（体育教育训练学专业论文）不同应力对大鼠骨代谢影响的实验研究.pdf

不同应力对大鼠骨代谢影响的实验研究 陈一冰 摘要力学刺激影响骨代谢在多个方面得以证实：运动可以促进骨形成，低应 力状态导致骨量减少，目前具体分子机制尚不十分清楚。本研究建立大鼠去势骨 质疏松及尾吊低应力刺激的动物模型，通过应用骨密度、生物力学检测、血尿生 化、免疫组化、形态计量学、细胞培养、细胞凋亡检测等研究手段，探讨不同力 学刺激对大鼠骨代谢的影响及分子机制。本研究主要包括以下内容： ( 1 ) 2 4 只雌性s d 大鼠随机均分为对照组( c o n ) 、单纯去势组( o v x 9 与去势后运 动组( o v x + e x ) ，每组8 只。o v x 组与o v x + e x 组均行手术双侧卵巢切除。c o n 组 为假手术组。o v x + e x 组大鼠在大鼠专用跑台上被动运动，持续1 0 周。术后1 0 周 处死大鼠做生化指标检测以及骨组织1 r t q f - a 、b m p - 2 、i l 广6 免疫组化染色。对左侧 股骨进行骨密度( b o n em i n e r a li k 璐i t y , b m d ) 测定。对股骨髓腔内细胞进行培养 并对成骨细胞o p g 基因表达进行检测。 ( 2 ) 3 0 只5 月龄雄性s d 大鼠，随机均分为运动组与对照组。运动组大鼠在大鼠专 用跑台上被动运动，持续8 周。8 周处死大鼠做生化、骨密度、i g f - 1 免疫组化染色 以及细胞凋亡检测。 ( 3 ) 3 0 只体重为2 3 5 - + 2 0 9 的5 月龄雄性s d 大鼠，随机均分为对照组、尾吊低 应力刺激组、平台运动高应力刺激组。尾吊组大鼠笼内饲养将其尾部悬吊后肢悬 空不负重。运动组大鼠实验开始后在大鼠专用跑台上被动运动持续6 周。对股骨 进行形态计量学测定，对股骨髓腔内细胞进行成骨培养并对成骨分化相关指标以 及细胞凋亡进行检测。 结果： ( 1 ) o v x 组大鼠骨转换的指标显著高于对照组，o v x + e x 组与c o n 组比较 无统计学差异。o v x 组t n f - a 、i l - 6 、b m p 2 阳性染色强度显著高于u o n 组 ( p 司o 0 5 ，0 0 5 ，o 0 5 ) ，o v x + e x 组与c o n 组相比1 n f - a 、i l 6 、b m p - 2 阳性 染色强度差异无显著性意义。与o v x 组比较，o v x + e x 组1 n f a 、，6 、b m p 2 表达水平均显著下调( p 0 0 1 ，0 0 5 ，0 0 5 ) 。o v x 组o p g 表达显著低于c o n 组及 o v x + e x 组( p 0 0 5 ，0 0 5 ) ，o 、，) ( + e x 组与c o n 组无统计学差异 ( 2 ) 运动组血钙、尿钙肌苷与对照组比较无统计学差异运动组血岫、b g p 显著高于对照组( p 0 0 5 ，0 0 1 ) 。运动组b m d 高于对照组( p m 0 5 ) 。运动组i g f - 1 阳性染色强度高于对照组( p 0 0 1 ) 。运动组大鼠骨细胞凋亡显著低于对照组 ( p 0 ( ) 5 ) ( 3 ) 运动组a 】l p 比活性、b g p 水平均高于对照组，尾吊组与对照组比较a l p 比活性无统计学差异。b g p 水平在尾吊组明显低于正常对照组，成骨样细胞凋亡 正常组与运动组无明显差异，尾吊组凋亡率显著高于对照组。 实验得出以下结论： ( 1 ) 去势导致大鼠骨吸收增强，骨转换加快，骨密度降低。运动对去势后大鼠 的骨吸收增强和骨转换加快有抑制作用，减轻骨质疏松的发生程度和预防骨量丢 失。 ( 2 ) 卵巢切除后骨髓微环境中t n f - a 、b m p 2 、i d 6 、o p g 高表达，运动对去 势后骨组织中上述细胞因子表达增加起下调作用。 ( 3 ) 运动可以增加骨量和骨组织生物力学强度，高应力刺激抑制骨细胞凋亡。 低应力刺激诱导成骨细胞凋亡增加而影响骨代谢。 关键词：运动大鼠骨代谢骨质疏松卵巢切除骨密度骨细胞成骨细胞 骨保护素生物力学免疫组织化学骨形态计量学凋亡 n t h ee f f e c to fd i f f e r e n ts t r e s so nb o n em e t a b o l i s mo fr a t c h e ny i - b i n g a b s t r a c t ：m e c h a n i c ss t i m u l a t i o ni n f l u e n c i n gt h eb o n em e t a b o l i s mw a sp r o v e di n m a n yw a y s e x e r c i s ec o u l di n c r e a s et h eb o n ef o r m a t i o na n do s t e o p e n i ao c c u r r e di n l o w e rs t r e s ss t a t e , h o w e r e r , i ti sn o tt o t a l l yc l e a ra b o u ti t sm o l e c u l a rm e c h a n i s m i nt h i s s t u d y , o v a r i c c t o m i z e dr a ta n dt a i l - s u s l e n dl o w e rs t r e s ss t i m u l a t i o n ( d i s u s e - d i s ) m o d e l w e r ee s t a b l i s h e dt oe x p l o r et h er o l eo fd i f f e r e n ts t r e s so nb o n em e t a b o l i s ma n di t s r e l a t e d m e c l m i s mw j t ht h em e t h o di n c l u d i n gb o n em i n e r a ld e n s i t y , b i o c h e m i c a lt e s t i n g o fs e r u m , c e l lc u l t u r e , h i s t o m o r p h o m e t r i cp a r a m e t e r s ，i m m u n o c h e m i c a ls t a i n ，a p o p t o s i s t e s t i n g 1 n b ee x p e r i m e n t sw e r ed e s i g n e da sf o l l o w s ：( 1 ) t w e n t y f o u rf e m a l er a t sw e r e d i v i d e di n t o3g r o u p s ：( 1 ) n o r m a lc o n t r o l ( c o n ) ；( 2 ) o v a d e c t o m i z e dm o d e l ( o v x ) ；( 3 ) o v a r i c c t o m i z e dm o d e lw i t he x e r e i s e ( o v x + e 】【ln eo v a r i e t o m yw a sp e r f o r m e di n o v xa n do v x + e x r a t si no v x + e xg r o u pw e r et r a i n e do i lat r e a d m i l l 皿er a t s w e r es a c r i f i c e da t1 0w e e kp o s t o p e r a t i v e l ya n db i o c h e m i c a lt e s t i n go fs e r u m c o n c e n t r a t i o 璐o fi o n i z c dc a l c i u m , a i 卫b g pa n du r i n ec o n c e n t r a t i o n so fc a l c i u m ， c r e a t i n i n e ，h o pw a sp e r f o r m e dt oe v a l u a t et h es t a t u so fb o n et u r n o v e r b m p - 2 , i l - 6a n d t n f ap r o t e i n si nt r a b e t a d a rb o n eo fp r o x i m a lf e m u rw e r ee x a m i n e db yu s i n g i m m u n o c h e m i c a ls t a i na n dt h ei n t e n s i t yw e r ed e t e r m i n e dw i t ht h eu s eo fi m a g i n g a n a l y s i st e c h n i q u e s m a r r o ws t r o m a ls t e mc e l l si s o l a t e df i o mf e m u rw e r ei n d u c e dt o d i f f e r e n t i a t ei n t oo s t e o b l a s t s t o t a lr n aw a se x t r a c t e dw i t h 田r i z o ir e a g e n tw h e nt h e o s t c o b l a s t sw e r ec u l t u r e df o r1 4d a y s m r n a e x p r e s s i o n so f o p gw e r ed e t e r m i n e dw i t h r t _ p c rs e m iq u a n t i t a t i v e l ya n dc o m p a r e da m o n gd i f f e r e n tg r o u p s b o n em i n e r a l d e n s i t yo fl e f tf e m o r a lw a sd e t e r m i n e d ( 2 ) t h i r t ym a l er a t sw i t h5m o n t h so l dw e r e d i v i d e di n t on o r m a lc o n t r o l ( c o n ) a n de x e r c i s e ( e x ) g r o u p r a t si ne xg r o u pw e r e t r a i n e do nat r e a d m i l l t h cr a t sw e r es a c r i f i c e da t8w e e ka n db i o c h e m i c a lt e s t i n go f s e r t l mc o n c e n t r a t i o n so fi o n i z e dc a l c i u m , a l eb g pa n du t i n ec o n c e n t r a t i o n so f c a l c i u m , c r e a t i n ew e r ep e r f o r m e dt oe v a l u a t et h es t a t u so fb o n em e t a b o l i s m t h ei n t e n s i t yo f i g f - 1p r o t e i ne x p r e s s i o nw a sd e t e r m i n q db yu s i n gi m m u n o c h e m i c a ls t a i nc o m b i n e d w i t ht h ei m a g i n ga n a l y s i st e c h n i q u e s d u a l - e n e r g yx - r a ya b s o i i p t i o m e t r yw a sc a r r i e d o u tt od e t e r m i n et h eb o n em i n e r a ld e n s i t y ( b m d ) i nf e m u r n ca p o p t o t i co s t e o c y t e si n d i s t a lf e m u rw e r ed e t e c t e db yu s i n gt e r m i n a l - d e o x y n u c l e o t i d y lm e d i a t e dn i c ke n d m l a b e l i n g ( t u n e l ) t e c h n i q u e ( 3 ) t h l r t ym a l er a t sw i t h5m o n t h so l dw e r ed i v i d e di n t o n o r m a lc o n t r o l ( c o n ) ，t a i l - s u s p e n dl o w e rs t r e s ss t i m u l a t i o n ( d i s u s e d i s ) g r o u pa n d e x e r c i s eh i g hs t r e s ss t i m u l a t i o n 噼) g r o u p r a t si ne xg r o u pw e r et r a i n e do i lat r e a d m i l l a n dw e r es u s p e n d e db yt a i li nd i sg r o u p t h er a t sw e r es a c r i f i c e da t6w e e ka n dt h e b o n eh i s t o m o r p h o m e t r i cp a r a m e t e f so ff e m u rw e r em e a s u r e d m a r r o ws t r o m a ls t e m c e l l si s o l a t e df r o mf e m u rw e r ei n d u c e dt od i f f e r e n t i a t ei n t oo s t c o b l a s t sa n da l eb g p w e r ed e t e r m i n e dt oe v a l u a t et h es t a t u so fb o n e f o r m a t i o nm e t a b o l i s m t h ea p o p t o s i so f o s t c o b l a s t sw e r ea l s om c u s u r e d _， r e s u l t s ：( 1 ) b o 矗er e s o r p t i o ni n c r e a s e da n dh i g hb o n et i l m o v c rs t a t u sw a sd e t e c t e d i no v xg r o u pc o m p a r e dw i t ht h ec o ng r o u pa n dt h i st e n d e n c yw a sd e t e r r e di n e x e r c i s eg r o u p 1 m m u n o c h e m l s t r ys t a i no f t n f - aa n di d 6w e r em o r ei n t e n s i v ei no v x g r o u pt h a nt h a ti nc o ng r o u p ( p 0 0 5 ，o 0 1 ) ，h o w e v e r , n od i f f e r e n c ew a sf o u n d b e t w e e ne xg r o u pa n dc o ng r o u p 1 m m u n o c h e m i s t r ys t a i no fb m p - 2w a sm o r e i n t e n s i v ei no v xg r o u pt h a nt h a ti nc o ng r o u p ，h o w e v e r , n od i f f e r e n c ew a sf o u n d b e t w e e no v x + e x g r o u p a n dc o n g r o u p a l s o 。t h ei n t e n s i t yo fb m f 2 ，t n f - aa n d i l - 6w e r ed e c r e a s e di no v x + e xg r o u pc o m p a r e dw i t ht h eo v x g r o u p ( 2 ) s e r u m c o n c e n t r a t i o n so f a 此b g p w e r eh i g h e ri ne xg r o u pt h a nt h a ti nc o ng r o u p ( p 0 0 5 ， p 0 0 1 ) ，h o w e v e r , t h e r ew a sn os t a t i s t i c sd i f f e r e n c ei n 鲫mc o n c e n t r a t i o n so fi o n i z e d c a l c i u ma n du r i n ec o n c e n t r a t i o n so fc a l c i n m c r e a t i n eb e w c e nt w og r o u p s b m dw a s h i g h e ri ne xg r o u pt h a nt h a ti nc o ng r o u p ( p o 0 5 ) ；a p o p t o t i ci n d e xo fo s t e o c y t e sw a s s i g n i f i c a n t l yl o w e ri nt h ee xg r o u pc o m p a r e dw j t ht h ec o ng r o u pi nt r a b e c u l a rb o n e ( p o 0 5 ) t h ei n t e n s i t yo fi g f - 1w a s i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi ne xg r o u pc o m p a r e dw i t h t h ec o ng r o u p 口 0 0 1 ) ( 3 ) g o n c e n t r a t i o n so fa i 卫b g pw e r eh i g h e ri ne xg r o u p t h a nt h a ti nc o ng r o u p ( p o 0 5 1p 0 0 d t h e r ew a s s t a t i s t i c sd i f f e r e n c eo fa l p c o n c e n t r a t i o nb e t w e e nd i sa n dc o ng r o u p ，h o w e v e r ,b g pc o n c e n t r a t i o nw a s s i g n i f i c a n t l yl o w e ri nd i sg r o u pb yc o m p a r i s o nw i t hc o ng r o u p t h e r ew a sn o s t a t i s t i c sd i f f e r e n c ei na p o p t o s i so fo s t e o b l a s t sb e t w e e nc o na n de xg r o u p ，h o w e v e r , a p o p t o t i co s t e o b l a s t sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g hi nd i sg r o u pc o m p a r e dw i t ht h ec o n g r o u p c o n c l u s i o n ：( 1 ) e s t r o g e nd e f e c i e n c el e a dt o i n c r e a s e db o n er e s o r p t i o na n ds u c h t e n d e n c yw a s d e t e r r e db ye x e r c i s e e x e r c i s ec o u l dd e p r e s st h eh i g ht u r n o v e rs t a t u sa n d b o n er e s o r p t i o no fo v a r l c c t o m i z e dm t s ( 2 ) o v a d e c t o m yc s e s et h er i s i n go fb m p - 2a n d t n f - a l l - 6 i nb o n et i s s u ea n do p gm r n a e x p r e s s i o na n de x e r c i s ec o u l dd e c r e a s i n gt h e i v e x p r e s s i o no ft n f a ，b m p - 2 ，i m ，o p gi nb o n em a r r o wi nr a t s 晰t ho v a r i e c t o m y ( 3 ) e x e r c i s ec a u s et h er i s i n go fi g f 1i nl o c a lb o n et i s s u ea n dd e c r e a s i n gt h ea p o p t o s i s o fo s t e o c y t e si nr a t s l o w e rs t r e s ss t i m u l a t i o nl e a dt ot h ei n c r e a s eo fa p o p t o s i so f o s t s o b l a s tw h i c hw o u l di n f l u e n c et h eb o n em e t a b o l i s m k e yw o r d s ： e x e r c i s er a t sb o n em e t a b o l i s mo s t e o p o r o s i so v a r i e c t o m yb o n e m i n e r a l d e n s i t yo s t e o c y t e o s t e o b l a s t o s t e o p r o t e g e r i n b i o m e c h a n i c s l m m u n o h i s t o c h e m i s t r y b o n eh s m o r p h o m e t r y a p o p t o s i s v 缩略词表 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：煎二坚日期：塑兰z ：! ：弗 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西 师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文 的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进 入学校图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名蕊：二坚 1 1 雌激素与骨代谢 1 文献综述与选题依据 1 1 1 雌激素对骨形成的影响 体外培养与体内成骨细胞成熟的进程相似，主要包括细胞增殖、细胞外基质 成熟和钙化三个阶段；a l p 的活性是成骨细胞最常见的特征性标志，是成骨细胞 早期分化的标志，活性成骨细胞在早期发育阶段富含a l p 。i 型胶原是成骨细胞 晚期分化的重要指标，它是骨组织中主要的有机成份，由成骨细胞产生并分泌到 细胞外基质中，约占骨组织中有机成份的9 0 ，为羟基磷灰石沉积反应提供依托 和骨架1 1 1 ；在成骨细胞成熟后期阶段，i 型胶原分泌增多；体外细胞培养条件下也 发现了高水平的i 型胶原、a l p 、骨钙蛋白等成骨细胞标志物的产生【捌及无机质 的沉积。雌激素可明显促进鼠成骨细胞i 型胶原的表达【4 l ，表明雌激素可明显促进 成骨细胞的分化和成熟翻。 1 1 2 雌激素促进成骨的机制 1 1 2 1 雌激素受体机制 雌激素通过e r 发挥作用的模式有三种：雌激素与胞浆受体结合，变构后 进入胞核与特异的d n a 序列结合，促进特异的m r n a 合成；雌激素直接弥散 入胞核，与核受体结合雌激素与胞浆和胞核两部分e r 结合，e r 活化后，核 内e r 游离，与染色体上的特异结合位点结合。一般认为雌激素对成骨细胞的调节 并非雌激素受体机制的主要作用，雌激素受体机制主要功能是通过e r 直接作用于 破骨细胞，从而影响骨吸收；但q i l 等1 6 , 7 1 在小鼠骨髓细胞培养中发现，雌激素主 要通过e r 机制对成骨细胞的增殖、分化、基质的沉积、矿化、机械应力适应性应 答以及基质蛋白的合成发挥直接作用。 雌激素受体属核受体超家族成员，位于胞浆和胞核内，具有转录因子的作用， 包括e r a 和e r b 两种亚型。v i d a l 等同通过原位杂交证实e r a 存在于人成骨细胞 及破骨细胞中。e r bm r n a 在鼠成骨细胞、鼠骨肉瘤细胞、人成骨细胞株中均有 表达。e r a 或e r b 基因敲除大鼠模型未能显示出两种亚型的主要作用，表明对于 骨组织，雌激素还可能有其他e r 亚型或非受体机制参与；e r a 、e r b 与雌激素或 其它配体( 如选择性雌激素受体调节剂和植物雌激素等) 具有相似的亲和力，都具 有配体介导的转录激活作用，但两者在功能上却存在明显差异，例如多数细胞中 e r b 转录活性低于e r a ，e r a 能结合并激活s f l ( s t e r o i d o g e n i cf a c t o r1 1 反应元件， 而e r b 则不能 9 1 。然而在成骨细胞形成过程中，e r a ，e r 8 的共同表达说明了这两 种受体亚型在成骨细胞分化和矿化中具有协同作用。 1 1 2 2 旁分泌自分泌机制 雌激素对骨代谢的作用主要表现为抑制骨吸收。但是，雌激素可抑制成骨细 胞产生刺激破骨细胞增殖、分化及活化的细胞因子。这些细胞因子主要有i l - 1 、 i l - 6 、t n f - a 、巨噬细胞集落刺激因子( m - c s f ) ，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 ( g m - c s f ) ；其中，l i , - 1 和t n f 是已知最有效的骨吸收刺激因子。雌激素不仅抑制 单核细胞产生i i - 1 和t n f ，而且可抑制骨基质细胞分泌上述细胞因子，并降低基 质细胞对i l - 1 和t n f 的反应性。g i r a s o l e r l l o j 等认为雌激素缺乏时，成骨细胞对i d 6 敏感性增加。s t a v r o s l l l 】等认为雌激素抑制i j - 6 的同时还抑制i d 6 受体( i l - 6 r ) 的两 种亚和窖p 1 如的表达。 胰岛素样生长因子( i g f s ) 是骨的重要生长因子，成骨细胞分泌i g f - i ，并通 过它调节成骨细胞增殖。雌激素可刺激成骨细胞分泌i g f - i 和胰岛素样生长因子 结合蛋白珂i g f - b p 3 ) ，促进成骨细胞合成t g f - b 。 1 1 2 3 细胞凋亡机制 成骨细胞的增殖与凋亡对维持骨代谢平衡非常重要。雌激素能促进破骨细胞 的凋亡，而对成骨细胞表现为抗凋亡作用；b c l l i d o 的研究表明，e 2 是通过e r 和 细胞外信号调节激酶fe g g s ) 的快速激活介导机制抑制成骨细胞凋亡。细胞因子如 t n f 及i l - 1 对成骨细胞的凋亡具有促进作用，雌激素则通过抑制上述因子的表达 来抑制成骨细胞凋亡。c o o p e r f l 2 l 等报道，雌激素可通过增加热休克蛋白2 7 ( h s p 2 7 ) 的产生抑制t n f a 诱导的成骨细胞凋亡。 1 1 3 雌激素对骨吸收的影响 雌激素可以通过多种途径影响骨吸收作用：通过非破骨细胞( 成骨细胞和 骨基质细胞) 分泌可溶性细胞因子或通过细胞一细胞接触的间接方式影响破骨细 胞的骨吸收作用；直接作用于破骨细胞影响骨吸收。s h e v d e l l 3 1 通过去势大鼠模 型证明：雌激素能通过受体结合途径，直接抑制破骨细胞前体形成细胞( g m c f u ) 的募集、分化，抑制破骨细胞活性。细胞形态学研究发现，雌激素可通过受体结 合途径影响细胞周期，诱导破骨细胞凋亡( a p o p t o s i s ) ；k a m e d a l l 4 1 在对高度纯化的 哺乳动物成熟破骨细胞进行研究后也得出了相似的结论；这些发现有助于解释雌 激素的骨保护作用机制，也证明了雌激素替代疗法治疗p m 0 的有效性。 1 1 a 雌激素对破骨细胞的作用机制 。 雌激素主要通过介导r - 1 、i l - 6 、1 2 5 ( o h ) 2 d 3 等细胞因子的产生抑制破骨 细胞的形成。 1 1 4 1i l - 1 是一种主要由外周单核细胞( p b m ) 分泌的多肽细胞因子。 1 9 8 7 年， p a c i f i c 首次发现，骨质疏松患者p b m 分泌i l - 1 明显高于非骨质疏松患者，认为 2 i l - 1 是体内强有力的骨吸收刺激剂，在p m o 发病机制中起重要作用。i l - 1 除了在 p g e 介导下促进破骨细胞形成外，还通过旁自分泌机制刺激成骨细胞和骨基质细 胞分泌多种细胞因子，如i l - 6 、t n f - a 、c s f 等，促促进破骨细胞前体形成细胞增 殖、分化和激活1 1 5 l 。在骨质吸收过程中释放的i l - 1 及暴露的骨基质成分( 如i 型 胶原片段、羟脯氨酸等) ，可刺激p b m 对i l l 、t n f - a 、c s f 的分泌，从而产生 骨吸收的放大作用1 1 6 1 。正常情况下，雌激素通过受体结合途径与p b m 上的e r 结 合，抑制p b m 对i l - 1 、t n f - a 等细胞因子分泌；雌激素减少后，这种抑制作用减 弱，导致这些细胞因子分泌增加，在成骨细胞及骨基质细胞介导下，这些细胞因 子刺激骨吸收，参与p m o 的形成。实验证实【1 7 1 。凡能增加成骨细胞内c a m p 合成 的细胞因子( 如i l - 1 、p t h 、p 6 e 2 ) ，均可引起破骨细胞活性的增强；雌激素可以 通过抑制细胞内c a m p 合成的途径抑制骨吸收。因此，雌激素、i l - 1 受体拮抗剂【l s l 可阻止p m o 的骨质丢失。 1 1 4 2i l - 6 是由成骨细胞、破骨细胞、骨基质细胞、单核巨噬细胞分泌的、具有 广泛生物活性的细胞因子，是调节骨吸收的关键因子；并在p m o 发生过程中起核 心作用。研究证明1 1 9 1 ，i l - 6 是通过其受体系统( i l - 6 受体及糖蛋白g p l 3 0 ) 和旁，自 分泌方式作用于成骨细胞和骨基质细胞，刺激粒巨噬细胞集落形成单位 ( c r o g m ) ，使破骨细胞数量的增加。雌激素即能通过受体结合途径抑制成骨基质 细胞分泌广6 ，同时也抑制g p l 3 0 的细胞内信号传导；当雌激素减少后，i l - 6 分 泌的增加，破骨前体形成细胞对n 石的敏感性增强，促进了骨吸收作用及p m o 的形成。g p l 3 0 是i l - 6 和同样具有骨吸收活性的i l - 1 1 、l i f 和肿瘤抑素m ( o s m ) 的细胞内信号传导链，雌激素可通过调节g p l 3 0 表达来调控骨吸收活性；实验证 明雌激素、，6 中和性抗体、g p l 3 0 抗体均可阻止p m o 的骨量丢失。 1 1 a 3 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 是体内具有多种生物活性的钙代谢调节剂，它对骨骼具有双 向作用，除了刺激成骨细胞及促进骨形成外，尚可促进破骨细胞的溶骨作用，并 与p t h 协同作用促进破骨细胞形成和骨吸收作用。切除甲状旁腺的动物，其 1 , 2 5 ( o h ) 2 d 3 动员骨钙及促进骨吸收作用明显减弱，说明p 1 h 对1 , 2 5 ( o h ) a d 3 的 骨吸收活性具有支持作用；雌激素可拮抗p t h 骨吸收作用，降低骨组织对p t h 的 敏感性【2 0 l ；雌激素治疗则通过降低p m o 妇女增高的血清删水平，间接影响1 ， 2 5 ( o h ) 2 d 3 的骨吸收活性。 雌激素除了上述三种途径抑制破骨细胞形成外，还通过对t g f 、i g f 的影响 发挥抑制骨吸收的作用。i g f 和t g f 主要由成骨细胞分泌，并可以无活性形式贮 存于骨基质内，两者是骨基质内含量最多的生长因子，也是调节成骨细胞功能的 主要局部因子，均参与骨的重建。接受i g f 治疗后的p m o 患者，尿c a 、h o p 捧 泄增加1 2 l l ，提示i g f 是导致骨高转换率的重要因素。实验证实阎，i g f 通过受体 结合途径，增加了骨髓内c f u - g m 及破骨细胞前体的数量，对骨吸收具有促进作 用；雌激素可在转录水平调控成骨细胞i g f 旁自分泌活动，调节破骨细胞的增殖 和活性。雌激素还通过诱导c - l o s 、c - j u n 基因转录诱导成骨细胞产生a p - 1 转录复 合物，调控t g f 的产生，在特定的细胞、激素以及微环境条件下可发挥抑制骨吸 收的作用l 捌。 1 2 细胞因子与骨代谢 1 2 1b m p 与骨代谢 1 9 6 5 年u r i t 1 2 4 乃l 报道了脱钙骨基质可以异位诱导宿主间充质细胞分化成新 骨，提示骨基质中可能存在一种能促进未分化间充质细胞定向分化为成骨细胞， 并具有诱导骨形成能力的蛋白质；后来这种蛋白被命名为骨形态发生蛋白( b o n e m o r p h o g e n e t i cp r o t e i n s , b m p s ) 。 b m p s 是广泛存在于骨基质中的一种低分子糖蛋白，至今已有4 0 多种b m p 被成功地分离1 2 6 1 。b m p s 在细胞内以前体形式合成，碳末端在蛋白水解酶的作用下 形成大约1 3 0 个氨基酸的成熟蛋白；大多数b m p 在成熟区都有一个由7 个半胱氨 酸形成的保守区，其中6 个半胱氨酸残基在多肽链内部形成二硫键，1 个半胱氨酸 残基参与肽链间二硫键的形成，使两个多肽链相互连接成二聚体，这种典型的局 部二硫键结构称为半胱氨酸结，所以成熟的b m p s 蛋白结构是由二硫键连接的同 型或异型二聚体；这种二聚体释放到细胞外，与机体各处靶细胞表面的相应受体 结合而发挥作用。b m p s 受体主要有两型，即i 型和型；前者在脊椎动物还可分 为ia 和ib 两个亚型，它们是丝氨酸苏氨酸激酶超家族的成员。b m p 的信号 传递由i 型和型b m p 受体共同介导。b m p s 蛋白作用时先与i i 型受体结合并使 其活化，然后i 型受体和b m p s 蛋白结合，在活化的i i 型受体作用下通过转磷酸 基被激活。 正常情况下，骨的形成与修复过程需要三个基本条件：骨形成诱导因子、被 诱导细胞和适宜的环境。实验证明，无论是胚胎还是发育健康的人体，骨组织细 胞均来源于未分化的间充质细胞，由多种调节因子调控间充质细胞定向分化为具 有成骨表型的细胞。b m p s 在体内活性的重要标志就是诱导间充质细胞分化为成骨 细胞，并形成新生骨；失去b m p s 等因子的诱导作用，间充质细胞将不会分化形 成软骨和骨。在对b m p s 生物活性分析中发现，b m p s 诱导成骨的作用大致分为趋 化期、分化期、骨质形成及重塑期四个时期，即间充质细胞发生化学趋向、聚集、 分化形成软骨和骨，并进一步形成骨髓腔的过程唧。实验证实，b m p s 可在原位和 4 异位诱导骨形成 b m p s 诱导成骨的方式主要是诱导发生软骨内骨化和膜内成骨；软骨内成骨 是指在结缔组织内的间充质细胞先分化为软骨组织，软骨组织再进一步钙化形成 骨组织；膜内成骨则指在结缔组织膜内由间充质细胞直接分化、发育形成骨组织。 实验表明，b m p 2 b m p - 7 、b m p 1 2 b m p 1 4 均具有体内诱导异位成骨的能力， 可使来自兔胚胎锁骨、成人锁骨和长骨来源的细胞系细胞分化为软骨和骨，并促 进其有丝分裂。 b m p s 的骨诱导作用与b m p 的种类、b m p 受体类型、受体亲和力、所激活 的细胞内信号传递系统及b m p 浓度存在密切关系 2 s l ；b m p - 骨诱导作用的最优浓 度尚未有定量报道，多数诱导实验使用的b m p 浓度为2 0 2 0 0 9 m l ；低浓度b m p s 对间充质细胞产生趋化效应；中等浓度b m p s 可促进间充质细胞向成软骨及成骨 细胞方向分化；高浓度b m p s 则能促进问充质细胞的增殖。b m p s 成骨诱导作用与 周围环境也有密切的关系例；不同组织、部位间充质细胞分化成骨的能力有很 大差别，理想的组织是肌肉、筋膜和骨膜；而肝、脾、肾等组织中间充质细胞分 化成骨的能力较弱，这可能是不同部位的问充质细胞对b m p s 的反应性不同所致； 不同种属的b m p s 有高度的同源性，但是无论对同种还是异种，对b m p s 均存 在反应性差异；例如某些种属基质中b m p s 含量较多，其活性也强于其他种属， 组织对b m p s 的反应性也较强；不同年龄动物的间充质细胞对b m p s 具有不同 的敏感性；将b m p s 植入不同年龄的家兔体内，年轻动物的成骨量明显多于成年 动物。低等动物的b m p $ 能在高等动物体内诱导成骨，而高等动物对低等动物 来源的b m p s 反应并不敏感 雌性大鼠去势后骨质疏松症模型的骨代谢特点同绝经后妇女相似，均为高转 换型骨代谢，即骨形成与骨吸收均增加，但骨吸收大于骨形成。w o m s k i 等p 川报道 去势1 0 周后大鼠的破骨细胞及破骨细胞缘长度、成骨细胞及成骨细胞缘长度均明 显增加。韩利华等1 3 1 】发现去势后大鼠松质骨成骨细胞及破骨细胞均增加，o v x 组 大鼠松质骨中b m p 阳性反应增强；去势后大鼠松质骨中b m p 含量的增加继发于 雌激素减少所致骨吸收亢进，由于b m p 等骨生长因子的增加使骨形成亦增加，导 致去势后大鼠出现骨转换加快，但由于b m p 等骨生长因子增加引起的骨形成增加 并不能完全代偿雌激素减少引起的骨吸收亢进，因而出现了骨质疏松。因此，提 高雌激素水平对绝经后妇女骨代谢平衡具有重要作用，它可以直接作用于其在成 骨细胞、破骨细胞上的高亲合性受体而发挥作用，降低骨转换，维持骨量；体外 实验证明，雌激素能促进b m p 的分泌，调节成骨细胞分泌一种或多种b m p 3 2 1 ， 其中，b m p 6 的分泌 3 3 1 ，对早期成骨细胞和骨发育有直接作用；b m p - 6 通过自分 5 泌和旁分泌途径促进未分化细胞分化为成骨细胞，并促进软骨内骨化。张勇等【叫 通过斑点杂交实验检测发现，老年骨质疏松患者股骨颈b m p - 2 及b m p 7 基因表达 水平明显低于青年人，同时总b m p 表达明显降低，说明老年性骨质疏松病人松质 骨中b m p 合成、分泌的减少及b m p 2 、b m p - 7 表达的降低很可能是老年性骨质 疏松症发生的病因之一。除了b m p 具有诱导未分化间充质细胞不可逆分化为软骨 细胞和成骨细胞外，b m p 还是一种具有潜在活性的蛋白质，当骨组织形态结构完 整时它处于一种稳定的低表达状态；当骨组织损伤时，b m p 迅速出现量的增加及 活性的增强1 3 5 】，其基因转录水平与骨形成有着直接的关系；正常情况下，活性b m p 水平降低将会导致严重的骨质疏松；因此，上调b m p 的表达数量和活性是促进成 骨的一种有效手段。 1 2 2t n f 与骨代谢 1 9 7 5 年，c