酶化学PPT课件.ppt

要求掌握：一、酶的催化作用特点。二、掌握酶的化学本质及其组成。三、掌握酶的命名和分类。四、掌握酶的活力测定和分离纯化。五、熟识酶工程。六、反应速率及其测定。七、各级反应的特征。八、底物浓度对酶反应速率的影响(1)熟识米氏方程式的推导。(2)米氏常数的意义。九、酶的抑制作用。（1）抑制作用的类型。（2）抑制作用的鉴别。,酶,1,.,十、温度、pH、激活剂对酶反应的影响。十一、酶的活性部位。1、酶活性部位的定义、特点。2、酶活性部位的研究方法。十二、酶催化反应的独特性质。十三、影响酶催化效率的有关因素。十四、别构酶的性质、酶原的激活以及同工酶的理解。十五、掌握酶的定义及分类。掌握核酶、抗体酶、单体酶、寡聚酶以及多酶复合体的概念。十六、维生素的概念与分类。十七、掌握B族维生素与辅酶的关系。,2,酶的发现和提出：1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母汁成功实现了发酵。提出了发酵与活细胞无关，而与细胞液中的酶有关。1903年，Henri提出了酶与底物作用的中间复合物学说。1913年，Michaelis和Menten提出了酶促动力学原理米氏学说。1925年，Briggs和Handane对米氏方程做了修正，提出了稳态学说。,第一节酶的概述,3,1926年，Sumner从刀豆种子中分离、纯化得到了脲酶结晶，首次证明酶是具有催化活性的蛋白质。1930年Northrop分离得到胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶结晶并证实其均为蛋白质，酶的蛋白质本质确立。1969年，Merrifield等人工合成了具有酶活性的胰RNase。1982年，Cech和Altman对四膜虫的研究中发现RNA具有催化作用，从而发现核酶(ribozyme)，打破了以往酶是蛋白质的传统观念。1986年Schultz和Lerner等人研制成功抗体酶,4,一、酶的概念,都能降低反应的活化能,能加快反应速度，但不能改变反应的平衡点，反应前后不发生质与量的变化,催化效率高,酶是活细胞产生的一类具有催化功能的蛋白质，亦称为生物催化剂Biocatalysts。绝大多数的酶都是蛋白质(除Ribozyme核酸酶)。酶催化的生物化学反应，称为酶促反应Enzymaticreaction。,（一）酶的共同特性,5,有效碰撞能够使反应顺利进行的分子碰撞。,活化能反应需要克服的障碍能阈，分子由常态变成活化态所需的能量。,活化分子携带足够的能量，能够发生有效碰撞的分子。,酶作为催化剂只降低活化能，但反应前后底物和产物能量差异不变，只是改变反应速率，不改变反应性质、反应方向和反应平衡点。,活化能,E+S,ES,E+P,6,7,1酶易失活,凡能使蛋白质变性的因素如强酸、强碱高温等条件都能使酶破坏而完全失去活性。所以酶作用一般都要求比较温和的条件如常温、常压和接近中性的酸碱度。,（二）酶作为生物催化剂的特性,酶促反应一般在pH5-8水溶液中进行，反应温度范围为20-40C。高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活,8,2,9,酶的专一性Specificity又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的选择性，即一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质。亦即酶只能催化某一类或某一种化学反应。例如：蛋白酶催化蛋白质的水解；淀粉酶催化淀粉的水解；核酸酶催化核酸的水解。,3高度专一性（Specificity）,10,酶的底物专一性即特异性（substratespecificity）指酶对它所作用的底物有严格的选择性。一种酶只能作用于某一种或某一类结构性质相似的物质。类型：结构专一性和立体化学专一性。,11,a.结构专一性,有些酶对底物的要求非常严格，只作用于一个特定的底物。这种专一性称为绝对专一性（Absolutespecificity)。例如：脲酶、麦芽糖酶、淀粉酶、碳酸酐酶及延胡索酸水化酶（只作用于反丁烯二酸）等。,（）绝对专一性（Absolutespecificity),12,有些酶的作用对象不是一种底物，而是一类化合物或一类化学键。这种专一性称为相对专一性(RelativeSpecificity)。包括：族(group)专一性又叫基团专一性（对键两端的基团要求的程度不同，只对其中一个基团要求严格）。如-D-葡萄糖苷酶，不但要求-糖苷键，还要求-糖苷键的一断必须是葡萄糖残基，但对于糖苷键的另一端R基团则没有严格要求。,（）相对专一性(RelativeSpecificity),13,键(Bond)专一性有些酶只要求作用于底物一定的键，而对键两端的基团无严格的要求。如酯酶催化酯的水解，对于酯两端的基团没有严格的要求。,14,b.立体化学（异构）专一性StereochemicalSpecificity，stereospecificity,酶的一个重要特性是能专一性地与手性底物结合并催化这类底物发生反应。即当底物具有旋光异构体时，酶只能作用于其中的一种。例如，淀粉酶只能选择性地水解D葡萄糖形成的1，4糖苷键；L-氨基酸氧化酶只能催化L-氨基酸氧化；乳酸脱氢酶只对L-乳酸是专一的。,（）旋光异构专一性,15,（）几何异构专一性geometricalspecificity,有些酶只能选择性催化某种几何异构体底物的反应，而对另一种构型则无催化作用。如延胡索酸水合酶只能催化延胡索酸即反丁烯二酸水合生成苹果酸，对马来酸（顺丁烯二酸）则不起作用；再如：丁二酸（琥珀酸）脱氢酶酶的立体化学专一性的实践意义,16,4.酶活力可调节和控制,（1）酶浓度的调节诱导或抑制酶的合成调节酶的降解（2）激素调节酶的活性（3）反馈抑制调节酶的活性（4）抑制剂和激活剂的调节（5）其他调节方式。共价修饰调节、别构调节、酶原激活、同功酶等。,17,二、,18,三、,19,单体酶-monomericenzyme：一般由一条肽链组成，如溶菌酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。但有的单体酶有多条肽链组成，如胰凝乳蛋白酶由3条肽链，链间由二硫键相连构成一个共价整体。寡聚酶-oligomericenzyme：由2个或2个以上亚基组成，亚基间可以相同也可不同。亚基间以次级键缔合。如3-磷酸甘油醛脱氢酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶等。多酶体系-multienzymesystem：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。主要指结构化的多酶复合体如丙酮酸脱氢酶系、脂肪酸合成酶复合体等。,20,第二节,与分类,21,22,23,24,25,26,27,28,一、酶的活性部位（活性中心）,酶的活性中心：在酶分子三级结构的构象中，由少数必需基团组成，能与底物结合并完成特定催化反应的空间小区域。,酶的活性中心,结合基团：负责与底物结合的必需基团。,催化基团：负责催化反应的必需基团,必需基团：酶蛋白中只有少数特定的氨基酸残基的侧链基团与酶的催化活性有关。,酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂隙内。裂隙内是一个相当疏水的环境，从而有利于同底物的结合。,第三节酶的作用机理,29,二、酶的别构部位,1、定义：酶的别构部位是指除与底物结合的活性部位外，酶分子中与非底物物质结合的部位。称别构部位或调节部位2、作用：对酶的催化能力有调节作用。分正调节作用（正协同作用）和负调节作用（负协同作用）。原因：由于别构剂与别构部位结合，从而引起酶空间构象发生改变。（1）酶空间构象发生改变有利于底物与酶结合，增加酶的活性。（2）酶空间构象发生改变有不利于底物与酶结合，甚至引起酶分子变性。3、别构酶：具有别构部位的酶。4、别构剂或调节剂：与别构部位结合的物质。,30,三、酶催化机制,（一）酸碱催化,广义的酸碱催化：指的是质子供体及质子受体的催化。,狭义的酸碱催化：即H+和OH-的催化，但酶的最适pH接近于中性，故H+和OH-的催化在酶的反应中不重要。,31,（二）共价催化(Covalentcatalysis),共价催化又称亲核催化或亲电子催化，在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或获得电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。酶中参与共价催化的基团主要包括以下亲核基团：His的咪唑基，Cys的巯基，Asp的羧基，Ser的羟基等；亲电子基团：H+、Mg2+、Mn2+、Fe3+某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。,32,靠近效应：在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，从而使反应速率大大增加的效应叫做邻近效应。,定向效应：当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。,（三）靠近和定向效应,33,当酶遇到其专一性底物时，酶中某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，使敏感键的一端更加敏感，底物分子发生形变，底物比较接近它的过渡态，降低了反应话化能，使反应易于发生。,（四）底物变形,34,（五）诱导契合学说,Koshland提出“诱导契合假说”:酶与底物给合时，酶构象发生改变的同时，底物分子也发生形变，从而形成一个互相契合的酶-底物复合物，进一步转换成过渡态，大大增加了酶促反应速率。该学说的主要内容如下：（1）在酶与底物结合之前，酶分子的构象不一定和底物互相吻合。（2）酶分子的活性中心不是刚性的结构。它具有一定的柔性，当底物与酶分子相互接近时，底物分子可以诱导酶分子的构象发生一定的变化。（3）由于酶分子构象发生的变化，因而使活性中心的催化基团形成了正确的排列和定向，使酶分子和底物分子楔合而结合成中间络合物，并导致底物发生反应。（4）当反应完毕时，产物从酶分子上掉下来，这时酶分子又恢复到原来的构象。X-衍射证明酶与底物结合时，确有显著的构象变化,这个学说说明了在酶促反应中，酶与底物是如何相互作用和结合的，也解释了酶为什么具有专一性。,35,Fisher提出“锁钥假说”来解释酶作用的专一性，认为底物分子或底物分子的一部分象锁钥那样专一地契入到酶的活性中心。也即底物分子进行化学反应的部位与酶分子上有催化效能的必需基团具有紧密互补的关系。（酶作用专一性的假说）,（六）锁钥假说,36,“三点附着”学说一一立体对映的一对底物虽然基团相同，但空间排列不同，这就可能出现这些基团与酶分子活性中心的结合基团能够互补匹配的问题,只有三点都能互补匹配，酶才能作用于这个底物，若排列不同，则不能三点匹配，酶不能作用于它。（解释酶的立体异构专一性）,37,第四节酶促反应动力学,酶促反应的动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学。,影响酶促反应的理化因素包括：底物浓度、酶浓度、PH值、温度、抑制剂和激活剂等。,一、底物浓度对酶促反应速度的影响米氏学说的提出,实验所得VS关系曲线,Vm,Km,1,2,3,v,s,v=Vmax/2,38,底物浓度与反应速度曲线分为三个阶段,第1段：直线关系，为一级反应,当底物浓度较低时，酶的活性中心没有被底物占据，随底物浓度S的增加，反应速度v成正比关系增加。,第2段：成曲线，为混合级反应,当底物浓度继续增加时，反应速度虽然仍在增加，但比较缓慢，不再与底物浓度成正比增加。,第3段：接近直线，为零级反应,当底物浓度很高时，几乎所有的酶活性中心都被底物饱和，这时反应速度接近极限值Vmax,可以认为这段反应速度与底物浓度无关。v=VM,对于反应速度与底物浓度之间的这种曲线关系的解释，中间产物学说被认为比较合理。,39,E+S,K1,K2,2、米氏方程的推导,根据中间产物学说：,ES,K3,E+P,根据质量作用定律，反应产物P的生成速度：v=K3ES,ES的生成速度=K1ES,ES的分解速度=K2ES+K3ES=（K2+K3）ES,反应系统处于动态平衡时，ES分解速度=ES生成速度,即K1ES=（K2+K3）ES,ES,ES,=,K2+K3,K1,K2+K3,K1,令Km=,则,ES,ES,=Km,设酶的总浓度为E0则游离的酶浓度为,E=E0-ES则,40,Km=,(E0-ES)S,ES,KmES=(E0-ES)S,KmES+ESS=E0S,ES=,E0S,Km+S,故v=K3,E0S,Km+S,当SE0，所有酶都被底物所饱和，即没有游离的酶存在，E0都以ES形式存在，此时反应速度达到最大值Vmax:,Vmax是一个常数，只与E0成正比关系,Vmax=K3E0则,v=,Km+S,VmaxS,41,3、米氏方程的意义,关于Km米氏常数，Km=,K2+K3,K1,各个速度常数共同决定的反应总平衡常数,v=Vmax/2时，Km=S是反应速度达到最大速度一半时的底物浓度，单位为mol/L。,、K是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。,、Km受PH值及温度等反应条件的严格控制,、如果同一种酶有几个反应底物，则它对每一种底物各有一个Km值，其中Km值最小的为该酶的最适底物。,42,关于底物常数Ks是Km的一种特殊形式，其意义与Km不同。（S=1、2、3）,Km=,K2+K3,K1,K2K3时，K3可以忽略不计,即Km=K2/K1，是中间产物ES的解离反应平衡常数，反映了E和S的亲和力的大小。,E+S,K1,K2,ES,K3,E+P,Km值大，ES易分解，E和S亲和力小,Km值小，E和S亲和力大，反应易进行,43,关于Vmax是酶的理论最大反应速度，是酶的特征性常数。Vmax=K3E0与E0成正比关系。,米氏方程描述了V与S的关系，为中间产物学说提供动力学依据。,、当SKm时，v=,Vmax,Km,S，,则S省略,Vmax,Km,为常数，V与S成直线关系，反应为一级反应。,、当SKm时，v=Vmax反应速度达到了最大值，这时反应为零级反应。,v=,VmaxS,Km+S,Km省略。,、当SKm时v与S间有复杂的动力学关系，反应介于零级与一级之间。,米氏方程与实验测得的vS关系曲线是完全一致的。,44,4、双倒数作图法求解Km和Vmax,V=,VmaxS,Km+S,取倒数,1/v=Km/VmaxS+1/Vmax,相当于y=ax+b直线斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax,以1/v对1/S作图,斜率=Km/Vmax,1/v,1/S,1/Vmax,1/Km,45,二、酶浓度对反应速度的影响,黄线：存在一定量的失活剂的曲线,在S足够大，其它反应条件一定的前提下，反应速度与酶浓度成正比关系，这是酶活力测定的依据,红线：正常的反映反应曲线,v,E,白线：含有抑制剂的曲线,绿线：底物浓度不足的曲线,紫线：有激活剂或相关酶类的曲线,46,三、pH对酶促反应速度的影响,酶活性受其环境pH的影响，在一定pH下，酶反应具有最大速度，高于或低于此值，反应速度下降，通常称此pH为酶反应的最适pH（optimumpH）,pH,相对活力,最适pH,（反应速度）,pH酶活性关系图,最适pH因底物种类、浓度及缓冲液成分不同而不同。,酶的最适pH并不是一个常数，只是在一定条件下才有意义。,47,pH影响酶活力的原因有以下几个方面：（1）过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏。引起酶构象的改变，酶活性丧失。（2）当pH改变不很剧烈时，酶虽然末变性，但活力受到影响。pH影响了底物的解离状态，或使底物不能和酶结合，或者结合后不能生成产物；pH影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响与底物的结合或催化，使酶活性降低；也可能影响到中间络合物ES的解离状态，不利于催化生成产物。（3）pH影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性。,由于酶活力受pH的影响很大，因此在酶的分离纯化时要选择酶的稳定pH，通常在某一pH缓冲液中进行。,48,四、温度对酶促反应速度的影响,最适温度,t0C,v,温度与酶反应速度的关系图,1、温度升高，反应速度加快。,2、随温度升高而酶逐步变性，即通过减少有活性的酶而降低酶的反应速度。,49,温度对酶反应的影响,一方面是温度升高,酶促反应速度加快(温度系数Q10：反应温度提高10C，其反应速度与原来的反应速度之比)。另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度(optimumtemperature)条件下,反应速度最大。酶对温度的耐受力与其存在状态有关。,50,五、抑制剂对酶促反应速度的影响,酶的失活或钝化,酶的抑制作用,可逆抑制作用,不可逆抑制作用,竞争性抑制作用,非竞争性抑制作用,酶的失活或钝化：由于理化因素的影响，破坏了酶分子的三维结构，酶蛋白变性，导致酶部分或全部丧失活性。,酶的抑制作用：酶在不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起酶的活性降低或丧失。,抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活性丧失，不能用透析、超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活，称为不可逆抑制作用。,抑制剂与酶以非共价键结合，而引起酶的活性降低或丧失，能用透析、分子筛过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活。称为可逆抑制作用。,51,Ki,1、非竞争性抑制,E+S,Ks,ES,E+P,K0,+I,EI+S,Ki,Ks,ESI,+I,S和I与酶的结合完全互不相关。S既可和游离的酶结合，也可和EI复合体结合；I可和游离的酶结合，也可和ES复合体结合。但EIS不能释放出产物。,非竞争性抑制的机制,非竞争抑制剂并不结合在酶与S结合的位点上，而在活性中心除结合基团以外的必需基团上（如催化基团）阻止酶的催化作用。,52,加入非竞争性抑制剂后，Km不变，而Vmax减小。,非竞争性抑制,53,54,2、竞争性抑制的机理,由于抑制剂与底物在结构上有类似之处（结构类似物），共同竞争酶的共同的结合位点。,I与S对酶的结合有竞争作用，互相排斥不能形成三元复合物。,E与S或I结合快慢取决于SI浓度，提高S可消除抑制,特点,竞争性抑制作用：,E+S,E+P,ES,EI,K0,Ks,+I,Ki,55,竟争性抑制作用的例子：,56,加入竞争性抑制剂后，Km变大，酶促最大反应速度不变。,竞争性抑制,57,3、反竞争性抑制,加入反竞争性抑制剂，使Km和Vmax均减小,58,59,60,可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别,1.物理方法用透析、超滤或凝胶过滤等物理方法区别。2.动力学方法在测定酶活力的系统中加入一定量的抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速率。,61,在测定酶活力的系统中加入不同浓度的抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速率。,62,六、激活剂对酶反应速度的影响,凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂（activator）。（1）无机离子：金属离子(K+Na+Mg2+Zn2+Fe2+Ca2+)、阴离子(Cl-Br-)、氢离子（2）小分子有机化合物：某些还原剂（如半胱氨酸、GSH等）、乙二胺四乙酸（EDTA）(3)某些酶类：酶原激活过程中的酶类,63,第五节几种重要的调节酶,调节酶：活性可被调节的酶，主要是别构酶和共价调节酶。一、别构酶（一）概念、特点及别构效应1、别构酶的概念通过调节因子作用使酶产生别构效应的调节酶类（又称变构酶）。2、别构效应的调控（1）别构效应：调节物（效应物）与别构酶分子中的别构中心（调节中心）结合后，诱导产生或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合催化作用受到影响，从而调节酶促反应的速度。,64,2、别构酶的结构特点和性质（1）已知的别构酶都是寡聚酶，含有两个或两个以上亚基（2）具有活性中心和别构中心（调节中心），活性中心负责底物结合和催化，别构中心负责调节酶反应速度。活性中心和别构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上。（3）多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同种效应，底物就是调节物：有的别构酶不止一个别构中心，可以接受不同的代谢物的调节。（4）别构酶由于同位效应和别构效应，不遵循米式方程，动力学曲线也不是典型的双曲线型，而是S型（同位效应为正协同效应）和压低的近双曲线（同位效应为负协同效应）。,65,（二）别构酶的动力学曲线别构酶反应，不遵循米式方程，动力学曲线也不是典型的双曲线型，而是S型（正协同效应）和压低的近双曲线（负协同效应）。1、正协同效应的别构酶是S型曲线这种S形曲线体现为，当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度，这是别构酶可以灵活地调节反应速度的原因。当增加正调节物浓度时Km减小，亲和力增大，协同性减小：当增加负调节物的浓度时Km增加，亲和力减小，协同性增大（对底物浓度的反应灵敏度增加）,66,2、同位效应为负协同效应的别构酶是近似双曲线负协同效应时酶的反应速度对底物浓度的变化不敏感（三）别构酶调节活性的机理1、序变模型：酶分子中亚基结合底物后，构象逐个地依次变化。2、齐变模型：,67,二、同工酶能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构不同的一组酶。存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞中。哺乳动物乳酸脱氢酶有5种CH3CHOH-COO-+NAD+LDHCH3COCOO-+NADH+H+均由4个亚基组成,同工酶和变构酶是两种重要的酶：同工酶是指有机体内能催化相同的化学反应，但其酶蛋白本身的理化性质及生物学功能不完全相同的一组酶；变构酶是利用构象的改变来调节其催化活性的酶，是一个关键酶，催化限速步骤。,68,三、共价修饰调节酶共价调节酶：酶分子被其它的酶催化进行共价修饰，从而在活性形式与非活性形式之间相互转变，发生可逆的共价修饰。如：糖原磷酸化酶共价调节酶的两种常见类型磷酸化去磷酸化腺苷酰化脱腺苷酰化,四、酶原的激活,1、没有活性的酶的前体称为酶原。2、酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活。3、这个过程实质上是酶活性部位形成和暴露的过程。,69,具有不可逆性。属于此类的有消化系统中的酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶）和血液凝固系统中的酶。如：,胰蛋白酶对胰脏蛋白酶原的激活,肠激酶,胰蛋白酶原胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶原弹性蛋白酶原,胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶,羧肽酶原羧肽酶,在组织细胞中，某些酶以酶原的形式存在，可保护分泌这种酶的组织细胞不被水解破坏。,70,第六节酶的分离提纯与活力的测定,一、酶活力的测定1.酶活力（enzymeactivity）：也称酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速率（reactionrate）来表示。酶反应速度：用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。单位：浓度/单位时间,71,2.酶的活力单位（U-activityunit）：酶的活力单位，即酶单位（U）在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。这样酶的含量就可以用每克酶制剂或酶毫升酶制剂含有多少酶单位来表示（单位是U/g或U/ml）。1961年，提出用“国际单位”（IU）表示酶活力，即：1个酶活力单位指在最适反应条件下(25C,最适底物浓度和最适pH），每分钟内能转化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。1IU=1mol/min。,72,3.酶的比活力：代表酶的纯度。每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数，用U/mg蛋白、IU/mg蛋白、Kat/mg蛋白表示。实质表示单位蛋白质的催化能力。,4、酶活力测定方法：通过两种方式可进行酶活力测定，其一是测定完成一定量反应所需的时间，其二是测定单位时间内酶催化的化学反应量。测定酶活力就是测定产物增加量或底物减少量，主要根据产物或底物的物理或化学特性来决定测定方法。,比活力=,酶活力（IU）,酶蛋白质量（mg）,73,（1）分光光度法（spectrophotometry）：多利用产物在紫外或可见光部分的光吸收性质，选择适当波长，测定反应过程的进行情况。简便、节约时间和样品，可以检测nmol/L水平的变化。（2）荧光法(fluorometry)：主要利用底物或产物的荧光性质。灵敏度高，但易受到干扰。（3）同位素测定法：同位素标记底物，反应后经分离，检测产物的脉冲数，即可换算成酶的活力单位。灵敏度最高。（4）电化学方法：pH计、氧电极法,74,要使反应速度在规定的时间内保持恒定不变（初速度法），或者使反应在规定的时间内完成（非初速度法），就取决于酶的浓度。,总之，对酶液进行适当的稀释就成了技术操作的关键：,在酶活力测定中，酶液的稀释倍数都必须控制在适宜的范围内。,根据酶的动力学性质，初速度是最能反映酶的真正活力。采用初速度法测定酶活2是最理想的。,酶活测定中，要求有最适PH、最适温度，此外对底物浓度和反应时间都有明确的规定。,75,酶活力的测定方法：,常规测定酶活力的操作程序为：将样品酶活适当稀释，在最适条件下进行酶促反应，通过化学分析或仪器分析的方法测定反应量。根据酶单位定义和实验数据计算出酶活力。即每毫升酶液或每克酶粉中的酶活单位数。,酶的纯度鉴定,纯化倍数=,每次比活力,第一次比活力,回收率=,每次总活力,第一次总活力,100%,76,1、酶的提取与分离纯化技术路线,2、细胞破碎,3、酶的提取,4、酶的分离方法,5、酶的组合分离纯化策略,6、酶的浓缩、干燥与结晶,二、酶的分离、纯化,77,酶的提取、分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。,78,（一）酶分离纯化的一般原则与注意事项,1、防止酶蛋白变性,2、随时测定酶活力,3、酶制剂的纯度应与使用目的相适应。,（二）分离提纯过程步骤如下：,1、选材：含酶量高、易于干燥的动植物或微生物,2、破碎细胞,3、抽提,4、发酵液预处理,5、酶液的浓缩,6、酶的粉剂和液体制剂,7、酶的精制,8、回收率、纯化倍数和纯度鉴定,9、酶制剂的保存：保存浓缩的酶液；冰冻干燥；浓缩的酶液加入等体积甘油于-200C长期保存。,79,细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎,80,酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有