生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究.ppt

,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究,报告人：杨靖导师：黄从新教授,研究背景,缓慢性心律失常为临床常见多发病电子起搏器植入术是治疗严重缓慢性心律失常的首选方案,电子起搏器存在缺陷,非生理性起搏电池寿命有限易受外界电磁干扰等,生物起搏器构建-当前研究热点,主要内容,生物起搏器种子细胞筛选HCN通道电生理及药理学实验研究,第一部分,生物起搏器种子细胞筛选,研究对象,心脏干细胞（CSCs）脂肪干细胞（ASCs）骨髓间充质干细胞（BMSCs）,CSCs的相关研究,研究内容,CSCs的分离培养及其鉴定5-氮杂胞苷诱导CSCs向窦房结样细胞分化,实验方法,小园形、亮的细胞从组织移植块中爬出（箭头所示）（200）,流式细胞仪分选,左图，分选前流式细胞仪检测培养细胞c-kit阳性率右图，用流式细胞仪分选经c-kit标记的细胞,流式细胞仪检测,流式细胞仪鉴定分选后CD34、CD45的阳性率,倒置显微镜观察,分选后的单个细胞（左图），培养后簇集式增殖、心球样细胞团形成（右图）（200）,荧光显微镜观察,在光学显微镜下(左图)、荧光显微镜下（右图）观察刚分选的同一批c-kit+细胞（400）,增殖能力比较不同部位间比较,增殖能力比较不同性别间比较,免疫荧光检测,分选后4周用抗cTnI,SMAandCD31抗体检测培养细胞免疫表型（A,300;B-C,200）,RT-PCR检测,RT-PCR检测,RT-PCR方法分析分选细胞不同培养时间的GATA-4,HCN2和HCN4的mRNA表达*P0.05,#P0.01,培养8周组vs培养4周组,免疫荧光检测5-Aza诱导CSCs分化,用抗cTnI,GATA4抗体检测经5-Aza诱导后CSCs分化的免疫表型（A,200;B,400）,免疫荧光检测,用抗HCN4抗体检测经5-Aza诱导后CSCs分化细胞表达HCN4蛋白情况（A,400;B,200）,荧光检测结果比较,不同浓度5-aza诱导后的细胞在4周时表达GATA-4,cTnI和HCN4蛋白情况.10uM组与前两组比较，#P0.05,5-Aza诱导浓度,RT-PCR检测,RT-PCR技术分析在不同浓度5-aza诱导后的细胞在不同培养时间的GATA-4,HCN2和HCN4mRNA表达,RT-PCR检测,RT-PCR技术分析在不同浓度5-aza诱导后的培养细胞在不同培养时间的GATA-4,HCN2和HCN4mRNA表达.P0.05,#P0.01,2组vs3组或4组,结论,体外培养条件下可以获得c-kit+CD34-CD45-CSCs不同部位不同性别来源CSCs的增殖能力存在差异,c-kit+CSCs具有向心肌样和窦房结样细胞分化的能力10M5-Aza有增强上述分化的作用,ASCs与BMSCs相关研究,实验流程,形态学比较（P5）,(200),ASCs,BMSCs,表面标记物检测（P5）,抗原表达水平无显著差异,增殖能力比较,*P0.05*P0.05,（400）,ASCs和BMSCs转染HCN4后凋亡率比较,aASCsbBMSCsc两者对比,P5代ASCs转染HCN基因后凋亡率低于BMSCsP0.05,结论,来自同一个体的ASCs与BMSCs相比具有更强的体外增殖能力具有更强的向心肌样细胞及窦房结样细胞分化的能力二者基因转染效率相似，但转染HCN4基因后ASCs凋亡水平更低,第二部分,HCN通道电生理及药理学实验研究,主要内容,HCN通道在卵母细胞中的表达HCN2/HCN4通道复合体转染ASCs胺碘酮对HCN通道的作用及机制,HCN通道在卵母细胞中的表达,卵母细胞钳记录通道电流,实验流程,电生理学指标,电流表达幅值通道动力学特性,HCN通道电流,A.HCN1电流B.HCN2电流C.HCN4电流D.激活曲线,HCN通道动力学,A.典型电流B.I-V曲线C.去激活常数D.激活常数,HCN1/HCN2共表达形成的电流幅值,HCN1/HCN4共表达形成的电流幅值,HCN2/HCN4共表达形成的电流幅值,HCN1/HCN2与单个亚型通道动力学比较,A.电流图B.激活时间常数C.激活曲线,HCN1/HCN4与单个亚型通道动力学比较,A.电流图B.激活时间常数C.激活曲线,HCN2/HCN4与单个亚型通道动力学比较,A.电流图B.激活时间常数C.激活曲线,结论,HCN1、2和4共表达后均可形成复合体电流HCN2/4以1:1比例共表达所形成的复合体电流幅度最大，激活速度最快,HCN2/HCN4通道复合体转染ASCs,实验流程,共聚焦照相,共转染HCN2/4通道,通道mRNA表达水平,通道蛋白表达水平,封接带荧光的ASCs细胞,200,膜片钳记录HCN电流,通道动力学研究,激活常数,激活曲线,结论,HCN2及HCN4通道可分布在ASCs细胞膜的共同区域两者共表达存在促进作用HCN2/HCN4通道复合体表达在ASCs上与表达在爪蟾卵母细胞上的电生理学特性一致较单一亚型具有更快的激活动力学特性,胺碘酮对HCN通道的作用及机制,胺碘酮对