（中药学专业论文）hbsag基因的克隆及其在毕赤酵母和葡萄组织中的表达.pdf

h b s a g 基因的克隆及其在毕赤酵母 和葡萄组织中的表达 摘要 本研究利用p c r 扩增出a d r 亚型乙肝表面抗原( h b s a g ) 基因，构建了酵 母和植物表达载体，通过巴斯德毕赤酵母和葡萄组织对获得的乙肝表面抗原基幽 进行表达研究，取得了如下进展： 1 通过p c r 将本实验室构建的p b l l 2 1 h b 植物表达载体中的乙肝表面抗原 基因扩增出来，构建了克隆载体p u c l 9 h b ，通过酶切对克隆载体进行了鉴定和 测序，并和n c b i 中的基因序列进行b l a s t ，证实所获得的基因序列和登陆号为 a y 6 4 6 4 4 4 1 的乙肝表面抗原基因序列完全一致。结果表明，h b s a g 基因已经克 隆至p u c l 9 中。为h b s a g 基因构建表达载体奠定了基础。 2 将克隆载体p u c l 9 h b 和酵母表达载体p p i c 3 5 k 用相同的限翩性内切酶 切割，回收目的片段，用t 4 d n a 连接酶将两者连接，筛选得到酵母表达载体， 经酶切鉴定h b s a g 基因已经正确地连接到p p i c 3 5 k 上。用l i c l 法将重组以后 的酵母表达载体导入甲醇型酵母( p i c h i a p a s t e o r i s ) 菌株g s l l 5 中，获得转化予。 将转化子进行p c r 筛选，得到酵母重组菌株。在以甲醇为唯一碳源的培养基上 培养，对重组酵母菌株进行了诱导表达。经过s d s p a g e ，发现在诱导7 2 小时 后目的蛋白表达量最大，而且在2 3 k d a 和2 7 k d a 处均有目的条带，说明p i c h i a p a s t o r i s 成功表达了h b s a g 蛋白，并进行翻译后加工修饰。对表达的蛋白用e l l s a 初步定性检测结果为阳性，表明表达的h b s a g 具有免疫活性，所获得的h b s a g 基因可以用于蛋白表达研究。实验结果为下一步利用该基因转化植物材料提供有 力的保证。 3 以植物表达载体p b l l 2 1 h b 为基础，成功构建了新的植物表达载体 p c a m b i a l 3 0 1 h b 。将所构建的植物表达载体转化入农杆菌l b a 4 4 0 4 ，利用农 杆菌l b a 4 4 0 4 介导转入葡萄愈伤组织中。 4 利用葡萄( v it i sv i n i f e r al f n n ) 作为表达h b s a g 的受体材料。以葡 萄叶片为诱导材料，在附加1 m g l n a a ，o ，l i n g l 6 一b a n a a 的m s 培养基中诱 导出葡萄愈伤组织。p c a m b i a l 3 0 1 1 - b 载体中利用潮霉素抗性基因作为筛选基 因，葡萄愈伤组织对不同浓度的潮霉素抗生素的敏感性实验表明，当潮霉素浓度 达到3 0 m g l 时就能完全有效的杀死组织细胞，而在2 0 m g l 浓度下就可以比较 好的抑制葡萄愈伤组织生长，因此2 0 m l 被确定为葡萄愈伤组织筛选剂的基础 i 醢扎， 5 在转化前对葡萄愈伤组织进行了预培养、甘露醇处理，结果表明葡萄愈伤 组织预培养时间为3 天左右转化效率最高，转化率可以达到5 0 。葡萄愈伤矧 织细胞分别用7 个浓度梯度( o 、0 1 、0 2 、o 3 、0 4 、0 5 、0 6 、0 7 m o l l ) 的甘露 醇处理，转化结果表明0 4 m o l l 的甘露醇处理4 h r ，可以明显提高农杆菌的转化 效率，转化率可以达到6 0 。 6 通过p c r 和s o u t h e r n 杂交证实h b s a g 基因成功转入葡萄愈伤组织，建立 了转基因葡萄组织表达h b s a g 的体系，成功获得了转基因的葡萄愈伤组织。 关键词：毕赤酵母 乙肝疫苗转基因植物 葡萄愈伤组织蛋白表达 t h ec l o n i n ga n dt h ee x p r e s s i o no fh b s a gg e n ei n p i c h i a p a s t e o r i sa n dg r a p et i s s u e s a b s t r a c t t h i sr e s e a r c ha m p l i f i e dh b s a gg e n e ( a d ob yp e r ，w ec o n s t r u c t e dt h ey e a s ta n d p l a n te x p r e s s i v ev e c t o r s t h ee x p r e s s i o no fh b s a gi np i c h i a p a s t e o r i sa n dg r a p e t i s s u e sw e r es t u d i e d t h em a i na c h i e v e m e n t sw e r ea sf 0 1 l o w ： 1 h b s a gg e n ew a sa m p l i f i e df r o mt h ep b l l 2 1 h b ，t h e nh b s a gg e n ew a s c l o n e di n t op u c l 9 t h er e c o m b i n a n t sw e r ea s s a y e db yt h ed i g e s t i o no fr e s t r i c t e d e n z y m ea n ds e q u e n c e d t h es e q u e n c e sw e r eb l a s t e di nt h en c b l t h er e s u l t so f s e q u e n c e sw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h es e q u e n c eo fa y 6 4 6 4 4 4 1 t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a t t h e h b s a gg e n e w a sc l o n e d i n i o p u c l 9 t h er e s u l t sb u i l tas o l i db a s e f o r t h e c o n s t r u c t i o no f e x p r e s s i v ev e c t o r 2t h ec l o n ev e c t o ra n dp p i c 3 5 kw e r ed i g e s t e db yt h er e s t r i c t e de n z y m e ，t h e n l i g a t e db y t 4d n al i g a s e t h eh b s a gg e n ew a sc l o n e di n t o p p l c 35 kb y a n a l y s i s t h ee x p r e s s i v ev e c t o rw a st r a n s f o r m e di n t op i c h i a p a s t e o r i s ( g s1i5 ) b y l i c lm e t h o d 。t r a n s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e db yp c r t h er e c o m b i n a n t sw e r eo b t a i n e d b yt h ea s s a yo fp c r t h e nt h es t r a i ne x p r e s st h eh b s a gi nt h ec u l t u r em e d i u mu s i n g m e t h y la l c o h o l a st h ec a r b o l i cr e s c o u r c e 、t h ee x p r e s s e dp r o t e i nw a st h em o s ta t7 2h r b ys d s p a g e e x p r e s s e dp r o t e i nw e r e2 3 k d aa n d2 7 k d a ，t h i si n d i c a t e dp r o t e i nw e r e m o d i f i e db yg s l15 e l i s aa s s a yw e r ep o s i t i v e ，i ts h o w e dt h a tt h ee x p r e s s e d p r o t e i n s w e r e i m m u n o c o m p e t e n c e s o t h e h b s a gg e n e c a nb eu s ef o r e x p r e s s i o n r e s e a r c h t h e s er e s u l t sa s s u r e dt h et r a n s f o r m a t i o no f p l a t o 3i nt h i sw o r k ，t h en e wp i n te x p r e s s i v e v e c t o r ( p c a m b i a l3 0 1 h b ) w a s c o n s t r u c t e d s u c c e s s f u l l y t h ep c a m b i a l 3 0 1 h b w a st r a n s f o r m e di n t o a g r o b a c t e d u ml b a 4 4 0 4b yf r e e z ea n dt h a wm e t h o d t h e nt h eg r a p ec a l l iw a s | r a n s f o r m e db yl b a 4 4 0 4 4i nt h i s e x p e r i m e n t ，t h ec a l l io fv i t i sv n i f e r aw a sm a t e r i a lt h a tw a s jn d u c e df r o ml e a v e sf o rt r a n s f o r m a t i o n ，t h eg r a p ec a i l iw e r ei n d u c e di nm sw i t h l m g ln a a ，o 1 m g l 6 一b a n a a a n dw em a d eap r e e x p e r i m e n tt oc u l t u r et h e g r a p ec a l l iw i t hd i f f e r e n th y g r o m y c i nb c o n c e n t r a t i o n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e h y g r o m y c i nb c o u l dk i l lt h ec e l lo fg r a p ec a l l ia t3 0m lc o m p l e t e l y h y g r o m y c i n bc a ni n h a b i tt h eg r o w t ho fg r a p ec a l l ia t2 0m g l ，s ot h es e l e c t i v ec o n c e n t r a t i o no f h y g r o m y c i nbw a s2 0m e 2 l 5t h eg r a p ec a l l iw e r ep r e c u l t u r e da n dp r e t r e a t e db ym a n n i t o lb e f o r e t r a n s f o r m a t i o n ，t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h et r a n s f o r m a t i o n 厅e q u e n c yw e r et h e h i g h e s ta t3d a y s t h et r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yr e a c h e dt o5 0 t h eg r a p ec a l l iw e r e t r e a t e dw i t lm a n i t o la t7c o n c e n c r a t i o n f o 、0 1 、0 2 、0 3 、0 ，4 、o5 、o 6 、0 7 m o l l ) r e s p e c t i v e ly 1 t h et r a n s f o r m a t i o nr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h et r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c y w a st h eh i 曲e s tw h e nm a n m i t o lc o n c e n t r a t i o nw a so 4 m o l la n dc u l t u r et i m ew a s4 h r ，t h e t r e a t m e n ti n c r e a s e dt h et r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n c y o f a g r o b a c t e f i u m e v i d e n t l y , t h et r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c y r e a c h e dt o6 0 6t h eh b s a gg e n ew a st r a n s f o r m e di n t og r a p ec a l l ib ya s s a yo fp c ra n d s o u t h e r n a e x p r e s s i v es y s t e m o ft r a n s g e n i c g r a p e t i s s u e sw e r ec o n s t r u c t e d t h e t r a n s g e n i cg r a p ec a l l iw e r eo b t a i n e ds u c c e s s f u l l y k e yw o r d s ：p i c h i a p a s t e o r i sh e p a t i t i sbv a c c i n et r a n s g e n i cp l a n t g r a p ec a p r o t e i ne x p r e s s i o n 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：主煎五蕴指导教师签名： 蚵年f 月日卜r ? 年 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师尉亚辉教授指导下进行 的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注 和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：z 妖f 怖加睥月，目 垮明臣钼 第一部分前言 乙型肝炎是危害全人类健康最重要的传染病之一，它是由乙型肝炎病毒 ( h b v ) 感染引起的，目前全世界大约3 亿人感染h b v ，每年由h b v 感染引起 的肝硬化等各种疾病( 包括肝癌) 可造成l o o 2 0 0 力人死亡。由于h b v 可通 过血液、体液、母婴等多种方式传播，且发病机理较为复杂，比较难于治愈，因此 接种乙型肝炎疫苗是控制乙型肝炎发生的有效途径。 传统的乙型肝炎疫苗有两大类：即减毒乙型肝炎疫苗和灭活乙型肝炎疫苗。 减毒疫苗虽然免疫效果较好，但减毒乙型肝炎疫苗存在一定程度的安全问题：火 活乙型肝炎疫苗是利用灭活的病原体作为疫苗，比第一类疫苗安全，但是免疫效 果比较差。随着生物技术的飞速发展，特别是分子生物学技术的迅速发展，人们 利用分子生物学技术开发出专一性强、安全性高的疫苗，即重组疫苗。这种疫苗 是通过把能够激发机体免疫反应的病原体基因分离出来，重组到无害的生物体 内使其得到表达，将表达的蛋白制备出乙型肝炎疫苗。 上个世纪9 。年代初，随着转基因植物表达蛋自研究的成功，利用转基因植 物生产疫苗迅速引起世界科研工作者的商度关注。利用转基因植物生产疫苗，是 将抗原基因导入植物使其在植物中表达，人或动物摄入该植物或其中的抗原蛋白 质后，机体产生对此抗原的免疫应答。利用转基因植物生产口服疫苗有着得天独 厚的优势，因而口服疫苗的研究必然是疫苗研究的热点之一。 一利用酵母生产疫苗研究进展 乙型肝炎( h e p a t i t i sb ，h b ) 是世界上分布最广泛的传染病之一，是由乙型肝 炎病毒( h e p a t i t i sbv i r u s ，h b v 简称乙肝病毒) 感染患者而引起的。对于未感染 者，主要的预肪措施就是接种乙肝疫苗。 在研究基因工程疫苗的早期，人们研究利用大肠杆菌原核表达系统生产乙 肝基因工程疫苗，由于表达水平低、产物不稳定、不能形成颗粒，以及产物糖基 化程度不适宜，表达出来的包含体没有活性，也不易纯化等因素的影响，未能获 得成功。乙肝基因工程疫苗最早获得成功的是v a l e n z u e l a 等( 1 9 8 2 ) ，他们将a d w 亚型的h b s a g 基因置于酵母醇脱氢酶( a d h ) 启动子的控翩下，在啤酒酵母中 表达h b s a g 获得成功。在此基础上，许多国家的研究人员纷纷效仿，丌发出了 可以进入市场的酵母表达乙肝基因工程疫苗。 酿酒酵母( s a c c h a r o m y e e sc e r e v i s i a e ) 最先作为外源基因表达的酵母宿主， 1 9 8 1 年利用酿酒酵母表达了第一个外源基因一十扰素基因，随后又有一系列外 源基因在该系统得到表达。但是，酿酒酵母表达蛋白由实验室扩展到工业规模时， 培养基中维持高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数f 降，凼此产 量下降。同时实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时， 往往导致产量下降。为克服酿酒酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母 ( m e t h y l o p h i cy e a s t ) 为代表的第二代酵母表达系统。 甲基营养型酵母包括：p i c h i a ，h a n s e n u l e ，y o r u l o s i s ，c a n d i d a 等。以 p i c h i a p a s t e o r i s ( 毕赤巴斯酵母) 为宿主的外源基因表达系统发展非常迅速，应 用也很广泛，已利用该系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋白质，并逐步走 向工业化。1 9 8 3 年，美国p h i l l i p sp e t r o l e u m 公司w e g n e r 等最先丌发 p i c h i a p a s t e o r i s ，利用其发酵培养能达到很高密度的特性，生产干酵母蛋白作为 食物或动物饲料。由于p i c h i a p a s t e o r i s 能进行高密度发酵，若能作为外源基阁表 达系统，就可以方便地形成工业规模，大量生产外源蛋白。在这种殴想下，s i b i a 公司和p h i l l i p sp e t r o l e u m 公司展开了合作，e l l i s 于1 9 8 5 年筛选到强效可调控 a o x l 启动子，同年c r e g g 等建立了p i c h i a p a s t o r i s 酵母转化方法，自重组酵母 乙肝疫苗问世以来，国外已有大量有关重组酵母乙肝疫苗免疫效果的报道。1 9 8 7 年c r e g g 等和t s c h o p p 等率先利用p i e h i a p a y o f f s 外源基因表达系统表达了i t b s a g 和l a z 。此后，p i e h i a p a s t o r i s 外源基因表达系统逐步得到完善，形成了继酿酒酵 母基因表达系统以后的第二代酵母表达系统。 ( ) 毕赤酵母表达系统的优点 具有醇氧化酶a o x l 基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动 予之一。其系统比较简单，便于控制生产。 表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。而且有稳定的产量，质量 也比较均一。 毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降 解，而且减少对细胞的毒害作用。 尤为重要的是表达产物h b s a g 能够装配成表面抗原颗粒，而颗粒的免疫原 性比单体h b s a g 强1 0 0 0 倍以上，这是表达产物能成为疫苗的关键。 ( 二) 毕赤酵母表达系统的缺点 酵母表达的h b s a g 不能分泌，给产物的分离纯化带来较多困难，这是该系 统的主要缺点。 酵母表达的h b s a g 中蛋自在酵母系统中过度糖基化不仅使产物稳定性差， 还影响其免疫原性。 二转基因植物口服疫苗研究进展 ( 一) 利用转基因植物生产蛋白研究进展 目前，利用转基因植物生产口服疫苗越来越受到重视。这种技术在国外研究 的比较多，在国内还处于探索阶段。在口服疫莳抗原的选择、受体植物的选择、 表达载体的构建、转化和检测及动物和人体试验等方面还需要进一步研究。 利用转基因植物生产的口服疫苗抗原一般是蛋白质性质的，如乙肝表面抗 原( h b s a g ) 。将病原体具有抗原性的蛋白质基因转入植物中，并在植物中进行表 达，表达出来并组装成具有活性的多聚体颗粒形式。口服疫苗抗原的选择遵循的 原则是抗原应维持天然的活性、无毒安全、具有多聚体颗粒结构形式、与受体结 合能力和能刺激明显的免疫反应等。因此应注意疫苗抗原要有活性，否则不易产 生免疫性，饲喂人和动物时，植物一般不经过剧烈的加工，以防止疫苗抗原失活。 疫苗抗原不具有感染宿主能力，仅具有免疫性，安全无毒，否则会导致它们感染 本要防治的疾病。 到目前为止，在植物中用于疫苗研究的病原基因主要有：乙肝表面抗原 ( h b s a g ) 基区j 、大肠杆菌热敏素b 亚单6 2 ( l tb ) - 基n 、霍乱弧菌毒素b 亚单位 ( c t - b ) 基因、诺沃克病毒外壳蛋白( t , r v c p ) 基因、猪传染性肠炎病毒s 糖蛋白 f t g e v - s ) 基因、口蹄疫病毒v p l 蛋白( f m d v - p v i ) 基因、狂犬病病毒g 蛋白基因、 人巨细胞病毒( h c m v ) 糖蛋白b ( u l 5 5 ) 基因和兔出血病毒( r h d v ) v p 6 0 蛋白基因 等。 利用转基因植物生产生物制品已成为一种十分具有吸引力和比较经济的生 产手段，已经被用作生产蛋白、糖类和脂类的生物反应器，尤其是利用转基因植 物进行药物生产。目前许多国家已经利用转基因植物进行药物生产，美国利用转 基因植物生产白细胞介素2 ( i l - 2 ) ；比利时利用转基因烟草得到高产量的五肽神 经肽；荷兰周转基因马铃薯生产人的血清白蛋白；韩国用转基因番茄和烟革牛产 人的胰岛素；美国在转基因烟草中提取栝楼素( t f i c h o s a n n i n ) 用于治疗爱滋病。8 0 年代以来，仅日、美两国开发的生物技术新药物就达2 0 0 多种，目前在美国已有 5 0 多种生物药物、疫苗等投放市场，尚有4 0 0 多种生物试剂正在临床试验。利 用转基因植物生产医药取得了一系列成果，科学家进一步设想利用转基因技术生 产用作疫苗的食用植物。他们将免疫机理与植物d n a 重组技术相结合，生产出 能使人体获得特异抗病能力的食用疫苗。利用转基因植物生产的疫莳极其安全， 因为植物病毒基本不感染人体，而利用动物病毒介导哺乳动物细胞所生产的疫莳 可能感染人类，这就消除了人们的担心。 作为疫苗要具有刺激机体产生抗体的能力，当细菌和病毒因子侵染卜皮绢 织时，疫苗刺激粘膜免疫系统在粘膜表面分泌免疫球蛋白l g a ( s 2 i g a ) 来抵御病 毒的侵染。 一般来说，通过口服产生的粘膜抗原的免疫反应比通过注射产生的粘膜免疫 反应效果好。已经证明，包括几种活的或灭活的微生物在内的特殊的抗原具有口 服免疫原性。与皮下注射免疫相比，使用亚基或可溶性抗原的口服免疫常常在刺 激免疫反应方面效率较高，且抗原需要量较小。早期的植物表达来自于肠内的病 原体抗原，人们把抗原组装成类似类病毒颗粒的有效结构，希望抗原能抗消化， 更易到达肠胃淋巴组织，且异源抗原进入肠胃淋巴组织时，更容易被觉察。这些 研究成果为利用转基因植物生产口服疫苗提供了理论及实践依据。1 9 9 0 年， c u r t i s s r 等报道，利用转基因烟草可表达链球菌变异株s p a a 蛋白，口服s p a a 后 在唾液中发现免疫球蛋白i g a ( s 2 1 9 ao 这是第例利用植物表达系统生产l 服 疫苗的报道。1 9 9 1 年，美国德克萨斯州农工大学生物科学技术研究所( 1 b t ) 的 a r n t z e n 研究小组开始研究用口服疫苗防治肠内疾病，包括由细菌引起的霍乱和 腹泻。他们成功地把大肠杆菌的抗原基因导入烟草和马铃薯，并使这两种作物表 达了大肠杆菌的抗原蛋白，食用这种马铃薯的小白鼠血液和肠胃器官的粘膜中都 存在大肠杆菌抗体。该研究小组还将一种引起腹泻的抗原基因( n o r wa i kv i r u s ， n v ) 导入莴笋、番茄和马铃薯，发现这3 种转基因蔬菜中都含有抗大肠杆菌病毒 的抗原蛋白，这种物质对霍乱细菌有免疫作用。 美国s c r i p p s 研究所m i t c h h e i n 利用土壤农杆菌把霍乱毒素的无毒性b 链基 4 因转移到苴蓿细胞，再将其培养成苗，食用这种苜蓿苗，霍乱毒素b 链很快被 喉、肠胃等部位的分泌性粘液细胞吸收，刺激特异性抗体大量产生，使机体获得 对霍乱的免疫。华盛顿大学r o yc u r t i s 成功地开发出一种转基因烟草，能生产抗 龋齿细菌的疫苗，英国科学家也有类似研究，丌发了种抗龋齿细菌的抗原蛋白。 目前植物疫苗领域研究比较较深入的是利用转基因植物生产口服乙型肝炎疫苘。 分子生物学家试图通过转基因植物获得安全、经济、有效、更适合广大发展中国 家的乙肝疫苗。 1 9 9 2 年，i b t 的a m t z e n 小组利用转基凶技术将美国临床使用的乙肘表面 抗原( h b s a g ) 基因导入烟草并使之表达，首先证明了这种蛋白能够在植物中表 达。对表达的t 1 1 3 s a g 进行分析，这些h b s a g 颗粒直径平均为2 01 1 n 1 ，其浮力密 度、抗原性同酵母及乙肝病人血清中得到的类似。把从这种烟叶中提取的h b s a g 注入小鼠胃内，、鼠体内产生了抗体。 总之，在植物中表达的抗原，其表位h b s a gt 细胞和b 细胞是保守的，烟草 植株中表达的抗原蛋白和市场商用抗原蛋白性质相似。1 9 9 5 年m a s o n 等义将 h b s a g 基因转入马铃薯中并得到表达，用这种马铃薯喂养小鼠，在小鼠体内检测 到保护性抗原，包括粘膜抗体，它们分泌到循环系统，能抵御细菌的侵染。这个 实验证明，转基因植物中表达的抗原可安全通过动物消化道并最终成为粘膜性 抗原，而且不会被蛋白酶降解，只需口服少量的乙肝表面抗原蛋白就可产生比较 好的免疫应答反应，并不比肌肉注射所需的量丈。利用烟草表达h b s a g 基因只 是为了研究工作的方便，其优点是生长周期短，易于遗传操作。但是烟草叶片中 含有高浓度的生物碱，不能进行动物饲喂实验。选用马铃薯进行乙肝表面抗原基 因的表达，目的是要进行动物饲喂实验，其优点是生长周期相对较短，遗传转化 也比较简单，而且具有块茎特异启动子。用转基因马铃薯成功的进行了动物门服 免疫实验，但是马铃薯不适合于人类生食，而高温煮熟会破坏其中h b s a g 的免 疫原性。要使转基因植物生产的疫苗成为人类口服疫苗，必须能在生食或只需简 单加工( 抗原蛋白加热会受到破坏) 的植物如蔬菜、水果上大量表达抗原蛋白。 1 9 9 6 年m a s o n 等利用基因枪将h b s a g 基因导入香蕉，有望得到含h b s a g 基因 的香蕉。 ( 二) 转基因植物疫苗在人体内免疫反应的途径 通过转基因植物生产某些口服疫茁，直接食用这些植物后经过肠道粘膜免疫 系统激发特异性免疫应答，初步研究认为，诱导机体产生相应抗体是通过粘膜免 疫系统产生粘膜抗体，能够使机体获得持久性的对病毒的防御能力。动物实验和 进一步的人体口服免疫实验都表明能够诱导机体产生相应抗体，激发免疫保护反 应。 一般情况下蛋白经过消化系统时被消化。但是植物细胞含有细胞壁，增强细 胞内蛋白的抗消化能力，有助于保护产生免疫作用的抗原蛋白。如果在抗原娃凶 附近加上一些修饰基因或信号肽基因序列，使得表达的抗原蛋白不易被迅速消化 或者将目的蛋白导入内质网等细胞器中，以延长抗原在胃肠道停留时咱j ，防止嗣 的蛋白被肠胃的蛋白酶消化。 ( 三) 转基因植物蛋白表达过程中存在的问题 1 转基因植物中蛋白表达量 许多目的基因已经在多种植物中得以表达，但是目前仍处于初级阶段，存在 许多问题，如表达量很低，目前转基因植物疫苗抗原蛋白的浓度为1 0 3 0g k g 。 乙肝表面抗原在植物中的表达一般占可溶性蛋白的o 0 1 左右，高的也只达到 o 3 7 。t a c k a b e r r y 等研究了人巨噬细胞病毒( h c m v ) 糖蛋白b 在大田条件下生 长的t ，代烟草种子中的表达情况，表明比温室中生长的t o 代提高了3 0 倍，占 种子总蛋白的1 0 7 0 0 0 。c h i k w a m b a 等研究了l t - b 在转基因玉米后代中的表达情 况，表明大田条件下生长的t 3 代，l t - b 占玉米籽粒可溶性蛋白的3 7 ，比温 室中生长的t 1 代提高了5 0 多倍( o 0 7 ) 。l e e 等研究了牛运输热病毒在白三叶草 中的表达情况，表明大田生长的白三叶草与温室生氏的白三叶草相比，抗原的表 达量相同。即使以后者为标准生产疫苗，含量仍然很低，需要进一步提高。通过 使用强启动子、前导序列和增强子，优化选择密码子，整合非依赖性的表达等手 段可提高蛋白表达水平。进一步提高植物抗原蛋白的含量或增加这种转基因植物 食用量，可提高免疫反应水平。由于抗原的表达量偏低，所以有限的蛋白会被蛋 白酶水解，而失去免疫原性，经吸收后，达不到诱导机体产生抗体反应( 初次免 疫应答) 的浓度，而失去作为疫苗的价值。所以植物性口服疫苗也可以作为一种 免疫增强剂，即在机体接种减毒疫苗或者重组疫苗，在免疫反应下降后，然后口 服植物性疫苗，达到增强免疫的效果。 2 抗原蛋白在转基因植物中的稳定性 抗原蛋白基因在转基因植物中能否稳定遗传，表达的抗原蛋白存在时删有多 长，以及在植物收获前后有何变化等问题有待进一步研究。抗原在植物中表达 时，可以被细胞壁保护，实现疫苗的“生物胶囊化”。w r i g h t 等较早地研究了抗原 在植物细胞中的稳定性，证明种子的贮存对抗原的活性没有影响，“生物胶囊化” 的疫苗能够长期保存而无需冷藏。随后的一些实验，研究了转基因植物在大阳条 件下生长的后代中抗原的稳定性，结果表明，不但抗原活性没有降低，而且抗原 的表达量还显著提高。t a c k a b e r r y 等将转基因种子5 0 v 烘干后，在室温下保存一 年抗原仍保持活性。 3 口服免疫的免疫耐受性及其免疫记忆 口服免疫产生的免疫耐受、免疫记忆程度是口服疫苗研究中的一个关键性问 题，g o m e z n 等的口服免疫试验中未发现免疫耐受，k o n g q 等的试验能产生免 疫记忆，但这是否符合所有的口服免疫，目前尚未得到证实。有资料表明，询：多 抗原的外壳蛋白可以组装成病毒样颗粒( v i r u s 1 i k ep a r t i c l e s ，v l p s ) ，它们虽然缺 乏病毒遗传物质的调控，但是仍然可以组装成在形态上、抗原性质和稳定性卜类 似于病毒的粒子，而引发比可溶性抗原更强烈的粘膜免疫反应，避免免疫耐受性， 因而形成病毒样颗粒是引发粘膜免疫最有效的手段。但目前许多实验结果都未对 抗原在转基因植物中的存在形式进行形态学鉴定，这可能会使实验结果存在1 些 潜在的问题。例如，目前研究较多的口蹄疫病毒( f m d v ) 疫苗，其表达的基因 集中在结构基因v p l 上，而f m d v 病毒粒子是由几个亚单位构成的复合结构， 不可能由单个的v p i 肽组装成稳定的病毒样颗粒。因此在植物中表达的未组装 的v p l 亚单位疫苗用作口服疫苗就受限制。尽管它保留了保护性表位，但有可 能以可溶性形式存在，而引发机体的免疫耐受性，这一点还急需要试验来证明。 4 转基因疫苗的安全性 迄今为止，利用动、植物作为生物反应器生产的重要药物有：人血清蛋白、 表皮生长因子、脑菲肽、干扰素、促红细胞生成素、生长激素、单克隆抗体等 ( m a t s u m o t oe ta l ，1 9 9 5 im o r ime ta l ，1 9 9 3 ；z e i t l i nl e ta l ，1 9 9 8 ；) 。利用植物 基n 3 2 程生产廉价、安全且使用方便的口服疫茁是其中的一个重要组成部分，也 是今后生物技术制药的发展方向之一。 利用转基因植物生产基因工程疫茁，是将抗原基因导入植物让其在植物中表 达，人或动物摄入该植物或其中的抗原蛋白质后，产生对此抗原的免疫应答。与 现行微生物发酵、动物细胞培养及转基因动物等系统生产疫苗相比，利用转基因 植物生产基因工程疫苗具有无可比拟的优越性：安全、无毒、方便。而细菌、昆 虫或者哺乳动物细胞表达系统存在着将内毒素或病毒传染给人类的潜在危险。植 物细胞则不会有潜在的动物或人类病原，因而来源于植物的重组蛋白安令性好。 因此，自九十年代以来，利用转基因植物生产基因工程疫苗的研究得到了迅 速的发展。目前主要利用两种表达系统稳定整合表达系统和瞬时表达系统束 表达外源基因。已获成功的主要有乙型肝炎表向抗原( h b s a g ) 、不耐热肠毒素 b 亚单位( 疆一b ) 、链球菌突变抹表面蛋白( s p a a ) 等十多种疫茁。涉及植物 受体主要是烟草、马铃薯等模式植物，也在番茄、香蕉等植物中尝试并取得可喜 成果。 三该研究的目的、意义和内容 ( 一) 研究的目的和意义 毕赤酵母是甲醇营养型酵母菌，生长迅速，培养条件简单，可高密度连续 培养，操作技术成熟，非常适合于外源基因的表达。乙肝病毒比较容易变异，利 用不同的变异株基因生产的乙型肝炎疫苗的免疫效果也不尽相同，针对中国是乙 型肝炎a d r 亚型高发区的特点，该研究通过对a d r 亚型乙肝病毒表面抗原基因进 行表达，据此研究表达产物作为乙肝疫苗的可行性，以图开发具有增强免疫作用 的乙肝疫苗。 葡萄作为世界四大水果之，是生产口服疫苗的良好受体材料，据我们所掌 握的资料，目前国内外没有利用转基因葡萄表达乙肝表面抗原的报道。转基因葡 萄生产乙肝疫苗的研究和开发具有很大的创新性，具有广泛的应用前景。它改变 了传统疫苗的接种方式，以口服葡萄或葡萄汁的途径来接种疫苗；降低了疫苗的 生产成本，省略了下游工作，简化了疫苗的保藏和运输条件。 本实验利用葡萄为受体材料旨在探索乙肝表面抗原基因在葡萄中表达的可 能性，为进步开发乙肝口服疫苗打下基础。并利用葡萄果实可以鲜食的特点， 构建h b s a g 的高表达载体用以转化葡萄，最终达到利用转基因葡萄生产口服乙 肝疫苗的目的，这对于我国防治a d r 亚型肝炎有重要意义。 ( 二) 研究内容 目前的主要任务是克隆乙型肝炎病毒表面抗原小蛋白基因片段( h b s a g s ) ， 先构建毕赤酵母表达载体，通过诱导使目的基因在酵母中快速表达，快速鉴定表 达的乙肝表面抗原的活性。为后续植物表达铺平了道路。然后构建h b s a g 基因 植物表达载体，利用农杆菌l b a 4 4 0 4 介导转入葡萄愈伤组织中，筛选出转基因 的葡萄愈伤组织。研究目的基因在葡萄组织中的表达情况，为研究外源基囡表达 产物的免疫活性，以及利用葡萄等植物生产植物疫苗提供一定的试验基础。 第二部分毕赤酵母表达乙肝表面抗原 一实验材料 ( 一) 质粒和菌株 p u c l 9 购自华美生物工程公司西安分公司 酵母菌株g s l l 5 购自 n v i t r o g e n 公司 p b l l 2 1 h b 本实验室保存 p p i c 3 5 k 购自i n v i t r o g e n 公司 d h 5d 、j v i i 0 9 购自北京鼎国生物技术有限公司西安分公司 ( 二) 主要试剂 限制性内切酶购自t a k a r a ；v e n t rd n a 聚合酶购自n e we n g l a n db i o l a b s ； t 4d n a 连接酶购自f e r m e n t a sl i f es c i e n c e s ；p c r 产物纯化试剂盒购自碧云天 生物技术研究所；凝胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司；质粒提取 试剂盒购自碧云天生物技术研究所；乙型肝炎病毒表面抗原( h b s a g ) e l i s a 试 剂盒购自北京万泰生物药业有限公司；y n b 培养基d n t p 购自上海生物工程 有限公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 ( 三) 主要仪器 h i m a cc r2 2 g 型高速冷冻离心机 同本 5 4 1 5 d 台式离心机 e p p e n d o r f 公n t g 3 2 8 电光分析天平 上海天平仪器厂 紫外可见分光光度计7 5 1 一g w 上海分析仪器厂 d y y - i i i 一2 1 1 型垂直平板电泳槽北京六一仪器厂 d y y - 1 1 1 5 型电泳仪 北京六一仪器厂 恒温振荡器 金坛市富华仪器厂 p c r 仪 英国 凝胶成像系统c o l ds p r i n g uq u a n t 酶标仪 b i o t e k e l x 5 0 洗板机 b i o t e k ( 四) 基本培养基 1 母液 ( i ) 1 0 x y n b ：每升含3 4 9 酵母基础氮源培养基( 无硫酸铵) 和1 0 0 9 硫酸铵， 过滤除菌，4 。c 保存。 ( 2 ) 5 0 0 x b ：将2 0 r a g 的生物素溶于1 0 0 m l 水中，过滤除菌，4 保存。 ( 3 ) 1 0 0 x h ：4 0 0 m g 的l 一组氨酸溶于1 0 0 m l 水中，过滤除菌，4 保存。 ( 4 ) 1 0 x d ：2 0 0 9 葡萄糖溶于1 0 0 0 m l 水中，高压灭菌1 5 分钟或者过滤除菌。 ( 5 ) 1 0 x m ：将5 m l 甲醇与9 5 m l 水混匀，过滤除菌。 ( 6 ) 1 0 x g y ：将i 0 0 m l 甘油和9 0 0 m l 水混匀后，高压灭菌或者过滤除菌。 ( 7 ) 1 m 磷酸钾溶液：将1 m o i l 的k 2 h p 0 4 溶液1 3 2 m l 与l m o l l 的k h 2 p 0 4 溶 液8 6 8 m l 混匀，其p h 为6 0 。 2 培养基 ( 1 ) l b 培养基： 每升含胰蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c l1 0 9 。用n a o h 调p h 值至7 0 ， 灭菌。加1 5 9 琼脂配成固体培养基。 ( 2 ) y p d 培养基： 每升含酵母提取物1 0 9 ，蛋白胨2 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，灭菌后待用。 ( 3 ) m d 培养基： 1 0 x y n b 1 0 0 m l 5 0 0 b2 m l 1 0 x d1 0 0 m l 定容至1 0 0 0 m l ，4 。c 保存。 ( 4 ) m d h 培养基： 配制1 0 0 0 m l m d h ，在m d 培养基中加入1 0 m l 的1 0 0 x h ，4 4 c 保存。 ( 5 ) b m g y 培养基： 1 3 4 y n b 0 0 0 0 0 4 生物素 1 酵母提取物 2 蛋白胨 l 甘油 o 1 m 磷酸缓冲液，p h 7 0 ( 6 ) b m m y 培养基： 以0 5 甲醇替代甘油，其余成分和b m g y 相同。 二实验方法 ( 一) 目的基因获得 根据n c b i 中登陆号为a y 6 4 6 4 4 4 1 的序列设计对引物，其引物序列如下 p 1 ：5 a a c g g g a t c c c g c ac c a t g g a g a a c a c a a c a t c a 3 p 2 ：5 c c c g g a a t t c c g g c t