（临床医学专业论文）sirt1在肺动脉高压血管重塑中的作用和机制研究.pdf

目录 e jj i e i 摘要1 a b s 仃a c t 。3 前言5 l 肺动脉高压预后差，治疗难5 2 肺动脉平滑肌细胞增殖与肺动脉高压5 2 1 血管平滑肌增殖是血管重塑的重要细胞学基础5 2 2 肺血管重塑与肺动脉高压的发生、发展密切相关6 3 血管平滑肌细胞周期及其调控6 3 1 血管平滑肌细胞的增殖周期6 3 2 细胞周期调控7 4k + 通道蛋白与肺动脉平滑肌增殖以及p a h 的关系。8 5s i r t l 在肺动脉平滑肌增殖，肺动脉高压发生、发展中可能发挥的作用9 6s i r t l 是否能抑制肺动脉平滑肌增殖并延缓肺动脉高压的发生、发展是本研究的重点l o 实验材料1l 1 病毒1l ：! 细胞1l 3 实验用大鼠及饲料1l 4 酶罗乓11 5 其他主要试剂：11 6 实验用抗体1 l 7 主要仪器设备1 2 实验方法13 1 人肺动脉平滑肌细胞( hp ：a s m c ) 培养与腺病毒感染1 3 1 1 人肺动脉平滑肌细胞传代培养1 3 1 2 人肺动脉平滑肌细胞的冻存13 1 3 人肺动脉平滑肌细胞的复苏1 3 1 4 人肺动脉平滑肌细胞的腺病毒感染1 3 1 5 人肺动脉平滑肌细胞同步化处理1 4 2 重组腺病毒的制备1 4 2 1 建立备用病毒1 4 2 2 重组腺病毒的生产1 4 2 3 病毒纯化15 2 4 重组腺病毒质量检测：二：j 15 3r ，r - p c r 1 6 3 1r n a 提取16 3 2 逆转录p c r ( r t p c r ) l6 3 3r e a l t i m ep c r 16 4w e s t e mb l o t 。17 4 1 细胞蛋白提取17 4 2 蛋白质浓度测定。l7 4 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 18 4 4 抗原抗体反应18 4 5 辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白( e c l 反应) 18 4 6 溶液配制：19 5 流式细胞仪检测细胞周期1 9 6 肺动脉高压大鼠模型的建立1 9 6 1 试剂的准备1 9 6 2 模型的建立2 0 7 大鼠血流动力学的检测2 0 8 组织器官的采集和保存2 1 9 组织蛋白提取2 1 l o 组织切片、h e 染色和免疫组化一2 1 1 0 1 组织切片2 l 1 0 2h e 染色及形态学分析2 2 lo 3 免疫组化( 二步法) 2 2 1o 4e v g 染色2 3 10 5t u n e l 染色2 3 l l 统计学方法2 4 实验结果2 5 l 血小板源生长因子诱导人肺动脉平滑肌细胞内源性s i i 玎l 的表达动态改变2 5 2s i r t l 促进人肺动脉平滑肌细胞增殖周期的阻滞2 6 2 1 过表达s i r t l 引起h p a s m c sg o g 1 期阻滞一2 6 2 2s i r t l 影响了h p l a s m c s 中g 1 期相关周期蛋白的表达2 6 2 2 1 过表达s i r t l - 卜调hp ：a s m c s 中c y c l i n d l ，c y c l i n e ，c d k 2 的表达，上调p 2 1 的表 j 鑫 ：1 6 2 2 2s i r t lr n a i 上凋h p a s m c s 中c y c l i n d l ，c y c i i i l e ，c d k 2 的表达，下调p 2 l 的表 i 鑫 ：2 8 3s i r t l 抑制了p d g f b b 对h p a s m c s 中k v 通道k v l 5 和k v 2 1 的+ f 调2 9 4r e s v e r a n o l 卜调h p a s m c s 中c y c l i n d l ，c y c l i n e ，c d k 2 的表达，上调p 2 1 ，k v l 5 和k v 2 1 的表达一31 5s i r t l 的激活剂r e s v e r a t r o i 能增加m c t 诱导的p a h 大鼠肺组织s l r t l 、p 2 1 、k v l 5 和 k v 2 1 的表达，抑制p a h 的发展一3 4 5 1 野卣合碱诱导的肺动脉高压大鼠模型中，肺组织中s i r t l 的表达水平明显降低一3 4 5 2r e s v e r a t r o l 改善了p a h 大鼠肺血流动力学3 5 5 3r e s v e r a t r o l 抑制肺动脉的重塑3 7 5 3 1r e s v e r a t r o i 抑制肺肌性动脉中膜增厚：3 7 5 3 2r e s v e r a t r o l 抑制肺非肌性小动脉的肌化：3 9 5 3 3r e s v e r a t m l 未引起肺小动脉中凋亡细胞数量的显著改变4 1 5 4r e s v e r a t r o l 明显增加了模型鼠肺组织中s l r t l ，k v l 5 和k v 2 1 ，p 2 l 的表达4 3 讨论4 6 l 选择h p a s m c s 作为研究对象的原冈：作用关键，机制不清，提供新治疗靶点4 6 2s i r t l 抑制h p a s m c s 增殖，进而改善肺血管重塑的可能性4 6 2 1s i r t l 抑制h p a s m c s 增殖4 6 2 2r e s v e r a t r o l 抑制h p a s m c s 增殖，改善m c t 诱导的p a h 肺血管重塑的作用与s l r t l 的相关性_ 4 7 2 3 本实验中，r e s v e r a l m l 的剂量与其效应之间的关系4 8 3s i r t l 抑制h p a s m c s 增殖的机制一4 9 3 1s i r t l 抑制细胞周期蛋白4 9 3 2s i r t l 从转录水平增加k + 通道的表达4 9 4 本研究的不足与展望5 0 d 、结5 2 参考文献5 3 文献综述5 9 英文名词及缩写6 8 至 【谢7 0 摘要 背景：肺动脉高压是一种不同病因所致肺动脉阻塞，进而引起肺血管阻力增加， 最终导致右心衰竭的临床综合征，其进展迅速，预后甚差。现有治疗手段很难阻 止更无法逆转疾病的进展，因此p a h 目前仍然无法治愈。肺血管重塑是肺动脉高 压的显著病理学改变，肺动脉平滑肌增殖是肺血管重塑的关键所在，亦是阻止和 逆转p a h 进程的关键所在。目前对肺血管重塑发生、发展过程中肺动脉平滑肌增 殖所涉及的分子事件还知晓甚少。 目的：研究i i i 类去乙酰化酶s i r t l 对肺动脉平滑肌增殖，肺血管重塑的影响。 方法：首先选用人肺动脉平滑肌细胞( h p a s m c s ) 作为研究对象，首先应用r e a l t i m e p c r 和w e s t e r nb l o t 检测了p d g f - b b 诱导时h p a s m c s 中s i r t l 的表达变化；进一步流 式细胞术检测s i r t l 在体外对细胞周期的影响；随后过表达和干扰s i r t l ，通过 r e a l t i m ep c r 和w e s t e r nb l o t 观察基础水平和p d g f b b 诱导后s i r t l 对细胞周期蛋 白，k + 通道蛋白表达水平的影响。其次，建立野百合碱( m c t ) 诱导的大鼠p a h 模型， 用s i r t l 的激活剂r e s v e r a t r o l 进行干预，用漂浮导管检测大鼠肺动脉压力；采用 h e 染色、免疫组化、e v g 染色、t u n e l 染色等方法观察模型鼠中膜增厚，血管平滑 肌细胞增殖，动脉中凋亡细胞数；通过r e a l t i m ep c r 和w e s t e r nb l o t 观察p a h 大 鼠肺组织中s i r t l ，细胞周期蛋白，k + 通道蛋白等的表达变化以及r e s v e r a t r o l 干预后这些分子的表达变化。 结果：p d g f b b 刺激引起h p a s m c s 中s i r t l 的m r n a 和蛋白水平出现先降低后增加的 动态改变。过表达s i r t l 可以将p d g f b b 诱导的h p a s m c s 阻滞在g l 期。过表达s i r t l 抑制p d g f b b 诱导的h p a s m c s 中k v l 5 和k v 2 1 的m r n a 水平的下调。过表达s i r t r f 调h p a s m c s 中周期蛋白c y c l i n d l ，c y c l i n e ，c d k 2 的表达，上调p 2 1 的表达；s i r t l r n a i 上调h p a s m c s 中c y c l i n d l ，c y c l i n e ，c d k 2 的表达，下调p 2 1 的表达。 r e s v e r a t r o l 下调c y c l i n d l ，c y c l i n e ，c d k 2 的表达，上调p 2 l 的表达，s i r t l 介 导了r e s v e r a t r 0 1 的这种作用。m c t 诱导的p a h 大鼠肺组织中s i r t l 、k v l 5 和 k v 2 1 ，p 2 1 的表达明显降低，r e s v e r a t r 0 1 干预减少s i r t l 、k v l 5 和k v 2 1 ，p 2 1 的 降低，同时改善了肺小动脉中膜增厚、非肌性动脉的肌化，降低了肺动脉压力。 结论：在细胞水平，p d g f b b 增加h p a s m c s 中细胞周期蛋白c y c l i n d l ，c y c l i n e ， c d k 2 的表达，降低p 2 1 、k v l 5 和k v 2 1 的表达。s i r t l 可以下调c y c l i n d l ，c y c l i n e ， c d k 2 的表达，上调p 2 1 、k v l 5 和k v 2 1 的表达。将h p a s m c s 阻滞在g l 期，抑制 h p a s m c s 增殖。s i r t l 介导了r e s v e r a t r 0 1 对细胞周期蛋白c y c l i n d l 、c y e l i n e 、 c d k 2 、p 2 l 的调控。在动物水平，r e s v e r a t r 0 1 能增加m c t 诱导的p a h 大鼠肺组织 s i r t l 、k v l 5 、k v 2 1 和p 2 1 的表达，抑制p a h 的发展。 关键词：肺动脉高压，s i r t l ，r e s v e r a t r o l ，肺动脉平滑肌增殖 2 a b s t r a c t r a t i o n a l e ：p u l m o n a r ya n e r i a lh y p e r t e n s i o n ( p a h ) i sah e t e r o g e n o u ss y n d r o m ei n w 陆c hp u l i i l o n 砒ya n 耐a 1o b s m l c t i o ni n c r e a u s e sp u l m o n a r yv a s c u l a rr e s i s t a n c e ，w h i c h l e a d st 0r i g h tv e n t r i c u l a r ( r v ) 筋l u r e d e s p i t ea g g r e s s i v et r e a ：缸1 1 e n t s ，t 1 1 em o r t a j 埘o f p a hr e m a i l l sh i 曲c u n e mt l l e r 印i e sc 锄h a r d l yp r e v e n t 舶忸p r o 铲e s s i o no fp a h v 弱c u l a rr e i n o d e l i n gi sm ek e yp a n l o l o g yo fp a h p r o l i f e 豫c i o no fp u l m o m l 巧a r t e r i 以 s m o o t l lm u s c l ec e l l s ( p a s m c ) i s 吐i ec y t o l o 百c a lb a s i so fv a s c u l a rr e m o d e l i l l g 1 n l l i b i t i o no fp a s m c p r o l i f e m t i o nm i g h tc o n t r i b u t et ot l l er e 铲e s s i o no fp a h o b j e c 伽e ：t oi n v e s t i g a t e 也er o l eo fs i r t l ，ac l a s si i i1 1 i s t o n ed e a c e t y l a s e ，i nt h e r e g u l a t i o no fh 啪a l lp u l m o n a 巧a r t e r i a ls m o o lm u s c l ec e l l s ( h p a s m c s ) p r o l i f e r a t i o na i l dv a s c u l a rr e m o d e l i n gi nm o n o c r o t a l i n ei n d u c e dp a h r a t s m e t h o d s ：w i t hr e a l t i m e - p c ra i l d 、s t e mb l o t ，w ee x a m i n e dt h ee x p r e s s i o no f s i r t1i i lh p a s m c ss t i m u l a t e d 谢t i lp d g f b b f c m w 舔印p l i e dt 0d e t e c tt h e e 仃e c t so fs 瓜t 1o nh p a s m c sp r o l i f e r a t i o ni nv i 们a r e ro v e r - e x p r e s s i o no fr n a i t 0s i r t l ，e x p r e s s i o no fc e nc y c l ep r o t e i nw h i c h 允n c t i o n si ngls t a t e ，p o t a s s i 眦l c h 锄e l sp r o t e i n si n c l u d i n gk - v 1 5a i l dk v 2 1 、e r ee x 锄i n e db y 、e s t e mb 1 0 to r r e a l t i m e - p c r f u i r t h e n l l o r e ，r a t sw e r e e c t e dw i t hm o n o c r o t a l i n e ( m c t ) t od e v e l o p e d 。 p u l m o n a r ya n e r i a lh y p e n e n s i o na n dr e s v e r a t m l ( 2 5m 埏p e rd a y o r2 0m g l c gp e rd a y ) w 雒f e e d e do m l l y w bi n v e s t i g a t e dt h ee 所c a c yo fr e s v e r a t r o lt op r e v e n t 仃o m d e v e l o p i n gp u l m o n a r ya r t e r i a lh y p e r t e n s i o nb yh e m o d y n 锄i c s ，h es t a i l l i n 岛 i m m u l l o h i s t o c h e m i s 仃y ，e v gs t a i n i n ga n dn 烈e la s s a y a tl a s t ，t l l ee x p r e s s i o i l so f s i r t l ，k v l 5 ，k v 2 1a n dp 2 1 i nt l l el u n g so f r a t sw e r ed e t e c t e db yr e a l t i m e p c ro r 、v e s t e mb l o t r e s u l t s ：w ef o 岫dt h a tt h ee x p r e s s i o no fs i r tli nh p a s m c sd e c r e a s e da r e r p d g f - b bs t i m u l a t i o n a d e n o v i r a lo v e r e x p r e s s i o no fs i r t1i n l l i b i t e dh p a s m c s p r o l i f e r a t i o na n dl e dt oa i l 硼r e s to ft i l ec e l l si 1 1p h a s eg 1 i na d d i t i o n ，s i r t l d e c r e a l s e dt h ee x p r e s s i o no fc y c l i n d1 ，c y c l i n e ，c d k 2 ，i n c r e a s e dt h ee x p r e s s i o no f 。 p 2 l ，t h eg 1 p h a s er e g u l a t o 巧p r o t e i n m e a n w h i l e ，s i r t li n c r e a s e dt h ee x p r e s s i o no f k v l 5a i l dk v 2 1 m o r e o v e r ，r e s v e r a 仃a o l ，s i r t la n g o l l i s tc o u l da n e n u a tm c t i n d u c e dp u l m o n a r ya r t e r i a lr e m o d e l i n ga n di n c r e a s e ds i r t l ，k v l 57k v 2 1a 1 1 dp 2l i nt h el m l g so fr a t s ，w h i c hl e a dt oi m p m v e m e mo fp u l m o n a d ，a n e r i a lh y p e i r t e n s i o n c o n c i u s i o n ：o u rs t u d i e ss h o wt h a ts i r tld e c r e a s e st 1 1 ee x p r e s s i o no fc y c l i n d l ， c y c l i n ea n dc d k 2 ，i n c r e a s e st h ee x p r e s s i o no fk v l 5a n dk v 2 1 ，w h i c hr e s u l ti n 3 i n h i b i t i o no fh p a s m c s p r o l i f e r a t i o n r e s v e r a 缸a o l ，t l l ea i l g o i l i s to fs i r t l ，e x e r t s 锄t i p r o l i f e r a t i v ee f f e c t si i lt l l ep u l m o n a 巧a r t e r i e s ，w h i c hm a yc o m r i b u t et 0t l l e p r e v e n t i o no fp u l m o n a r ya r t e r i a lh y p e r t e n s i o n k e yw o r d s ：p u l m o n a d r 砒e r i a lh y p e r t e n s i o n s i r t1 r e s v e r a t r o l p r o l i f e r a t i o n 4 前言 1 肺动脉高压预后差，治疗难 肺动脉高压( p u l m o n a r ya r t e r i a lh y p e r t e n s i o n ，p a h ) 是由不同病因引起 的，以肺动脉压力和肺血管阻力升高为特征的一组病理生理综合征。p a h 既可 以是多种疾病进展过程中必经的一个阶段，又可以是独立存在的一个疾病，常 导致右心衰竭，引起死亡。p a h 进展迅速，预后甚差，严重危害人类生命健康。 p a h 若在确诊后不予以治疗，患者的生存期仅为2 3 年1 。p a h 同样是结缔组织 病( c o n n e c t i v et i s s u ed i s e a s e s ，c t d ) 的重要并发症，是导致c t d 患者死亡 的重要原因之一，近年得到了风湿学界的极大关注。虽然p a h 的治疗在过去十年 有引人注目的进展，在积极干预下大多数患者的生存期得以延长。但是，现有的 治疗手段难以阻止更无法逆转疾病的进展，p a h 目前仍然无法治愈。因此，探索 p a h 的新发病机制不仅具有十分重要的科学意义，并且能从新的层面提供治疗靶 点，对p a h 的治疗具有十分重要的战略意义。 2 肺动脉平滑肌细胞增殖与肺动脉高压 2 1 血管平滑肌增殖是血管重塑的重要细胞学基础 血管重塑( v a s c u l a rr e m o d e l i n g ) 是指机体在生长、发育、衰老和疾病过程 中血管为适应体内外环境的变化而发生的形态结构和功能的改变。血管重塑包括 组份不变的重排( v a s c u l a rr e a r r a n g e m e n t ) 和结构、功能变化的重建( v a s c u l a r r e c o n s t r u c t i o n ) 。根据血管重塑过程中血管管腔内径的改变，血管重塑分为管 腔内径缩小的内向性重塑和管腔内径增大的外向性重塑；根据重颦是否引起血管 中膜横断面积的变化分为：肥厚性重塑：表现为血管中膜增厚突入管腔，中 膜横断面积增加，中膜腔径比值增加；中膜正常性重塑：表现为血管外径和 腔径均减少，中膜横断面积不变，而中膜腔径比值增加；萎缩性重塑：表 现为血管中膜变薄，中膜横断面积减小，中膜腔径比值减小。 血管平滑肌细胞位于大动脉内弹力膜下的血管中层，在正常机体内通过其收 缩功能调节血管管腔直径，机体血压以及全身的血流分布。血管平滑肌细胞在形 态上有两种表型：一类为收缩型静止型，细胞浆内有广泛的肌动蛋白和肌球蛋 白组成的肌纤维丝，具有良好的收缩功能；另一类为合成型，含有较多的糨面内 质网，线粒体和游离核糖体，仅含少量肌丝，无收缩功能，其作用为合成、分泌 细胞外基质和分裂、增生2 。在血管形成过程中，血管平滑肌细胞表现为合成型， 参与血管壁的形成。分化成熟的动脉中层血管平滑肌细胞正常情况下是静止的， 以收缩型为主，增殖速度极慢，通过舒一缩功能维持血管壁的紧张性。但成熟的 血管平滑肌细胞仍保持了高度的可塑性，在受到外来刺激如生长因子刺激或机械 损伤后，可以发生迅速而可逆的表型变化，由收缩型变为合成型，恢复增殖能力， 移行至内膜，并在此处迅速增殖，分泌细胞外基质，修复损伤的血管3 。如果血 管平滑肌细胞过度增生，则导致血管重塑、管腔狭窄，发生血管增殖性疾病。已 证实许多血清中含有的生长因子能够促进平滑肌的迁移和增殖，如血小板源性 生长因子( p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r ，p d g f ) 、胰岛素样生长因子一l ( i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r l ，i g f 一1 ) 、碱性成纤维细胞生长因子( b a s i c f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ，b f g f ) 、转化生长i 萎l 子一b ( t r a n s f o r m i n gg r o w t h f a c t o r b ，t g f b ) 、血管紧张素i i ( a n g i o t e n s i ni i ) 等。 2 2 肺血管重塑与肺动脉高压的发生、发展密切相关 肺血管收缩、肺血管重塑和肺血管原位血栓形成是p a h 发生发展的3 个重要病 理生理基础4 。现有的治疗手段，如内皮素受体拮抗剂、钙离子拮抗剂、前列环 素等主要是通过抑制肺血管收缩，促进肺血管舒张，主要以降低肺血管阻力而达 到起到减轻症状的效果5 。而要想有效地阻止进而逆转疾病的进展，改善整体预 后，必须从p a h 发生发展的病理生理过程的多个层面进行干预。肺血管重塑在肺 动脉高压的形成过程中起到了关键的作用，主要表现为肺动脉平滑肌( p u l m o n a r y a r t e r i a ls m o o t hm u s c l 色c e 儿) 增殖，肌型血管中膜增厚，非肌型血管肌化，成 纤维细胞和胞外基质合成增多等。由一系列复杂的分子和细胞机制导致的肺动脉 平滑肌增殖是肺血管重塑的关键所在，亦是阻止和逆转p a h 进程的关键所在。然 而事实上，我们对肺血管重塑发生、发展过程中肺动脉平滑肌增殖所涉及的分子 事件还知晓甚少。 3 血管平滑肌细胞周期及其调控 3 1 血管平滑肌细胞的增殖周期 正常连续分裂的细胞从上次有丝分裂结束开始，经过物质积累过程，直到下 一个细胞分裂结束为止，称为一个细胞周期( c e l lc y c l e ) 。在两次细胞有丝分裂 之间的这段时期称为静止期( i n t e r p h a s e ) ，又称g 0 期。真核细胞的细胞周期一般 可以分为4 个时期，即g l 期、s 期、g 2 期和m 期。目前对细胞周期的研究表明，细 胞周期不同时相间存在关键的检验点( c h e c kp o i n t ) ，决定细胞是含继续增生或 6 进入静止状态。哺乳动物细胞周期中有3 个检验点，分别位于g 0 g l 、g 1 s 、g 2 m 期。其中最重要的检验点是g 1 s 期检验点，又称为限制点( r e s t r i c t i o np o i n t ， r 点) 6 。细胞在该点对复杂的细胞内外信号进行整合和传递，如血清中的各类生 长因子和有丝分裂原等，决定细胞继续增殖、还是恢复静止进入g 0 期，或者发生 凋亡。 3 2 细胞周期调控 细胞周期活性的控制机制主要通过以下三种蛋白进行调控：周期蛋白依赖性 蛋白激酶( c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e ，c d k ) ，周期蛋白( c y c l i n ) ，周期蛋白依赖 性蛋白激酶抑制因子( c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o r ，c k i ) 。 周期蛋白作为参与细胞周期正性调节的蛋白质家族，是c d k 激酶的活性辅助 因子。周期蛋白的分类特征是周期蛋白盒( c y c l i nb o x ) ，它是一个含有大约1 0 0 个氨基酸的保守结构域，周期蛋白与相应的c d k 结合都是通过周期蛋白盒进行的 7 。c y c l i n 在细胞周期调节中的主要作用为：1 确定亚细胞结合位点；2 决定底 物的特异性；3 与上游调节蛋白结合；4 c d k 激活的限速物质8 。 有活性的c d k 是由一个c d k 亚基、一个活性亚基和几种周期蛋白组成的不均一 二聚体。在细胞周期进程中，不同的周期蛋白一c d k 复合物被活化，它的活性受 c y c l i n 的水平，c k i 的表达及磷酸化修饰等多种调控。迄今为止发现的哺乳动物 的c y c l i n 有8 种，其中研究较多的与血管平滑肌增殖关系密切的是c y c l i n d 、 c y c l i n e 和e y c l i n a 。 c y c l i n d 在细胞周期中最早被合成，于g 1 中期到达高峰，与c d k 4 c d k 6 形成复 合物，对决定g 1 s 期转换的限制点进行调控。在早g 1 期，c y c l i n d c d k 4 c d k 6 复 合物聚集起来，同时增殖细胞核抗原( p r 0 1 i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n ， p c n a ) ，一种能够刺激d n a 聚合酶6 活性的蛋白的水平也升高9 。p c n a 也和 c y c l i n d c d k 4 复合体直接作用1 0 。抑制蛋白p 2 7 的表达量降低和与 c y c l i n d c d k 4 p c n a 复合体的四聚体化，会造成c y c l i n d c d k 4 p c n a 复合体被c d k 激酶磷酸化和c d k 2 的酶活性上调，进而和c y c li n e 和c y c l i n a 形成复合体进入晚g l 期。有活性的c y c l i n d c d k 4 c d k 6 复合物可以磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白 ( r e t i n o b l a s t o m a ，r b ) ，从而释放e 2 f ，促进细胞周期进行。e 2 f 是一类d n a 结合 蛋白，能够调控细胞周期中s 、g 2 、m 期所必须的蛋白的表达，如二氢叶酸还原酶、 p c n a 、c d k l ，c y c l i n a 以及c y c l i n e 。在g 1 期开始阶段，r b 蛋白是以非磷酸化形 式存在，其与e 2 f 蛋白结合，抑制e 2 f 的转录活性，阻断细胞周期进程。c y c l i n e 结合并激活c d k 2 ，目前己证实c y c li n e c d k 2 复合物是g 1 s 期转换的关键调节因 子，是细胞进入s 期的限速物质， 其功能与c y c l i n d c d k 4 c d k 6 复合物没有重 叠。c y c l i n a 作用复杂，在s 期、g 2 期、m 期都有活性，在s 期与c d k 2 结合，在g 2 m 期与c d c 2 结合，是s 期顺利进行启动d n a 复制所必须的因子。同时它对g 1 s 交界区 也有调节作用。过表达c y c l i n a 可以使处于g l 期阻滞的细胞越过r 点进入s 期。 目前发现的c k i 按结构和功能分为两大类：一类为i n k 4 家族( i n h i b i t i o no f c d k 4 ) ，包括p 1 6 i n k 4 a 、p 1 5 i n k 4 b 、p 1 8 l n k 4 c 和p 1 9 i n l 【4 d ，其蛋白结构均具有4 个回文重 复序列，特异性抑制c y c l i n d - c d k 4 c d k 6 的磷酸化激酶活性；另一类为c i p k i p 家族( c d k i n t e r a c t i n gp r o t e i n k i n a s ei n h i b i t i o np r o t e i n ) ，包括p 2 1 c i p l 、 p 2 7 k i p l 和p 5 7 k i p 2 ，它们在c 一末端有一核定位信号，在n 一末端具有高度的结构和功 能相似性，特异性抑制c y c l i n d l 一c d k 4 c d k 6 、c y c l i n e c d k 2 、c y c li n a c d k 2 的蛋 白激酶活性。目前在v s m c 中研究较多的是p 2 7 和p 2 1 4f 通道蛋白与肺动脉平滑肌增殖以及p a h 的关系 k + 通道是一种四聚体的跨膜蛋白，具有一个对k + 高度选择性的孔隙，使k + 顺细 胞内外的浓度梯度1 4 5 5 姗0 1 l 缓慢外流。k + 通道类型包括：电压门控k + 通道( k v ) 、 内向整流k + 通道( k i r ) 、钙敏感型k + 通道( k c a ) 。k v 含有一个电压传感器，即能受 膜电位调节又参与血管平滑肌细胞膜电位的形成。细胞膜电位可以通过调节大电 导电压门控钙通道控制血管张力。抑制或下调k + 通道会导致细胞内k + 的积累，引 起细胞膜去极化，导致电压门控l 型钙通道的激活，促使细胞内的c a 抖增加，引 起收缩。通过调节细胞内k + 和c a 2 + ，k + 通道也调节细胞增殖和凋亡，进而影响血管 重塑1 2 。 p a s m c 表达多种类型k + 通道，包括k v ，而k v 有9 个家族( k v l 9 ) ，每个家族 都有许多成员。研究发现：k + 通道下调可以促进p a s m c 增殖，抑制凋亡，这个机 制参与了阻塞性血管重塑。在p a s m c 中每时每刻都有许多通道处于激活状态，因 此即使利用膜片钳，这种单细胞电生理技术，也很难确定某一特定的k + 电流的分 子起源。但是，a r c h e r 等利用抗k v 通道的抗体证明，在正常大鼠p a s m c 中k v l 5 和k v 2 1 是整个细胞k + 电流形成的重要组成部分1 3 。k v l 5 在肺循环系统的表达量 是沿血管的分支呈纵向增加的，其在p a h 的主要病变部位，阻力动脉的表达量最 大1 2 。目前，在p a h 模型大鼠和p a h 患者中，均发现了k v 表达和活性的下调，尤其 是k v l 5 。缺氧导致的急性k v l 5 抑制被认为是缺氧性肺血管收缩的启动因素 1 5 1 6 。能诱发p a h 的食欲抑制药如右芬氟拉明显著抑制p a s m c 的k v l 5 和k + 电流。研 究发现k v 2 1 在大鼠p a s m c 静息膜电位形成中的作用较k v l 5 关键。，但迄今为j 卜， 对k v 2 1 的了解仍不多。有意思的是，右芬氟拉明同样能抑制p a s m c 中的k v 2 1 。 目前的观点认为：增强k v 通路，可以扩张肺血管，逆转肺血管重塑过程。冈 此，以k + 通道作为p a h 新治疗靶点的研究正在进行中，并且已经发现有些药物如 8 二氯乙酸和西地那非可以增加k + 通道的表达和功能。 ： 5s i r t l 在肺动脉平滑肌增殖，肺动脉高压发生、发展中可能发挥 的作用 乙酰化和去乙酰化调节是蛋白活性调节的一种重要的形式，通过乙酰化或去 乙酰化，可以改变染色质结构或是转录因子的活性，调控基因的表达1 8 。一般来 说，组蛋白乙酰转移酶( h a t s ) 和组蛋白去乙酰化酶( h d a c s ) 决定蛋白乙酰化状态。 h d a c s 通过去乙酰化修饰转录因子抑制其转录活性或通过转录因子被募集到靶 基因时，使核小体上组蛋白乙酰化而促进染色质浓集，影响染色质高级结构，抑 制转录。到目前为止，已经发现三类h d a c s 。迄今为止研究的所有物种中，除极 少数原核生物外，都发现了i i i 类h d a cs i r 2 的同源基因，且这些基因的保守性很 强1 9 。在哺乳动物中有7 个s i r 2 同源基因，分别命名为s i r t l 到s i r t 7 ，其中 s i r t l 与s i r 2 的同源性最高1 9 ，研究也最为深入。人的s i r t l 定位于第1 0 号染 色体的q 2 1 3 ，基因长度3 3 k b ，编码7 4 7 个氨基酸残基的蛋白质，它在d n a 损伤 修复、细胞周期控制、抑制细胞凋亡、抵抗氧化应激和延长细胞寿命方面起着重 要作用。s i r t l 的这些作用是通过调节一些重要的转录因子、转录辅因子及组蛋 白实现的。 总体说来，在哺乳动物中，s i r t l 在能量限制和其它