3 1 1 72 1 1 2 6 40 3 5 2 1 0 0 00 0 BI 1 4 6 3 5 42 2 0 6 41 38 3 0 8 9 9 4、 3 6 901 6 7 5 7 8 1 9 分别 进行 相关性 分析 ， 结果 表 明 ： 校 正死 亡率 ( 1 ， ) 与蛋 白酶 活性 ( 1 ) 问呈 直线 相关 ：Y：1 1 0 8 6 Xl + 2 2 3 2 6 ( 相关 性 系数 尺 l = 0 6 2 6 1 R o 。 l = 0 6 0 5 5 ) 。说 明球 孢 白僵 菌 1 5个 菌 株 的 蛋 白酶 活 性 与对 松 墨 天 牛毒 力 间 呈 正相关 ， 相 关性极 显 著 。 校 正死 亡 率 ( 1 ， ) 与几 丁质 酶活性 ( X 2 ) 间 呈直 线 相 关 ：Y=2 6 5 8 6 X 2 5 0 2 5 9 ( 相关 性 系数 2 91 维普资讯 中 国 生 物 防 治 第 2 4 卷 R z =0 9 6 3 8 R 0 _ ( ) l = 0 6 0 5 5 ) 。表明球 孢 白僵 菌 1 5 个 菌 株 的几 丁质 酶 活性 与 对松 墨 天 牛毒 力 间呈 正相 关 ， 相 关性 极显 著 。 校正死亡率 ( 1 ， ) 与脂肪酶活性( X ) 间呈直线相关 ：l ， =4 9 1 3 3 +3 9 0 2 3 ( 相关性系数 = 0 7 8 7 0 R 0 0 = 0 6 0 5 5 ) 。表 明球 孢 白僵菌 1 5个 菌 株 的脂 肪 酶活 性 与对 松 墨天 牛毒 力 间呈 正相关 ， 相 关性极 显 著 。 3讨论 球 孢 白僵菌 1 5 个 菌 株 的蛋 白酶 、 几 丁质 酶 、 脂 肪 酶 活性 与 对松 墨 天 牛毒 力 间呈极 显 著正 相关 ， 即蛋 白酶 、 几丁质酶 、 脂肪酶活性越高的菌株毒力亦越强。因此， 可认为球孢白僵菌蛋 白 酶、 几丁质酶、 脂肪酶活性是构成其对松墨天牛毒力 的一个主要内在因素。可以考虑以酶活性 指示其对松墨天牛毒力的大小 ， 此法简便易行 ， 克服了耗 时费工的生物测定方法的弊病 ， 为菌 株毒力 比较 与高 毒优 良菌 株筛 选提 供 了方 便 。 同时 ， 也 为 白僵菌 菌剂标 准化提 供 了解 决途径 。 球孢 白僵菌蛋 白酶 、 几丁质酶 、 脂肪酶可能对 白僵菌侵染寄主的机制有影响。球孢 白僵菌 对寄主的侵染与其他虫生真菌一样 ， 一般可分几个阶段 ， 包括孢子的萌发、 附着 、 入侵和定殖， 而入侵 是 至为关 键 的一步 l l O l 。孢子 在萌 发 和入侵 时 ， 要产生 蛋 白酶 、 几 丁质酶 、 脂 肪酶来 溶 解 昆虫表皮 ， 以完成侵染l 】 。根据 昆虫表皮 的结构 ， 蛋 白质、 几丁质与脂肪均为 主要成分 ， 酶的 作用不仅消除了孢子入侵的屏障 ， 而且可能给真菌提供营养。 参 考 文 献 1 张心团 ， 赵 和平 ，樊美珍 ， 等 松墨天牛生物学特性的研究 进展( 综述 ) J 安徽农 业大学学报 。 2 0 0 4 ，3 1 ( 2 ) ：1 5 6 1 5 7 2 R o q u e s A，S u n J H， A u g e r r o z e n b e r g A N， e t a 1 P o t e n t i a l i n v a s i o n o f C h i n a b y e x o t i c i n s d p e s t s a s s 0 c i a t e d w i t h t r e e s e e d s J B i o d i v e r s i ty a n d C o n v e r s a t i o n，2 0 0 3，1 2：2 1 9 52 2 1 0 3 S t L e g e r R J ， S c r e e n S P r o s p e c t s f o r s t r a i n i m p r o v e m e n t o f f u n g a l p a t h o g e n s of i n s e c t s a n d w e e d s A I n ：F u n g a l a s B i o c o n t r o l A- g e n t s C U K：C A B I P u b l i s h H o u s e ，2 0 0 1 2 1 92 3 7 4 S h i m a z u M， S a t o H E f f e c t s o f l a r v a l a g e o n m o r t a l i U o f M o n o c h a m a l t e r n a t Ho p e( c o l e 叩t e t e r a m b y c i d a e ) a ft e r a p p l i c a t i o n of n 0 n w o v e n f a b ri c s t ri p s w i t h B e a u v e r i a b a s s i a n a J A p p l i e d E n t o m i l o g y a n d Z o o l o ， 2 0 0 3 ， 3 8 ( 1 ) ：1 5 5 柴新义 ，樊美珍 ，李增智 ， 等 白僵菌不同放菌策略对防治松墨天牛效果的影响 J 滁州学 院学报 ，2 0 0 5 ，6 ( 4 ) ：1 1 3 1 1 4，1 2 3 6 杨毅 ，周祖基 ，张立钦 ，等寄生松墨天牛的球孢 白僵菌 不同菌 株 D N A多态性 的 R A p b分析 J 浙江林学 院学报 ， 2