2019_2020学年高中生物第1章无菌操作技术实践第2节分离特定的微生物并测定其数量学案苏教版选修1.docx

第二节分离特定的微生物并测定其数量学习目标1.认识各种微生物形成的菌落特征。2.学会利用涂布平板法分离、培养微生物，并测定其数量。(重难点)3.掌握利用选择培养基分离特定微生物的方法。(重点)知识点一| 微生物的分离1分离原理在实验室中利用选择培养基可以筛选和分离出某种微生物，然后在高度稀释的条件下，在固体培养基上培养该微生物形成的单个菌落，即为纯培养物。2分离方法(1)平板分离法：包括涂布平板法和混合平板法。能将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成单个菌落。(2)选择培养分离：科学家针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术，称为选择培养分离。(3)根据菌落特征初步分离：菌落的含义：是指单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。菌落特征：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以成为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。探讨：在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌吗？提示：标准的单个菌落中只含有一种细菌。探讨：如果要分离厌氧菌，应在什么条件下培养？提示：在无氧条件下培养。探讨：在选择培养分离微生物的过程中，“选择培养”的培养基按物理性质划分属于什么培养基？为什么？提示：固体培养基。便于选择、分离所需要的微生物。1涂布平板法与混合平板法的比较比较操作特点结果涂布平板法取一定稀释度的样品涂布平板用无菌玻璃涂布器将样品涂布均匀先制作琼脂平板后加入菌液细菌菌落通常仅在平板表面生长混合平板法取一定稀释度的样品与熔化的培养基混合将混合液倒入无菌培养皿菌液与琼脂混合，共同倒平板细菌菌落出现在平板表面及内部2.选择培养基的选择作用(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。(2)方法：在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。1微生物的接种方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，关于两者的区别下列说法正确的是()比较方面平板划线法稀释涂布平板法需在无菌条件下操作不需无菌操作培养基中不加琼脂培养基中加有琼脂不可计算菌液中的活菌数可计算菌液中的活菌数需要接种环需要玻璃涂布器A.、B、C、 D、B平板划线法和稀释涂布平板法都需要进行无菌操作，避免杂菌污染；平板划线法和稀释涂布平板法都使用固体培养基，培养基中都加有琼脂；平板划线法采用接种环或接种针进行接种，而稀释涂布平板法采用玻璃涂布器进行接种；稀释涂布平板法可计算菌液中的活菌数，平板划线法不能计算出菌液中的活菌数。2(2019全国卷)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。回答下列问题。(1)在号培养基中，为微生物提供氮源的是_，、号培养基中为微生物提供碳源的有机物是_。(2)若将土壤悬浮液接种在号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会_，其原因是_。(3)号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是_。(4)假设从号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供_和_。答案(1)牛肉膏、蛋白胨X(2)下降不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖(3)稀释涂布平板法(4)能量合成其他物质的原料知识点二| 土壤微生物的分离、培养与数量测定1涂布平板法培养和计数土壤微生物(1)过程：(2)计数：每克土壤样品的细菌数某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数稀释倍数(涂布所用稀释液为1 mL)。2显微镜直接计数法(1)原理：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。(2)血球计数板：血球计数板是一块特制的载玻片。其上有特定面积为1 mm2、高为0.1 mm的计数室，一个计数室又被分成25个(或16个)中方格，每个中方格再被划分成16个(或25个)小方格，每个计数室都由400个小方格组成。(3)操作过程：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管吸取摇匀的土壤微生物培养液，在盖玻片的边缘滴一小滴，让培养液沿着缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。加样后静止5 min，然后在显微镜下计数45个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的菌体总数。(4)计算公式：1 mL悬液所含菌体总数每小格平均菌体数400104稀释倍数。3分离土壤中能分解纤维素的微生物(1)实验目的：分离以纤维素为唯一碳源的微生物。(2)培养基配方特点：纤维素是唯一的碳源。(3)基本步骤：制备培养基制备土壤悬液接种培养观察。探讨：你认为涂布平板法计数的菌落数与实际活菌数之间存在什么样的关系？提示：实际活菌数大于计数的菌落数目。原因是有的菌落不只由一个细菌生长而成。探讨：常见的菌数计数的方法有哪些？它们所利用的原理分别是什么？提示：(1)显微镜直接计数法。原理：利用特定的血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。(2)间接计数法(活菌计数法)。原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。1直接计数法与间接计数法的比较微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者比较如下：项目直接计数法间接计数法主要用具显微镜、细菌计数板培养基计数依据菌株本身培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌缺点死菌、活菌都计算在内操作较复杂，且有一定误差计算公式每毫升原液含菌株数400104每小格平均菌株数稀释倍数每毫升原液含菌株数培养基上平均菌落数稀释倍数(涂布所用稀释液为1 mL)2.筛选能分解纤维素的微生物流程图1某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为215，那么每毫升样品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)()A2.15108B2.15109C215 D21.5B稀释倍数为106,0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为215，则每毫升样品中菌落数为2150.11062.15109。2图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。(1)图中选择培养基应以_为唯一氮源；鉴别培养基还需添加_作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成_色。(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是_，每克土壤样品中的细菌数量为_108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较_。(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为_，突变基因表达的蛋白质含_个氨基酸。解析(1)脲酶能够催化尿素水解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为(156178191)3175(个)。每克土壤样品中的细菌数为1750.11051.75108。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。(3)箭头处插入70个核苷酸，箭头后密码子的解读方式为*AG，UGA，GAA对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为UGA。从起始密码到终止密码之前共有27372个碱基，因此突变基因表达的蛋白含115个氨基酸。答案(1)尿素酚红红(2)稀释涂布平板法1.75少(3)UGA115课堂小结知识网络构建核心语句归纳1.实验室中分离微生物的方法有平板分离法和选择培养分离，平板分离法常用的有涂布平板法和混合平板法。2.针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。3.测定微生物数量的常用方法有涂布平板法和显微镜直接计数法。涂布平板法计数的结果与待测样品中真正的含菌数量相比往往偏低。4.涂布平板法培养和计数微生物的流程为：准备实验器材采集土壤，制备悬液选择适于分离特定微生物的培养基接种培养与观察计数菌落。5.涂布平板法计数微生物的公式：每克土壤样品的细菌数某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数稀释倍数(涂布所用稀释液为1 mL)1下列关于微生物分离和培养的有关叙述，错误的是()A微生物培养前，需对培养基进行消毒B测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法C分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度D分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源A微生物培养前，需对培养基进行灭菌，而不是消毒；测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法而一般不用活菌计数法；分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度以便能从中选择出菌落数在30300间的平板进行计数；分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源。2分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是()加尿素不加尿素加琼脂不加琼脂加葡萄糖不加葡萄糖加硝酸盐不加硝酸盐ABC DC要分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中尿素应是唯一的氮源，不能加硝酸盐；在固体培养基上形成菌落，要加琼脂作凝固剂；分解尿素的细菌是异养生物，要加有机碳源(如葡萄糖)。3用涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是()A平板上的一个菌落就是一个细菌B菌落中的细菌数是固定的C此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌D此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同C当稀释倍数适宜时，培养基上的一个菌落可能来源于样品稀释液中的一个活菌，但也可能由2个或2个以上活菌生长而成，因此菌落数往往比活菌的实际数低。4将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：(1)M培养基用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制_的生长，加入了链霉素的培养基属于_培养基。(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有_(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有_(答出两点即可)。(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是_，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_。(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是_。解析(1)M培养基用于真菌的筛选，抗生素能够杀菌，因此培养基中应加入链霉素以抑制细菌的生长，加入了链霉素的培养基属于选择培养基。(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物