马铃薯X病毒运动蛋白基因的原核表达、抗血清制备及应用

第 3 5卷第 4期 2 0 0 8年8 月 植物保护 学报 AC T A P HYT O P HYL AC I CA S I N I C A V0 1 3 5 No 4 A u g 2 0 0 8 马铃薯 X病毒运动蛋白基 因的原核表达、 抗血清 制备及应用 刘秀君 张献军 刘兰伟 孙燕霞 刘红梅 ( 山东农业大学生命科学学院，泰安 2 7 1 0 1 8 ) 摘要 ： 构建马铃薯 x病毒运动蛋 白( P 2 5 ) 原核表达载体 ，并在大肠杆 菌 B L 2 1 ( D E 3 ) p L y s S中诱导 表达融合蛋 白， 所表达的 P 2 5蛋 白经 S D S P A G E电泳纯化后免疫 小鼠， 抗血清效价为 1 ： 4 0 0 0 ， 抗血 清与 P V X有特异性反应( P N 2 ) ， 且具有较强的反应特异性， 而与 P V Y 、 T MV均不发 生反应。该 方法制备的抗血清可用于 E L I S A检测 P V X感病植株及 We s t e r n b l o t 检测转基因植株。 关键词： 马铃薯x病毒； 运动蛋白； 原核表达； 抗血清； 转基因烟草 Ex pr e s s i o n o f m o v e m e n t p r o t e i n g e n e a n d a n t i s e r u m p r e p a r a t i o n o f Po t a t o v i r u s X L i u X i u j u n Z h a n g X i a n j u n L i u L a n w e i S u n Y a n x i a L i u H o n g me i ( C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e s ， S h a n d o n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ， T a i a n 2 7 1 0 1 8 ， S h a n d o n g P r o v i n c e ，C h i n a ) Ab s t r a c t ： R e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T P 2 5 w a s c o n s t r u c t e d b y l i g a t i n g m o v e m e n t p r o t e i n( P 2 5 )g e n e o f P o t a t o v i r u s X ( P V X)i n t o t h e e x p r e s s i o n v e c t o r p E T 一 3 0 a a n d t h e n t r a n s f e r r e d i n t o E c o l i B E 2 1( D E 3 ) p Ly s STh e r e s u l t s o f S DS PAGE s h o we d t ha t 2 9 k D s p e c i fi c f us i o n p r o t e i n wa s pr o d u c e d a f t e r i n d u c t i o n b y I P T GT h e f u s i o n p r o t e i n w a s i n j e c t e d i n t o m i c e t o p r e p a r e a n t i s e r u m a f t e r b e i n g p u r i fi e d c rud e l y A n d t h e t i t e r w a s d e t e r m i n e d t o b e 1 ： 4 0 0 0 T h e a n t i s e rum h a s s p e c i a l r e s p o n s e w i t h P V X ( P N 2 ) c o mp a r e d wi t h n o r e s p o n s e wi t h PVY a n d TMV，Us i n g t hi s a n t i s e ru m ，we c a n e x a mi n e t h e i n f e c t e d l e a r e s b y P VX a n d PVX P2 5 t r a ns g e n i c t o ba c c oAn d t h e r e s u l t s h o we d t h a t P 25 g e n e h a d b e e n e x p r e s s e d a n d t r a n s l a t e d t o p r o t e i n i n s o me t r a ns g e n i c pl a n t s Ke y wo r ds ：Po t a t o v i r s X ；mo v e me n t p r o t e i n；p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n；a n t i s e rum ；t r a ns g e n i c t o b a c c o 马铃薯在我国农业生产中占有重要地位 。长期 以来， 马铃薯的产量和质量受到病毒病的严重威胁 ， 导致种性退化、 大幅减产 _ 1 J 。马铃薯 x病毒 ( P o t a t o v i r us X， P V X) 分布广泛 ， 虽然其引起 的症状较温 和， 但 田间常与其它病毒混合侵染 ， 导致毁灭性减产， 给 农业生产造成 巨大损失 。 早期检测病毒是防止传播的有效方法 ， 近年来 ， 许多科研工作者通过分子生物学手段获得病毒外壳 蛋白基因， 将其在原核细胞中诱导表达， 利用产生的 病毒外壳蛋白或融合蛋白作为抗原制备高特异性的 抗血清。此方法已在某些植物病毒抗血清制备中得 到较广泛应用 I 4 ， 但利用病毒编码其它蛋 白制备 血清的研究较少 。本研究将 P V X编码的运 动蛋 白 P 2 5基因转入大肠杆菌获得表达 ， 以重组蛋 白为抗 原获得抗血清 ， 并对蛋 白表达诱导条件、 抗血清特异 性及其在转基 因植株 We s t e r n b l o t 检测上的应用进 行 了探讨。 基金项 目： 国家 自然科学基金项目( 3 0 2 7 0 8 7 5 ) ， 山东省中青年科学家科研奖励基金( 2 0 0 5 B S 0 2 0 0 7 ) 作者简介 ： 刘秀君 ， 女 ， 1 9 8 2年生 ， 硕士研究生 ， 研究方向为分子生物学 ， e m a i l ： l X j 1 1 9 1 6 3 e o m 通讯作者( A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e ) ， e m a i l ： fl y s d a u e d u c n 收稿 日期 ： 2 0 0 71 1 0 9 维普资讯 维普资讯 4期 刘秀君等 ： 马铃薯 x病毒运动蛋 白基因的原核表达、 抗血清制备及应用 2 2 表达载体的构建 对重组载体 进行 P C R和酶切 ， 均得 到大小 为 6 8 1 b p的目的带( 图 2 ) ， 验证得到重组原核表 达载 体 p E T P 2 5 ， 经测序鉴定证 明阅读框正确。 2 0 00 b p 1 0 00b p 7 5 0 b p 5 0 0 b p 2 5 0 b p 图 2 重组质粒 p E T- P 2 5的酶切鉴定和 P C R鉴定 F i g 2 Re s t r i c t i o n a n a l y s i s a n d P C R a n a l y s i s o f p E T P 2 5 r e c o mb i n an t s 注 ： 泳道 1 2 ： B a m H I 、 K p n I消化 p E T P 2 5的产物 ； 泳道 3 4 ： p E T P 2 5的 P C R扩增产物； 泳道 5 ： 2 0 0 0 b p D N A m a r k e r 。N o t e L a n e 1 2 ： p E T P 2 5 d i g e s t e d b y B a m H I a n d I ； L a n e 3 4 ： P C R p r o d u c t o f p E T _ P 2 5 ； L a n e 5 ： 2 0 0 0 b p D N A m a r k e r 2 3 诱 导表达 、 S DS P AG E 用 1 2 5 的凝胶进行 S D S P AG E、 考马斯亮蓝 染色( 图3 ) 。经 I P T G诱导后 ， 含 p E T P 2 5的菌株表 达出大小约 2 9 k D的特异性蛋 白条带 ， 与理论大小 9 72 k D 6 64 k D 相符。设置的 3个温度梯度对诱导效果无显著影响 ( 结果未显示) ， 但诱导浓度和时间对诱导效果有影 响， 当I P T G浓度为 1 m m o l L 、 诱导时间为 4 h时目 的片段表达量最高。 图 3 诱导时 间、 诱导剂浓度对 P 2 5原核表 达的影响 F i g 3 T h e i n flu e n c e o f i n d u c t i o n t i me a n d i n d u c e r c o n c e n t r a t i o n o n P 2 5 p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n 注 ： 泳道 1 ： 空载体 p E T - 3 0 a 3 7 条件下经 I P T G诱导4 1 1 ； 泳道 2 ： p E T P 2 5 3 7 条件下未经 I P T G诱导； 泳道3 ： 蛋白质M a r k e r ； 泳道4 7 ： p E T P 2 5 3 7条件下经 0 4 m m o l L I P T G诱导， 时间分别为 1 、 2 、 3 、 4 h ； 泳道 8 1 1 ： p E T P 2 5 3 7 条件下经 1 m m o l L I P T G诱导 ， 时间 分别为 1 2 3 4 h 。N o t e ： L a n e 1 ： p E T - 3 0 a i n d u c e d b y I P T G f o r 4 h i n 3 7； L a n e 2 ：p E T P 2 5 w i t h o u t i n d u c e d i n 3 7 ； L a n e 3 ： p r o t e i n m a r k e r ； L a n e 4 7 ： p E T P 2 5 i n d u c e d b y I P T G( 0 4 m m o l L )i n 3 7， i n d u c ti o n t i m e i s 1 ， 2 ， 3 ， 4 h s e p a r a t e l y ； L a n e 8 1 1 ： p E T P 2 5 i n d u c e d b y I P T G ( 1 mmo l L)i n 3 7 ，i n d u c ti o n t i me i s 1 ， 2 ， 3， 4h s e p a r a t e l y 2 4 抗血清制备、 效价测定及特异性检测 以重组蛋 白为抗原免疫 1 0只小 白鼠， 获得 4 m L 抗 血 清 。 用 间接E L I S A法测 定 抗血 清 的效 价约 为 1 ： 4 0 0 0 。以健康叶片为对照 ， E L I S A法测定血清特 异性 ， 只有 P V X 呈 阳性 反应 ( P N2 ) ， 而 P V Y、 T MV显 示 阴性 反应。因此 ， 该血清 具有很 强 的特 异性。 2 5 稳定表达的转运动蛋白基因植株的获得及鉴定 实验室获得转基因植株 ， 经 P C R和 N o r t h e rn b l o t 验证得到阳性植株( 结果未显示) ， We s t e r n b l o t 检测 阳性转基 因植株获得单一特定的条带 ， 阴性对照却 没有( 图4 ) ， 证明该运动蛋白基因在植物体内获得 完整正确的表达 ， 此血清可用于检测 P V X P 2 5转基 因植株的表达情况 。 维普资讯 3 l O 植物保护学报 3 5卷 2 3 4 薯 j i 图 4 转基 因植株的 We s t e r n b l o t 检测 F i g 4 T h e i d e n t i f y o f t r a n s g e n i e t o b a c c o b y W e s t e r n b l o t 注： 泳道 1 ： 未转基因的野生型植株 ； 泳道 2 4 ： 转基因植株 的不同株系。N o t e ： L a n e 1 ： Wi l d t y p e t o b a c c o ； L a n e 2 4 ： P V X 一 1 2 5 t r a n s g e n i c t o b a c c o 3 讨论 加强种苗检疫是控制病毒病传播蔓延的有效措 施 。由于血清学方法具有灵敏、 快速、 适合大量样品 检测等特点 ， 自2 0世纪 7 0年代 以来逐渐在植物病 毒检测 中得到应用 。制备病毒特异性抗血清最直接 的方法是用分离纯化 的病毒为抗 原免疫动物 ， 但病 毒的提纯工作不仅繁琐而且有些病毒难 以提纯 J ， 获得的血清通常含 有植物组织成 分， 使得血清学检 测病毒时出现假 阳性 ， 严重影响试验结果。而采用 分子生物学方法可以排除植物体内杂蛋白的影响， 从而更准确地检测植株体内的病毒。 本研究利用表达载体 p E T 一 3 0 a通过 N端融合表 达方式成功地 表达 了 P V X P 2 5基 因， 表 达量非 常 高 ， 以此作为抗原制得的抗体避免了纯病毒作为抗 原检测植株病毒时可能出现的假阳性 。本试验利用 切胶研磨的方法获得抗原而不是通过 Hi s B i n d柱纯 化重组蛋 白作为抗原 ， 这大大节约了成本 ， 虽然效价 可能有所降低， 但并不影响田问检测 P V X病毒的效 果。此外作为抗原的 P A G E胶不用添加佐剂 即可直 接注射 ， 推测可能是聚丙烯酰胺本身具有佐剂的作 用 ， 使与之结合的抗原能够持续释放， 并刺激局 部免疫反应 。 以往的研究大部分是利用病毒体内的外壳蛋白 作为抗原制取病毒的抗血清 ， 本试验利用 P V X病毒 的运动蛋 白制得高特异 性 P V X抗 血清 ， 对 于 P V X 的早期检测起重要作 用。另有研 究表明 P V X的运 动蛋 白能作为一种沉默抑制子起作用 ， 它可能 通过影 响胞问连丝的孔径而协助病毒更好地在寄主 体内运输 引， 因此其功能及作用机制的研究对于 P V X的防治具有重要意义。此外 ， 利用该抗血清还 可以有针对性地对作为沉默抑制子 的 P 2 5进行细 胞定位及作用特点等的研究。 目前本研究 已获得转 P V X P 2 5稳定表 达的烟 草 ， 利用制备的 P V X P 2 5抗血清对沉默信号在转基 因植株中传导的研究正在进行 中。 参 考 文 献( R e f e r e n c e s ) 1 韩学俭马铃薯病毒病的危害及防治植物医生， 2 0 0 3 ， 1 6 ( 1 ) ：1 51 6 2 N e o K K， Wo n g S M， Wu M N u e l e o t i d e s e q u e n c e a n d i n v i t r o t r a n s l a t i o n of t h e c o a t p r o t e i n g e n e o f c y mb i d i u m mo s Mc v i r u s V i ru s G e n e ， 1 9 9 3 ， 7 ( 2 ) ： 1 5 7 1 7 0 3 姚华建，于嘉林 ， 金元 ， 等 甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基 因的表达及其表达产物抗血清的制备 病毒学报， 1 9 9 4 ， 1 0 ( 1 ) ：3 9 4 3 4 吴兴泉，陈士华 ， 吴祖建 ， 等马铃薯 X病毒 c P基 因的原 核表达及特异性抗血清的制备郑州工程学院学报 ， 2 0 0 3 ， 2 4：25 28 5 H e ff e ro n K L ， X u J I d e n t if i c a t i o n a n d i n v i v o e x p r e s s i o n of a p r o k a r y o t i c l i k e r i b o s o me r e c o g n i t i o n s e q u e n c e u p s t r e a m o f t h e c o a t p r o t e i n g e n e of Po t a t o v i r u s X Ar c h i v e s o f Vi r o l o g y， 2 00 0，1 4 5：9 4 595 6 6 秦云霞，曾华金 ， 刘志昕， 等黄瓜花叶病毒 C P基因原核 表达及抗血清的制备中国生物工程杂志 ， 2 0 0 4 ， 2 4( 8 ) ： 7 37 6 7 徐平 ， 许建平 ， 薛朝 阳， 等芜菁花叶病毒外壳蛋 白基因的 序列分析及其在大肠杆菌 中的表达病毒学报，1 9 9 4 ，1 0 ( 2 )：1 7 21 7 7 8 潘俊松 ， 刘志昕， 康 由发 ， 等齿兰环斑病毒外壳蛋白基 因 的表达及其表达产物抗血清的制备 热带作物学报 ， 1 9 9 9 ， 2 0 ( 2 ) ： 6 2 6 6 9 V o i n n e t O ， L e d e r e r C ， B a u l c o m b e D C A v ir a l m o v e m e n t p r o t e i n p r e v e nt s s p r e a d of t h