（临床医学专业论文）胡椒碱对兔心房急性电重构和心肌氧化损伤保护作用研究.pdf

南开大学学位论文使用授权书 y q l l l l l l l18i1 1 1 i i l 3 1 9 i i 2ii i 4 1 1 1 1 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、帧士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h h p ：# 2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字：焦凯 2 0 1 0 年0 5 月2 6 日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 胡椒碱对兔心房急性电重构和心肌氧化损伤保护作用研究 姓名任凯学号 0 3 1 1 1 6 7 答辩日期2 0 1 0 年5 月2 3 日 论文类别博士口学历硕士口硕士专业学位口高校教师口同等学力硕七口 院系所 医学院专业 临床医学 联系电话1 3 8 1 1 7 5 6 9 9 5e m a i l f a i r y r e n 12 6 t o m 通信地址( 邮编) ：北京市海淀区复兴路2 8 号解放军总医院心内科( 1 0 0 8 5 3 ) 备注：是否批准为非公开论文否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取 得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任 何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的 研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文 原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：焦凯2 0 1 0 年0 5 月2 6 日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申请 和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本说明 为空白。 论文题目 申请密级 口限制( 2 年)口秘密( 1 0 年)口机密( 2 0 年) 保密期限 2 0 年月日至2 0年月日 审批表编号批准日期 2 0 年月日 限制2 年( 最长2 年，可少于2 年) 秘密1 0 年( 最长5 年，可少于5 年) 机密2 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) 目的：研究回心草的活性成分胡椒碱对家兔快速心房起搏诱发及模拟房颤 时的急性电重构和心肌氧化应激损伤的保护作用及其可能的作用机制。 方法：取2 4 只健康新西兰白兔作为研究对象，随机分成4 组，即生理盐水 空白对照组( n s ) ，生理盐水+ 起搏组( n s + 凡廿) ，胡椒碱组( p i ) 和胡椒碱+ 起搏组( p i + 砒钟) 。实验中应用快速心房起搏方法造成心房急性电重构，起搏组 以5 0 0 - - 6 0 0 b p m 起搏心房3 h ，测量每只动物在起搏后0 h 、0 5 h 、1 h 、1 5 h 、2 h 、 2 5 h 和3 h 的心房有效不应期，并计算不同基础起搏周长下心房有效不应期的频 率适应性。实验结束后，立即解剖兔心房组织，分离出左心房、右心房和肺静 脉组织，然后利用生化试剂盒测定出各部位心肌组织的m d a 含量、s o d 活力、 x o d 活力和钙离子含量。对所得结果利用统计学软件s p s s l 7 0 进行相应的统计 学分析。 结果：( 1 ) 实验过程中只在n s + r a p 组动物可诱发出阵发性房颤或房速， 而其他三组均无类似现象出现。( 2 ) n s 和p i + r a p 组中的a e r p 随时间没有明显 改变，而n s + 廿组的a e r p 随时间明显缩短。n s + r a p 组中的a e r p 频率适 应性随时间明显下降，在起搏后l h 出现最低值( 一0 2 4 0 5 9 ) ，而其他三组中 的a e r p 频率适应性均未发生显著变化。( 3 ) 左心房和肺静脉部位的m d a 含量 在p i + 廿组明显低于n s + r a p 组( p 0 0 1 ) ，而右心房m d a 含量两组无显著 差异。( 4 ) 只是肺静脉部位的s o d 活力在p i + 融岬组明显高于n s + r a p 组，其 他两个部位p i + 凡廿组与n s + r a p 组没有显著差异。( 5 ) 左心房和肺静脉部位的 x o d 活力在p i + 凡心组明显低于n s + r a p 组( p o 0 5 ) ，而右心房部位的x o d 活力两组无显著差异。( 6 ) p i + 黜婶组中各部位的钙含量均明显低于n s + 凡心组。 摘要 结论：( 1 ) 胡椒碱可以防止房颤时a e r p 的缩短和a e r p 频率适应性的降低， 同时也有效地降低了房颤的发生率，说明胡椒碱可以减轻心房的急性电重构现 象。( 2 ) 胡椒碱可以通过抑制房颤时脂质过氧化物m d a 的过量产生；减少应激 时抗氧化酶s o d 的损耗，恢复其活力；抑制氧化酶x o d 的活力和钙超载现象 的发生这些途径，来减少房颤时的氧化应激损伤，从而对房颤时的心肌起到有 效的保护作用。( 3 ) 房颤时，肺静脉部位心肌组织氧化损伤程度最重，而右心房 部位相对损伤最轻，同时胡椒碱的抗氧化效果在肺静脉部位最明显。 关键词：胡椒碱；快速心房起搏；氧化应激；心房颤动；兔 i i a b s t r a c t a t r i a lf i b r i l l a t i o ni so n eo ft h ec o m m o n e s tc o m p l i c a t e dc a r d i a ca r r h y t h m i a s i t s e x i s t e n c ec a u s e si n c r e a s i n gm o r t a l i t ya n dc a r d i o g e n i cs u d d e nd e a t h s ，s oi th a sb e c o m e am a j o rc a u s eo fd e a t ha n dd i s a b i l i t y a sar e s u l t ，a t r i a l f i b r i l l a t i o ni sas i g n i f i c a n t f i e l di nc a r d i o l o g yr e s e a r c h e s a tp r e s e n t ，i ti sd e f i n i t et h a ta fl e a d st oa c u t ea t r i a l e l e c t r i c a lr e m o d e l i n ga n da fi sc l o s e dr e l a t e dt oo x i d a t i v es t r e s s t h e n ，i th a s b e c o m e 0 1 1 eo fo u rg o a l sf o rr e d u c i n ga fi n c i d e n c ea n de n h a n c i n gt h ep r o g n o s i so fa f p a t i e n t st h a tw es h o u l df i n da e f f e c t i v ea n ds a f ed r u g o b j e c t i v e ：i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ep o t e n t i a lm e c h a n i s mo f p i p e r i n e ，w h i c h i s t h ea c t i v es u b s t a n c ef r o mr h o d o b r y u mr o s e u ml i m p r ，o na c u t ea t r i a l e l e c t r i c a l r e m o d e l i n gi na t r i a l f i b r i l l a t i o nb yi n d u c i n go fr a p i da t r i a lp a c i n g ，a sw e l la si t s p r o t e c t i v ee f f e c to ni n j u r yo f o x i d a t i v es t r e s si nm y o c a r d i u m m e t h o d s ：2 4h e a l t h yr a b b i t sw e r ec o l l e c t e d ，a n dr a n d o m l ya s s i g n e dt o4g r o u p s a l sf o l l o w s ：n o r m a ls a l i n e ( n s ) ，n o r m a ls a l i n e + r a p i da t r i a lp a c i n g ( n s + 心) ，p i p e r i n e ( p i ) ，p i p e r i n e + r a p i da t r i a lp a c i n g ( p i + r a p ) i nt h es t u d y , a c u t ee l e c t r i c a lr e m o d e l i n g w a sc o n d u c t e db yr a p i da t r i a lp a c i n g i np a c i n gg r o u p ，r i g h ta t r i u mw a sp a c e dw i t ha f r e q u e n c yo f5 0 0 6 0 0 b p mf o r3h o u r s ，a t r i a le f f e c t i v er e f r a c t o r yp e r i o dw a s m e a s u r e d a to h ，0 5 h ，l h , 1 5 h ，2 h ，2 5 ha n d3 ha f t e rp a c i n g ，r e s p e c t i v e l y t h e nw ec a l c u l a t e d t h er a t ea d a p t a t i o no fa t r i a le f f e c t i v er e f r a c t o r yp e r i o d si nd i f f e r e n tb a s i cp a c i n gc y c l e l e n g t h s s o o na f t e rt h ee x p e r i m e n t ，w ed i s s e c t e dt h ea t r i u mo f r a b b i t s ，t h el e f ta t r i u m ， r i g h ta t r i u ma n dp u l m o n a r yv e i n sw e r ed i s s e c t e d ，c o n s e q u e n t l yt h el e v e l so fm d a ， s o d ，x o da n dc a l c i u mw e r em e a s u r e dw i t hs p e c i a lk i t s a l l t h er e s u l t sw e r e a n a l y z e dw i t hs p s s 17 0 r e s u i t s ：( 1 ) i nt h ee x p e r i m e n t ，p a r o x y s m a l a t r i a lf i b r i l l a t i o no ra t r i a l t a c h y c a r d i ac a l lb ei n d u c e do n l yi nn s + r a pg r o u p ，w h e r e a sn o s i m i l a rp h e n o m e n o n w a so b s e r v e di nt h eo t h e r3g r o u p s ( 2 ) a e r pw a sm a r k e d l ys h o r t e ri nn s + 凡岬 g r o u pb u ti tw a sn o tc h a n g e di nn sa n dp i + r a pg r o u p t h er a t ea d a p t a t i o no fa e r p i i i ns + l 乙p b u tn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a so b s e r v e di no t h e rl o c a t i o n sb e t w e e n p i + r a pg r o u pa n dn s + r a pg r o u p ( 5 ) x o da c t i v i t yi nl aa n dp vi sl o w e ri n p i + r a pt h a nt h a ti nn s + r a p ( p 9 8 0 ，配制成浓度为2 0 的5 0 0 m l 溶液备用，装入试 剂瓶中，保存于4 。c 冰箱备用。 3 酒石酸美托洛尔注射液：广州白云山天心制药股份有限公司提供，产品批 号：0 6 1 2 0 1 ，规格为5 m 1 5 m g 。 4 硫酸阿托品注射液：天津金耀氨基酸有限公司提供，产品批号：0 9 0 7 0 2 1 ， 规格为l m l 0 5 m g 。 5 盐酸利多卡因注射液：天津药业焦作有限公司提供，产品批号：0 9 0 8 1 6 4 1 ， 规格为5 m 1 o 1 9 。 6 考马斯亮兰蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所提供。 7 组织m d a 试剂盒：南京建成生物工程研究所提供。 8 组织s o d 活力试剂盒：南京建成生物工程研究所提供。 9 组织x o d 活力试剂盒：南京建成生物工程研究所提供。 5 2 2 2 实验仪器与设备 5 f 电极( 附录图1 ) 多导电生理记录仪( 附录图2 ) 程控电生理刺激器( 附录图3 ) 离心机 微型漩涡混合仪 d u 6 4 0 分光光度计 1 0 0 0 u l 移液器 2 0 0 u l 移液器 恒温水浴锅 吸痰管 压舌板 5 m l 、l o m l 、2 0 及5 0 m l 注射器若干 实验用电动动物剃毛器 可调节输液泵若干 4 冰箱 8 0 冰箱 电子天枰 2 2 3 实验器械 研究所提供。 c o r d i s ，4 极，电极间距l c m 华南公司，g y - 6 3 2 8 型3 2 道电生理记录仪 型号：b i o f u g e 2 2 r 上海泸西分析仪器厂 动物灌胃使用 动物灌胃使用 主要实验器械有无菌手术器械( 剪毛剪、手术剪、眼科剪、眼科镊、蚊氏 钳、小弯钳、组织钳、血管夹、解剖刀柄及刀片) ，手术用纱布，棉球及棉签， 开胸器，人工辅助呼吸器械，供氧设备，缝线及缝针，不同容量的注射器等。 第三节实验方法 2 3 1 实验动物分组及喂养方式 6 ( n s ) 、 r a p ) 。 各组动物在性别、体重方面无明显差异。 全部动物于解放军总医院动物实验中心精饲料常规喂养，为了药物吸收充 分，每只动物采用实验f j 三日开始进行干预药物灌胃。基础研究中胡椒碱的应 用剂量主要是1 0 - - 1 0 0m g k g 【2 4 。2 7 j ，本研究选定常用剂量胡椒碱2 0m g k g 作为给 药剂量，每天给动物灌入一次，连续三日。n s + r a p 组和n s 组灌入等量的生理 盐水。经前期试验，自制成家兔灌胃器，即取压舌板，制成蝴蝶状，于正中开 一小圆孑l 作为开口器，并备吸痰管一根，连接2 0m l 注射器。 兔经口灌胃给药的方法：将实验用兔放在实验台上，用左手握住兔的头颈 部，用拇指和食指压迫其口角部使口张开，把开口器置于兔的上、下腭齿之间， 并固定。右手持吸痰管由开口器的小圆孔，沿咽后慢慢进入食道插入胃中，如 位置插入正确，就可看见家兔自动吞服，如位置不正确，则动物就会乱动，此 时应立即拔出，重新插入，为防止插入气管内，可将吸痰管外端放入盛水的小 烧杯中，若不冒气泡则说明已插入胃中，反之则要重插。等把药物注完，再以 少量清水冲洗残留管内药液后，慢慢抽出。兔一次灌胃耐受的最大容积为8 0 1 5 0 m l t 弱j ，本研究每只动物一次灌入量均小于2 0m l 。 2 3 2 动物模型的建立 1 、动物麻醉 以n s + r a p 组为例，实验动物在术前1 2 小时禁食，6 小时禁水。术前约半 小时以5m l k g 耳缘静脉注射已配好的氨基甲酸乙酯溶液进行麻醉，实验过程中 可根据情况追加适量麻醉药物。保留建立的静脉通路，以便实验中补充丢失液 体及其他药物。 2 、植入起搏电极 麻醉起效后，将家兔仰卧于动物手术台上固定( 附录图4 ) ，然后于颈部及 胸部备皮，剪除兔毛。实验人员穿戴手术衣帽，常规用碘酒、酒精消毒后铺巾， 局部用2 利多卡因麻醉，沿气管正中切开颈部皮肤及皮下组织，钝性分离出左 右两侧颈外静脉( 一般用右颈外静脉，而左颈外静脉于右侧插管失败后备用) 。 将分离清晰的一段右侧颈外静脉，先远心端用手术缝线结扎，然后用眼科剪斜 7 第二章实验材料及方法 行切开“v 形切口，用5 f 电极顺切口插入右心房用于心房起搏和描记心内膜 电位，连接多导电生理记录仪，调整电极位置，待记录到大的心房信号a 波和 小的心室信号v 波时为有效，这时将电极固定，结扎近心端静脉( 附录图5 和 附录图6 ) 。同时设定脉宽2 m s ，测定起搏阈值，设定2 倍起搏阈值为输出电压。 程控起搏前，对实验动物注射美托洛尔( 2 0 0u g k g ) 及阿托品( 4 0u g k g ) 以阻 断自主神经对心脏的影响，并在实验过程中以美托洛尔2 0 u g ( 埏) 和阿托品 7 u e d ( 妊聿h ) 维持静滴。 3 、动物模型的建立及监测 将电极与多导电生理记录仪及程控电生理刺激器相连接，在测定基础a e r p 后，采用连续单刺激模式进行l ：1 的快速心房起搏，设定起搏频率为5 0 0 - 6 0 0 b p m ，记录程控起搏前及起搏后的心内膜电图，并在实验过程中监测其形态 和家兔的反应状态( 图2 1 和图2 2 ) 。 图2 1生理情况下监测到的家兔正常心腔内电图大a 小v 波 8 第一章实验材料及方法 l 夕 v 妇 时f歹k 荔么 l 彩w0k彭b步 矿 0 乡 h v p p d 6 i p p 0 6 r r 图2 三卡l 谏i 、 | l ；击己茸is n f|1 n 1 ml 小家，白小防i1 由圆 速起搏其他方法同上述n s + r a p 组。 2 3 3 电生理参数的测定 1 心房有效不应期( a e i 冲) 的测定 a e r p 的测定用s 1 s 2 程序递增刺激法，s 1 s 2 程序刺激比例为8 ：l ，以2 m s 为步长自不应期内递增扫描，刺激延迟5 s 。a e r p 定义为：s 2 后不引起心房激 动的最长s 1 s 2 间期( 图2 3 和图2 4 ) 。在测定基础的a e r p 后，分别于起搏后 0 5 、1 、1 5 、2 、2 5 和3 h 的连续不同时间点再次测定a e r p ，并观察其随时间 的变化趋势。每只动物每个时间点分别重复测定3 次，平均值记为a e r p 2 0 0 和 a e r p l 5 0 。 9 图2 3 测定a e r p 2 0 0 时递增扫描过程中s 2 后不引起心房激动的心腔内电图 图2 4 测定a e r p l 5 0 时递增扫描过程中s 2 后引起心房激动的心腔内电图 2 心房有效不应期的频率适应性( r a t ea d a p t a t i o no fa t r i a le f f e c t i v er e f r a c t o r y p e r i o d ) 的计算 以基础周长分别为2 0 0 m s 和1 5 0 m s 两个不同的基础周长进行s 1 s 2 递增扫 描，观察其随基础周长延长a e r p 的变化，同时以( a e r p 2 0 0 a e r p l 5 0 ) 5 0 m s 作为a e r p 频率适应性的判断指标。 1 0 2 3 5 氧化应激指标的测定 ，用冷盐水冲洗 r a ) 及肺静脉 1 考马斯亮兰法组织蛋白测定 ( 1 ) 组织蛋白定量测定原理 蛋白质分子具有n h ”基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液 或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白- n h 3 + 基团结合，使溶液变为蓝 色，通过测定吸光度可计算出蛋白含量。 ( 2 ) 样本前处理 准确称取待测组织的重量，按重量体积比加生理盐水制备成1 0 的组织 匀浆，1 0 0 0 - - 3 0 0 0 转分，离心1 0 分钟( 根据所测指标不一样则所需转速不一 样) ，然后取组织匀浆上清再用生理盐水按l ：9 稀释成1 组织匀浆，或用生 理盐水按l ：4 稀释成2 的组织匀浆，待测。血清可用生理盐水按血清：生 理盐水= l ：4 9 稀释，待测。其它体液等均按比例稀释，总的来说，测定范围 为i g l ( m g m 1 ) 左右为宜，( 不同的样本稀释度不一样) ，在批量测试前先做1 2 个样本的预试。 ( 3 ) 操作表 空自管标准管测定管 蒸馏水( m 1 ) o 。0 5 0 5 6 3 9 1 标准液( m 1 ) o 0 5 样品( m 1 )0 0 5 考马斯痹兰缸。剂( m 1 )3 03 03 。o 混匀，静置1 0 分钟，于5 9 5 n m 处，l c m 光径，蒸馏水调零，测各管o d 值。( 如 果样本量很少，将样本、标准及试剂均减半量。) ( 4 ) 计算公式 第二章实验材料及方法 蛋自含量cg ，篁罢纂善号罟羞三差觥标准管浓度cg l ， 2 组织丙二醛( m d a ) 含量的测定 ( 1 ) m d a 测定的原理 过氧化脂质降解产物中的m d a 可与硫代巴比妥酸( t b a ) 缩合，形成红 色产物，在5 3 2 n m 处有最大吸收峰。 因底物为硫代巴比妥酸( t h i b a b i t u r i c a c i d ，t b a ) 所以此法称t b a 法。 ( 2 ) 样本前处理 准确称取组织重量，按重量体积比加入9 倍的生理盐水制成1 0 的组织匀 浆，2 5 0 0 转分，离心1 0 分钟，取上清匀浆待测。 ( 3 ) 操作表 标准管空囱管测定管 1 0 nm o l m l 勃j 准晶( m 1 )o 1 无水乙醇( m 1 )o 1 褥测样本( m 1 ) o 1 试痢一( m 1 ) o 1 o 1 0 1 澎匀( 摇动儿卜试管架) 试蒯二( m 1 ) 3 o3 o3 o 试勰三( n 1 1 ) 1 o1 o1 o 旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，沸水浴4 0 分钟， 取出后流水冷却，然后3 5 0 0 转分，离心1 0 分钟，取上清，5 3 2 n m 处，l c m 光 径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。 ( 4 ) 组织m d a 含量计算 组织巾m d a 含量 测定管吸光度一溺定空角管吸光瘦 标准品浓度蛋自含量 ( n m o l m g p r o t ) 标准管吸光度一标准空翻管f 教光度”( ! o n m o l m 1 ) ( m g p r o t m 1 ) 木n m o l m g p r o t 为纳摩尔毫克蛋白 3 组织超氧化物歧化酶( s o d ) 活力的测定 ( 1 ) s o d 活力测定的原理 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基( 0 2 。) ，后者氧 化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测 1 2 由基有专一性的抑制作 氐于对照管的吸光度值， 通过公式计算可求出被测样品中的s o d 活力。 ( 2 ) 样本前处理 准确称取组织重量，按重量体积比加入9 倍的生理盐水制成1 0 的组织匀 浆，2 5 0 0 转分，离心1 0 分钟，取上清稀释成2 的匀浆待测。 ( 3 ) 操作表 试桶测定管对照管 试剃一( m 1 ) 1 o1 o 待测弹本( m 1 ) o 0 5 蒸馏水( m 1 ) 0 。0 5 试削：( m 1 ) o 1o 1 试j ； 【：兰( i l l l ) o 1o 1 试毹p q ( m 1 ) 0 1o 1 用旋涡混匀器充分混匀，置3 7 恒温水浴4 0 分钟 敛色铡( m 1 ) l 2 0 l 2 。o i 混匀，室温放置1 0 分钟，于波长5 5 0 n m 处，l c m 光径比色杯，蒸馏水调零，比 色。 ( 4 ) s o d 活力的计算 单位定义：每毫克组织蛋白在l m l 反应液中s o d 抑制率达5 0 时所对应的 s o d 量为一个s o d 活力单位( u ) 。 计算公式： 组织6 = l 浆巾敷) d 活力。整墨笪墨丝壅二翌窒篁堕垄壅5 0 星鐾鲨垫签篓组织巾蛋白含量 ( u 俄舻r o t ) 对照管吸光发 。 取样筮( 掰，) ( m g p r o t m r ) 4 组织黄嘌呤氧化酶( x o d ) 活力的测定 ( 1 ) x o d 活力测定原理 x o d 可催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，与此同时产生超氧阴离子自由基，当有 电子受体及显色剂存在的情况下，生成紫红色结合物，根据后者生成量的多少 可以推算出x o d 的活力。 ( 2 ) 样本前处理 准确称取组织重量，按重量体积比加入9 倍的生理盐水制成1 0 的组织匀 浆，2 5 0 0 转分，离心1 0 分钟，取上清再用生理盐水稀释成2 的匀浆待测。 第二章实验材料及方法 ( 3 ) 操作表 空白管测定管 蒸僻水( m 1 )0 。0 2 5 样本( m 1 )0 0 2 5 试测一( 1 1 1 1 ) 1 o1 o 试铡二( m 1 ) 0 0 5o 0 5 试捌兰( f l j l ) 0 2o 2 试毹阴( m 1 ) o 。0 2o 0 2 ；涎匀，3 7 水浴2 0 分钟 混匀，5 3 0 r u n ，l c m 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度o d 值。 ( 4 ) x o d 活力的计算 单位定义：每克组织蛋白在3 7 。c 每分钟转化1l am o l 的底物所需的酶量为一个 酶活力单位。 计算公式： 组织匀黼d 秀力 测定管( ) d 德一空f 管o 馓反澎液总，蓐积 1 匀浆蟹f 1 含鬣 j g p r o t ) 呈色物垮尔消光系数 j 玖样肇 必径反应时间( g p r o tj l ) 5 组织中钙含量的测定 ( 1 ) 测定原理 血清中钙离子在碱性溶液中与甲基百里香酚蓝( m t b ) 结合，生成蓝色络 合物。通过比色与同样处理的钙标准进行比较，可计算出钙的含量。 ( 2 ) 样本前处理 准确称取组织重量，按重量体积比加入9 倍的生理盐水制成1 0 的组织匀 浆，2 5 0 0 转分，离心1 0 分钟，取上清匀浆待测。 ( 3 ) 操作表 1 4 第二章实验材料及方法 空白管 勃：准管测定管 双蒸水( m 1 ) 0 0 5 2 5 m m o l l ，钙翻：准液( m 1 ) o 0 5 待测样本( m 1 )o 0 5 m t b 试齐( m 1 ) 1 o1 o1 o 碱性溶液( m 1 ) 2 02 02 。o 蛋白澄清勰( m 1 ) o 。1o 1o 1 混匀，静置5 分钟后，波长6 1 0 n t o ，l c m 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。 ( 4 ) 计算公式： 维织巾钙含量溯定管吸光度一空一管吸光度 标准管浓度待测匀浆蛋自含量 ( r a m 。l g p m f ) 2 丽磷丽而e 甄霜丽( 2 5 删。i ll ) ( 留r o t l ) 注：g p r o t l 为兜蛋白升 2 3 6 统计学处理 所有数据以i s 表示，运用统计学软件s p s s l 7 0 ，按需要采用单因素方差 分析( a n o v a ) ，如为非正态分布用非参数的秩和检验。以p 0 0 5 为差异有显 著性，具有统计学意义。 1 5 第二章实验材料及方法 1 6 2 4 只家兔中除1 只n s + r a p 组动物死于模型建立过程中的心房撕裂大出血， 其余2 3 只均顺利完成实验。在快速起搏期间n s + 凡廿组中每只家兔均偶有不同 程度地诱发出阵发性房颤或房速发作( 图3 1 ) ，一般暂停刺激后能自动转复成 窦性心律，但有1 只在2 h 时出现持续性房颤，经药物和电刺激除颤均无法转复， 遂死于心脏大出血。相比较而言其他三组家兔并没有出现阵发性房颤或房速现 象。实验过程中家兔安静，未出现其他心律失常等意外情况。 图3 1n s + r a p 组诱发出房颤时心腔内电图 第二节电生理学测定结果 3 2 1a e r p 的变化情况 1 相同基础周长下r a p 前后同组中不同时间点的a e r p 变化 1 7 第三章结果 基础周长2 0 0 m s 和1 5 0 m s 下，心房起搏前后各组不同时间点的a e r p 统计 结果( 表3 1 和表3 2 ) 。各组不同时间点的a e r p 均与同组中的0 h 时a e r p ( 即 起搏前基础的a e i 冲) 相比较，结果如下：在不给予心房快速刺激的情况下观察 3 h ，n s 组a e r p 2 0 0 和a e r p l 5 0 均无明显变化；而在p i 组中a e r p 有延长的趋势， 其中a e r p 2 0 0 只在起搏1 h 和1 5 h 与基础值有显著性差异，之后的时间点与基础 值并无差异，同时在起搏1 h 达到最大值( 与基础值比较，p = 0 0 3 4 0 0 5 ) , a e r p l 5 0 却明显随时间延长，并在起搏2 h 达到最大值( 与基础值比较，p = 0 0 0 1 0 0 1 ) 。 在给予心房快速刺激的情况下观察3 h ，n s + r a p 组a e r p 2 0 0 明显缩短，并在起 搏2 h 达到最小值( 与基础值比较，p = 0 0 0 2 0 0 1 ) ，而a e r p l 5 0 只在起搏2 h 与 基础a e r p 比有显著缩短，其他时间点并无明显变化，并也在起搏2 h 达到最小 值( 与基础值比较，p = 0 0 4 7 0 0 5 ) ；p i + 廿组，心房快速刺激前后a e r p 均无 明显变化( 图3 2 和图3 3 ) 。 表3 1 基础起搏周长为2 0 0 m s 时各组a e r p 的变化 与各组的o h 相比，i p o 0 5 ；与n s + r a p 组比较，c p o 0 5 ；( n = 6 ，牙s ，m s ) 表3 2 基础起搏周长为1 5 0 m s 时各组a e r p 的变化 与各组的o h 相比，l p 0 0 5 ) 。( 3 ) 起搏1 h 时， a e r p 2 0 0 中p i + r a p 组明显比n s + r a p 组延长( p = o 0 0 0 0 0 5 ) ，而此时的另外 两组与n s + r a p 比无差异；同样a e r p l 5 0 中也是p i + r a p 组明显延长了( p = 0 0 2 0 o 0 5 ) ，而其他两组与n s + r a p 比无差异。( 4 ) 起搏1 5 h 时，a e r p2 0 0 中p i + 岬 组比n s + r a p 组明显延长( p = 0 0 0 2 0 0 5 ) ，而其他两组与n s + r a p 组无明显 差异；此时的a e r p l 5 0 中，n s 和p i + 廿组比n s + r a p 组明显延长，p i 组却与 n s + r a p 组无显著差别。( 5 ) 起搏2 h 时，a e r p 2 0 0 和a e r p l 5 0 中变化趋势相同， 均是n s 和p i + r a p 组比n s + r a p 组显著延长，而p i 组却与n s + r a p 组无明显 差别。( 6 ) 起搏2 5 h 时，a e r p 2 0 0 中n s 和p i + 凡廿组比n s + r a p 组显著延长，而 p i 组却与n s + r a p 组无明显差别；但到了a e r p l 5 0 中却发生了变化，此时的四 组问均无显著性差异。( 7 ) 起搏3 h 时，a e r p 2 0 0 中只有p i + r a p 组明显比n s + r a p 组延长了，而其他两组均与n s + 砒廿组无显著差别；a e r p l 5 0 中四组间均无显 著差别( 图3 4 和图3 5 ) 。 图3 4 基础起搏周长2 0 0 m s 时同一时间点各组a e r p 比较 2 0 图3 5 基础起搏周长1 5 0 m s 时同一时间点各组a e r p 比较 3 2 2a e r p 频率适应性的变化情况 在不给予心房快速刺激的条件下观察3 h ，n s 组的a e r p 频率适应性无明显 变化，而p i 组中只有在3 h 时间点与起搏前的a e r p 频率适应性相比有明显下降， 起搏前的( a e i 冲2 0 0 - a e r p l 5 0 ) 5 0 m s 为( o 1 5 0 0 6 ) ，起搏后3 h 的为( 0 0 9 0 0 7 ) ， p = 0 0 3 7 0 0 5 。另外两组在给予心房快速刺激3 h 后，n s + 凡心组a e r p 频率适 应性在起搏后l h 有明显的降低，起搏前( a e i 冲2 0 0 a e r p l 5 0 ) 5 0 m s 为( 0 1 2 o 0 8 ) ， 起搏后l h 达到最低值为( 0 2 4 0 5 9 ) ，p = 0 0 2 1 0 0 5 ，p i + 黜婶组的a e r p 频率 适应性未发生显著变化( 表3 3 和图3 6 ) 。 表3 3a e r p 频率适应性的变化 各组与其o h 比较，叩 0 0 5 2 l 第三节氧化应激指标测定结果 3 3 1 过氧化产物m d a 的变化情况 m d a 是一种体内氧化自由基攻击生物膜脂质过氧化的终末产物，它的含量 能够间接反映氧化损伤的程度。我们通过分析四个实验组中家兔r a 、l a 、p v 三个不同解剖部位组织中的m d a 含量变化情况，结果如下：( 1 ) 左心房部位的 m d a 含量，n s 组、p i 组和p i + 凡廿组均比n s + r a p 组显著降低，p 均小于0 0 1 ： 右心房部位的m d a 含量，只有n s 组和p i 组比n s + r a p 组显著降低，而p i + 廿 组与n s + r a p 组无明显差别；肺静脉部位的m d a 含量，各组的变化趋势与左 心房部位的变化趋势相同，也是n s 组、p i 组和p i + 凡廿组均比n s + r a p 组显 著降低，p 均小于0 0 1 。( 2 ) 在n s + 廿组中，肺静脉部位的m d a 含量明显高于 左心房和右心房的m d a 含量，而左右心房并无明显差别；在n s 组和p i 组中， 三个解剖部位的m d a 含量变化趋势与n s + 凡心组完全相同，但整体上同一部 位的数值与n s + i 认p 组相比都很低，另外n s 组和p i 组的m d a 含量同一部位 第三章结果 基本近似；p i + 凡心组也是肺静脉部位的m d a 偏高于其他两个部位，而其他两 个部位无明显差别( 表3 4 、图3 7 和图3 8 ) 。 表3 4 组织m d a 含量变化 同一部位与n s + r a p 组相比，8 p o 0 5 ；( n = 6 ，2 + s ，n m o l m g p r o t ) 图3 7 同一部位中不同组间m d a 含量比较 第三章结果 图3 8 同一组中不同部位间m d a 含量比较 3 3 2 内源性抗氧化酶s o d 活力的变化情况 本研究选取了具有代表性的内源性抗氧化酶s o d 活力作为心肌抗氧化水平 的指标，分析结果如下：( 1 ) 左心房部位的s o d 活力，n s + r a p 组和p i + 毗心组 比n s 组和p i 组显著降低，同时p i + r a p 和n s + r a p 组并没有明显的差别；右 心房部位的s o d 活力变化趋势与左心房的是一致的，同时两个部位的同组数值 也基本相近；肺静脉部位的s o d 活力，n s + r a p 组明显低于其他三组，其他三 组间则没有明显差异。( 2 ) n s + 黜廿和p i + 凡廿组中三个部位的s o d 活力没有明 显差异；而n s 和p i 组中同组的三个部位的s o d 活力均有显著差异，p 0 0 1 这两个组同时都显示肺静脉部位的s o d 活力相对最低( 表3 5 、图3 9 和图3 1 0 ) 。 表3 5 组织s o d 活力变化 同一部位与n s + r a p 组相比，8 p 0 0 5 ；( n = 6 ；牙s ；u m g p r o t ) 图3 9 同一部位中不同组间s o d 活力比较 图3 1 0 同一组中不同部位间s o d 活力比较 3 3 3 过氧化物酶x o d 活力的变化情况 2 5 3 1 1 和图3 1 2 ) 。 表3 6 组织x o d 活力变化 同一部位与n s + r a p 组相比，8 p 0 0 5 ；( n = 6 ，牙：k s ，u m g p r o t ) 图3 1 1同一部位中不同组间x o d 活力比较 3 3 4 组织中c a 2 + 浓度的变化情况 为了监测研究中心肌组织c a ：+ 浓度的波动情况，我们分析了各实验组三个 不同解剖部位的c a ：+ 浓度，结果如下：( 1 ) 左心房的c a 2 + 浓度，n s + 凡廿组与其他 三组相比，有明显的增多，p 0 0 5 ，同时这个部位其他三组间并无明显差异； 右心房的c a ：+ 浓度变化趋势与左心房的情况是一致的；而肺静脉部位的c e + 浓 度，n s + r a p 组同样比其他三组明显升高了，但是n s 组和p i 组却并无显著差 异，同时显示这一部位的p i + 凡廿组比其他三组c a ：+ 浓度显著减少。( 2 ) 在这四个 实验组中，对于同一组中的三个不同解剖部位c a ：+ 浓度变化趋势有一个共同的 特点，都显示出肺静脉部位的c a + 浓度明显高于同组中的其他两个部位，p 0 0 1 ， 而同组中的其他两个部位c a ：+ 浓度无明显差异( 表3 7 、图3 1 3 和图3 1 4 ) 。 表3 7 组织c a 2 + 含量变化 同一部位与n s + r a p 组相比，a p 0 0 5 ；( n = 6 ，牙s ，m m o l g p r o t ) 第三章结果 图3 1 3同一部位中不同组间钙含量比较 图3 1 4同一组中不同部位间钙含量比较 左右，并 者房颤发 生率高达4 0 ，而且房颤能显著增加心血管疾病的发病率和死亡率。尽管对房 颤的病理生理研究已经非常广泛，但对房颤的发生机制仍然存在诸多的问题亟 待解决，导致了目前房颤的各种治疗方案都存在不同程度的局限性，使得治疗 结果很难令人满意。随着实验技术的快速发展，为从新的角度研究房颤的发病 机制以及开发具有针对性的新型药物提供了新的思路，从而对房颤的病理生理 和制定房颤治疗的新策略会有更多的认识和帮助。 l 、房颤模型与“房颤诱发房颤 1 9 9 5 年w i j f f e l s 等提出了“房颤诱发房颤”的概