（作物遗传育种专业论文）美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究.pdf

中文摘要 甘蔗( 勋c 砌口，姗lq 历c f ，坝m 所三) 是我国最重要的糖料作物和经济作物，同时也是一种 重要的能源植物。甘蔗花叶病( s u g a r c 锄em o s a i c r u s ，? 是甘蔗中较为重要的病害之 一，传统的化学防治效果不佳，在我国许多甘蔗品种其发病率接近1 0 0 ，使得甘蔗的 产量和含糖量降低，严重影响甘蔗的经济效益。利用植物基因工程技术把抗病毒基因导 入甘蔗优良品种中使其得到有效表达从而表现出抗病性是防治甘蔗病毒病最为有效的 途径。 美洲商陆抗病毒蛋白k e 、e e d 距“i m a lp r o t e i n ，p a p ) 是从美洲商陆妒砂幻伽c 口 册p ，f c 口刀口三) 春叶中分离得到的一种单链核糖体失活蛋白，它可以催化水解原核和真核 核糖体的大亚基r r n a 3 端茎环( s t e m 1 0 0 p ) 结构中的腺嘌呤残基，导致核糖体失活。p a p 可以有效的抑制多种非相关病毒，包括植物病毒和动物病毒，它是当前所有的核糖体失 活蛋白( i 唧s ) 中最有效的抗病毒蛋白。成熟的p a p 全长2 6 2 个氨基酸，其中c 端的2 5 个氨基酸为毒性区，缺失突变体p a p c 没有毒性区，其细胞毒性很低，但仍具有较强的 抗病毒活性。因此，将美洲商陆抗病毒蛋白基因印c ) 导入高产高糖的甘蔗品种中，使 其在叶片中特异表达，可提高甘蔗广谱的抗病毒能力。 本研究构建了r b c s 启动子驱动的美洲商陆抗病毒蛋白基因的植物表达载体 沁l ，然后利用“冻融法 导入超毒性农杆菌株e h a l 0 5 ，再通过农杆菌介导法对甘 蔗胚性愈伤组织进行转化，经过p p t 抗性筛选，获得了抗性植株7 5 株，对其中的8 株 进行p c r 检测，有3 株呈阳性，初步证明美洲商陆抗病毒蛋白基因已整合到甘蔗的基 因组中。 关键词：甘蔗美洲商陆抗病毒蛋白叶片特异表达启动子遗传转化 a b s t r a c t s u g a r c a n e 幽钟姗l 够c f 撇朋ml ) i sm em o s ti i i l p o r t a m ts u g a ra n de c o n o l i l i cc r o p s ， a n de l s ea i lh p o r t 趾te n e r g yc r o l 搭i i ic l l i n a s u g a r c a i l em o s a j c r i l s m c 觚b 咖g0 n k m n 如ld i s e 勰e ，o n eo fm es c 、，e 豫d i 嬲e si ns u g a r c a n e t a d i t i o n a lc h e m i c a lp r e v e n t i o n a 毹c tw e a k l yo n 形a n d 也es l 唱a r c 锄ei i l c i d e n c er a t eo f s 台彬i sn e 砌yt o1 0 0 i i l 洫a nh a sg r e a t l yr e d u c e dt h es u g 牡c o n t e n t ，o u 印u ta l l de c o n o m i cb e n e f i t s b r e e d i i l g 锄t i 、，i ：n 塔 s u g a r c a n e 谢e t i e sn l i 0 u 曲g 删c 百n e e 曲gw i np r o v i d ea i le 髓c t i v e 、a yt op r e 、，e n t 吐l i s d i s e a s e p o k e w e e da r n i v i r a lp r o t e i n ( p a p ) ，i s o l a t e d 丘0 mt 1 1 e s p r i n g l e a v e so fp 砂幻概佣 口聊p r f 阳门口厶i sb e l o n gt 0 l es i n 西e c h a i nr i b o s o m e i r 瞰t i v ep r o t e i n s ( r 【p s ) p a pc 雒 c a t a l y z et l l eh y d r o l y z i n go fs p e c i f i ca d e m n e r e s i d u e6 o ma l l i g m yc o i l s e r v e d ， s u r 】沁e - e x p o s e d ，s t e m l o o ps t r u c n 鹏i nr i b o s o m a ll a 略es u b u i l i t ，i e a d i n gt ol o s e 廿l e 缸1 c t i o n s o fm o s o m e p a e0 n eo fm em o s te 仃e c t i v e 砒pi i la 1 1i s ，击s p l a y sb r o a d - s p e c t m m 锄t i 诎m a c t i v i t yo nl o t so fu l l r e l a t e dv i r 吣e s ，i i l c l u d i i l gp l a n tv i 玎船e s 砒1 da i l i m a lv i r u s e s t h em 砷鹏 p a ph a s2 6 2 锄曲da c i d s 、i t l ll l i 曲c y t o t o x i c 时t op l 孤1 t s 1 1 1 ec - t e 眦i 砌d e l e t i o nm u _ t a n to f p a 只p a p c ，w h i c hl o s e s2 5a m i n oa c i d sn e a rt h ec - t e 彻i n l 】so ft l l em 砷【l r ep a p ，l 搬sl o 、c r c y t o t o ) 【i c i t y ，b u tw i ml l i 曲锄t i v i r 嘴a c t i v i t y p a 矽- c 仃a 1 1 s f o n n e dt 0m g ho u c p u t 趾ds u g a r c o n t e n ts u g a r c a n ev a r i e t i e s ，a r l de x p r e s s e di i lm e1 e a v e sc a ni r i l p r 0 v et 1 1 e 舭t i v i m sa _ b i l i 够f o r s u g a r c a n ew i d e l y a p l a n te x p r e s s i o nv e c t o ro f 沁l l 瑚b e e nc o n s t r i l c t e d 、7 l ，i 吐lp r o m o t e rr b c s “诎l g p 印一c1 1 1 e np n r p lw a s 仃a i l s f o m e dn o 彳即6 钟纪，f “mm 朋p 咖c 把珊e h a l 0 5b yu s i i l g f r e e z i n ga i l dt ha _ 晰n g ”n l e m o d 1 1 1 es u g a r c a n ee 血b r y o i l i cc a l l ii n d u c e df i o my o u n gl e a v e s o fs u g a r c 趾ew e r e 仃a i l s f o 髓e d 谢t l l 也e 彳即6 口c 纪，- f 绷m 聊e 咖c 把脚e h a l0 5 砌c h c o n t a i n e d 恤p n r p le x p r e s s i o nv e c t o r t t l e 仃a n s f o n i l e ds h 0 0 t sw e r es e l e c t e du n d e r 舭 p r e s s u r e o fp p t 龇1 d7 5r e s i s t 锄ts i l o o t s 、e r eo b t a i r l e d 1 1 i l ：陀e 缸a n s g e m cp l 锄t s 、e r e c o i l f i m e db yu s i n gm em 弛o do fp c r 舶m8r e s i s t a n ts h o 吣i tp r i m a r ys h o w e dt 1 1 a tp 印c h 嬲b e e ni n t e 铲a t e di n t ot l l es u g a r c a r 圮g e n o m e k e yw o r d s ： s u g a r c a l l e p o k e w e e da 埘v 砌 p r o t e i l l l c 啦s p e c i f i ce x p r e s s i o n p r o m o t e r ( r b c s ) g e l l e t i ct r 锄s f o m a t i o n 7 缩写词( a b b r e via tio n ) 海南大学学位论文原创性声瞬秘使甩授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导狮鲶蟹导下，狻立进行研舡作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表唆撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个 穆集体，均已在文中以明确方式标明 本声明的法律结果由本人承担 一粤 日期：知啦参月易日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用掌位论文的规定，印：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文役查忍和借阅本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师撸导1 ：完成的论文成果，知识产权归属海 南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 本人已经认真阅读“q 气l i s 高校学位论文全文数据库发布章程。，同意将本人的学位论 文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布并可按。章程”中规定享受相关 权益。 论 日 师躲乐弼砟师躲歇俐吖 期： 矿g 年占月p 名 1 引言与文献综述 1 1 甘蔗概况 1 1 1 甘蔗的重要性 1 1 1 1 甘蔗是重要的糖料作物 甘蔗( 踟c c 甜姗lq 屏c 讥口，搬l 工) 是世界和我国最为重要徽麓斟作物，而且还是我国1 2 种优势农作物之一，盛产于热带及亚热带。其中世i 界上酋蘑幡植面积最大的国家是巴西， 由于其疆土辽阔、自然条件优越，是世晃甘蔗糖也发展戤黻的国家之一；其次是印 度，植蔗面积4 0 0 多万公顷，但由于人口、消费：j 惯等赜，印度蔗糖国内产消基本持 平；2 0 世纪8 肛9 0 年代中国甘蔗种植增幅较大，j 见在中国甘蔗收获面积已超过古巴而位 居第三，面积达1 3 5 万多公顷：植蔗面积较大的i 目家还有古巴、泰国、墨西哥、澳大利 亚、美国、印尼、南非等( 白糖市场研究报告，2 i i 响 众所周知，食糖是天然甜味剂，是人们日常生活鲰曙晶，同时也是饮料、糖果、 糕点等含糖食品和制药工业中不可或缺的原料。食糖作为种甜味食料，是人体所必须 的三大养分( 糖、蛋白质、脂肪) 之一，食用后f 悲供给人馓高的热量。食糖生产的基 本原料是甘蔗和甜菜，甘蔗糖与甜菜糖的比例约为7 - 3 甘蔗生长于热带和亚热带地区， 甜菜生长于温带地区。我国南方主要以甘蔗糖为主( 自糖藏贷交易手册，2 0 0 6 ) 。2 0 0 6 2 0 0 7 年榨季全国总的产糖量达到1 0 7 0 万吨，其中甘赢：糖占7 豫目前，我国有3 5 9 家糖厂， 制糖能力1 0 0 0 多万吨，其中甘蔗糖厂3 4 0 家、制糖能力近i o 万吨，主要分布在广西、 云南、广东、海南、福建等1 3 个省区( 周普国，2 l 1 0 5 ) 随着人民生活水平的不断提高和 膳食结构的改善，国内食糖消费量有进一步增长的趋势囚而，发展甘蔗生产，对提高 人民的生活、促进农业和相关产业的发展都具有重要的麓位和作用。 1 。1 1 2 甘蔗是重要的能源植物 。 蔗糖是甘蔗最主要的产物，除了食用外，也是化学碰和发酵工业的原料。同时， 随着石油的日益枯竭和油价的不断攀升，世界上i 午多国家必将走上用甘蔗生产燃料乙醇 的道路。目前，快速生长的高光效植物是发展生物能溯想的作物，甘蔗是c 4 植物， 具有较强的光合速率和干物质积累能力。它的光饱和点比其他作物高，c 0 2 补偿点低， 呼吸作用少，因此光合效率较高，它可以源源不断的脚能转化为化学能贮存起来， 通过加工就能生产蔗糖和酒精等。据测定，甘l l 襞每平方米叶片每小时吸收c 0 2 为4 2 4 9 m g ，比其他c 3 植物如水稻、小麦等高出约1 倍以上大田甘蔗每平方米每周干重增加 5 0 9 ，也多于水稻和小麦的1 倍。甘蔗每年的生物产量比其它作物高出l 1 7 倍，酒精产 量也是最高的，可达到4 9 0 0 l 年h m 2 ( 蔡文燕等，2 6 ) 此外，利用甘蔗渣分解生产燃 料酒精的技术也日益成熟( 黄祖新等2 0 0 7 ) ，因此，用甘蔗生产燃料乙醇是一项很有发 展前景、利国利民的产业，特别在原料供应、成本、单位面积燃料乙醇产量及燃料乙醇 生产技术等方面具有得天独厚的优势，是其他作物所不能比的。同时，由于用甘蔗生产 的燃料乙醇是可再生能源，又是一种清洁的能源。取之不尽，用之不竭，是经济可持续 的能源动力。目前，世界各国都在深入研究生物能源，由于甘蔗作为一种可再生资源， 不会出现像石油和煤炭等矿物资源的枯竭现象，以甘蔗生产酒精作为动力燃料是一项蓬 勃发展的阳光产业。巴西是利用能源甘蔗生产无水酒精作为汽车燃料最成功的一个国家 ( 吴松海等，2 0 0 6 ) 。虽然我国还处在初期发展阶j 蹙但发展速度很快。因此，在我国甘 蔗生产乙醇，发展燃料乙醇产业，缓解石油供需矛盾，是非常有现实意义的。 1 1 1 3 甘蔗副产品的利用 甘蔗糖厂和精炼厂在生产蔗糖的过程中还伴随一些废料的产生，如蔗渣、糖蜜和滤 泥。在中国蔗渣可用于生产各种各样的产品如纸、纤维板、糠醛、乙酰氧乙苯胺、戊糖、 高纯度的纤维素、木质素和动物饲料等；糖蜜用二j 二生产动物饲料、肥料、乙醇、酵母粉、 柠檬酸、赖氨酸、化学添加剂和其他的有机酸等。1 9 9 0 年以前只有一些大的糖厂才生 产这些副产品，1 9 9 0 年后期，各种各样的副产晶为糖厂增加了很多效益。几乎所有的 糖厂都利用最后的糖蜜生产酒精。广西的桂糖工业股份有限公司是中国最大的糖厂，每 天处理l 0 0 0 0 吨蔗茎，生产多种副产品，包括5 0 万吨纸。南宁糖厂由6 个小糖厂组成 ( 1 9 9 9 年) ，现在是中国最大的糖厂。具有曰处理2 万吨蔗茎的能力，产白糖3 2 万吨， 产纸3 万吨和2 万吨可饮用酒等，总的副产品有1 5 种( 坶r u il i ，2 0 0 6 ) 。 1 1 2 我国甘蔗主要病害研究现状 1 1 2 1 甘蔗花叶病 甘蔗花叶病又名甘蔗嵌纹病，是甘蔗上发生最普遍、危害最严重的一类病毒病，在 我国，许多甘蔗品种发病率接近1 0 0 。大田研究表明，当初侵染率达7 5 时，产量降 低5 。1 9 ，含糖量降低o 5 1 ( 许莉萍等，1 9 9 4 ) ；甘蔗感病植株矮小，叶色严重 褪绿，蔗茎含糖量降低、空髓率增加，品质变差，严重影响商品价值( 王水琦等，2 0 0 2 ) 。 近年来，通过分子检测已明确引起甘蔗花叶病毒( s l l g 猢鹏m o s a i c m s ，m 叻的病 原至少有3 种：甘蔗花叶病毒( 钇? 、高粱花叶病毒做和甘蔗线条花叶病毒。其中 拶和 在我国蔗区普遍分布，广东、广西蔗区以s c m v 为优势种，浙江以洲 为优势种( 周国辉a 等，2 0 0 5 ) 。糖蔗主要受& m y 侵染，而果蔗则较多地受到& 的 侵染( 周国辉b 等，2 0 0 5 ) 。何炎森等认为，刎有1 0 多个株系，我国大陆蔗区m 有a 、d 两个株系，台湾蔗区肘y 有a 、b 和a + b 三个株系。蒋军喜等( 2 0 0 7 ) 于2 0 0 7 年9 1 0 月对江西甘蔗花叶病进行多点田间调查结果表明，江西甘蔗普遍发生花叶病， 其中红皮甘蔗花叶病重于青皮甘蔗，两者病丛率分别为5 9 8 和1 9 2 。随着分子生物 学的发展，我国对甘蔗花叶病毒的检测已采剐血清学与电镜结合的免疫电镜技术 ( s e m ) ，并对利用斑点杂交法和r t - p c r 技术检测甘蔗花叶病毒进行了研究( 李利君等， 2 0 0 0 ) 。 抗病品种的选用是防治甘蔗花叶病最为有效、最经济的措施。我国大陆蔗区从2 0 世纪9 0 年代初开始甘蔗抗花叶病育种的研究，9 0 年代后期把甘蔗品种对花叶病的抗性 作为新品种的评价指标之一。目前，防治甘蔗花叶病毒的主要措施有：( 1 ) 利用品种的 2 免疫或抗病性：( 2 ) 物理、化学、组织培养等脱毒方法：3 硅e 绝或箴少侵染来源及其传 染介体；( 4 ) 利用栽培过程能增强品种抗病性或减少侵染鲰备种农业栽培措施。实际上： 对于一个蔗区而言，均是以某一或若干措施为主，辅以其他必要括旌的综合治理( 王水 琦等，2 0 0 2 ) 。 1 1 2 2 黑穗病 甘蔗黑穗病是一种由黑粉菌引起的真菌性病害。我国南方各蔗区均有发生，早期症 状表现病株分蘖增多，叶片狭窄，茎基部节问非常短，使顶部叶片呈芦苇状或草苗状； 后期病株顶芽或侧芽生出黑色鞭状物，内含黑粉，即病原菌孢子该病每年有2 个爆发 高峰，第一个高峰在3 - 4 月，主要由种苗带菌或田间残留病菌侵染所致，第二个高峰在 9 一1 1 月，是由第一发病高峰产生的病菌孢子再侵染所致( 周国辉& 等，2 0 0 5 ) 。从2 0 世 纪5 0 年代至今的5 0 多年中，先后在我国大陆蔗区种植面积最大的当家品种竹蔗、台 糖1 3 4 、桂糖1 l 号都被黑穗病严重感染，先后被淘汰。目前在国内种植面积最大的新 台糖1 6 号和新台糖2 2 号在很多蔗区也已受到黑穗病严重感染，特别是一些旱坡蔗地， 黑穗病的发病率已达到2 0 ，使得新台糖系列正面临被新的抗病品种取代的局面( 王伯 辉，2 0 0 7 ) 。总之，黑穗病是我国甘蔗生产中最普遍、最重要的病害之一。 对黑穗病的防治，可以采用蔗种消毒、蔗株喷洒药剂和拔除病株的方法，但目前首 选的防治措施是选育和种植抗病品种，我国和其它一些产蔗国都把黑穗病的抗性作为品 种选择的一项重要指标。 1 1 2 3 甘蔗宿根矮化病 甘蔗宿根矮化病是世界很多产蔗国普遍发生的一种细菌性病害。外部症状为植株矮 小，蔗茎短细，生长迟缓，宿根发株少。内部症状为蔗茎节部维管束变红，但仅在生长 后期及环境条件不良的情况下才表现，且多数品种不表现明显的内部症状( 主伯辉， 2 0 0 7 ) 。在我国台湾、广东、广西、福建、四川、海南等地普遍发生，蔗株平均感病率 5 0 左右，宿根年限越长发病率越高，旱地蔗区较水田蔗区发病严重。2 0 0 0 2 0 0 3 年广 西也对自治区内主要蔗区的甘蔗宿根矮化病作了较全面的调查，并引进了p c r 技术进 行病原检测( 邓展云等，2 0 0 5 ) 。该病对甘蔗产量、蔗糖分等主要经济性状影响较大， 通常造成甘蔗减产1 2 3 7 ，在干旱下减产高达6 0 ，蔗糖分降低o 5 ；该病也是导 致品种种性退化、品种使用年限短的主要原因( 周国辉a 等，2 0 0 5 ) 对于该病的防治， 目前未见抗病品种的报道，主要防治措施是推广健康种苗技术，通过组织培养结合茎尖 热处理脱菌，繁育无菌种茎供大田种植。 1 1 2 4 甘蔗黄叶病 甘蔗黄叶病又称黄叶综合症，是1 9 9 2 年在美国首先报道的一种新病害，现已有很 多国家报道发生此病，其在世界各国的快速传播以及其对甘蔗生产造成的影响，受到世 界各产蔗国的高度关注。目前已知甘蔗黄叶病病原有两种：甘蔗黄叶病毒溆记功和甘 蔗黄叶植原体( 王伯辉等，2 0 0 7 ) 。目前田间发生的甘蔗黄叶病都是病毒型。近年，我 3 国广西、广东及海南蔗区也观察到该病，虽属局部发生，田间病株率不是很高，但调查 的结果表明，该病在我国上述蔗区扩散速度非常快，病情也在逐年加重。在巴西主要蔗 区圣保罗州，大量种植的品种s p 7 1 6 1 6 3 对该病最为敏感，其产量损失高达5 0 ( 周国 辉a 等，2 0 0 5 ) 。目前采用r t - p c r 技术可以准确及时地对甘蕉进行黄叶病诊断。研究 表明，采用热水处理蔗种的方法不能将记y 完全脱除，目前防治甘蔗黄叶病的主要 措施是种植抗病品种或无病蔗种；甘蔗生长期做好蚜虫防治工作；做好甘蔗引种的检疫， 防止引进新的感染黄叶病品种( 王伯辉等，2 0 0 7 ) 。 1 1 2 5 甘蔗凤梨病 甘蔗凤梨病是蔗种储藏期和蔗种萌芽期发生的一种真菌性病害。由于该病对甘蔗种 茎及其萌芽造成严重影响，长期以来受到人们的普遍关注，防治凤梨病一直是确保甘蔗 全苗的重要措旄。病原菌的菌丝体和大型分生孢子可以在土壤中长期存活，初侵染源是 带菌的土壤，病原真菌通过切口侵染种茎，使种茎及蔗芽腐烂并发出风梨香味，在病区 每年下种期间稍有疏忽变造成严重缺株( 周国辉a 等，2 0 0 5 ) 。该病发病与温度湿度密 切相关，生产上水田蔗区发病率高于干旱地蔗区。药剂浸种是防治凤梨病的有效方法， 蔗种在入窖前或播种前用多菌灵等药剂浸种，就可有效地抵御土壤中风梨病菌的侵染 ( 王伯辉，2 0 0 7 ) 。 1 1 2 6 甘蔗赤腐病 赤腐病是世界甘蔗重要病害之一，广泛分布于各产蔗国。此病在印度和美国曾给甘 蔗生产造成严重危害，尤其在印度，由于赤腐病病原菌变异很大，已出现纠个以上的 变种，一个抗病品种种植4 5 年就失效，在该国称为甘蔗的癌症，至今仍防不胜防。 我国的甘蔗赤腐病在各蔗区都有发生，该病可侵染蔗株的地上各部位，叶部病斑常见于 中脉，呈浅红色条形，后期中央呈草黄色，其上着生小黑点，即病菌的分生孢子盘和分 生孢子。生产上，若种茎带菌可使蔗芽不能萌发，造成缺株，该菌除引起减产外，病菌 能分泌一种蔗糖转化酶，使蔗糖转化为单糖，从而降低蔗汁的纯度和减少糖分，如榨糖 过程中病菌或其转化酶混入蔗汁中，将直接影响榨糖率，造成严重的经济损失( 周国辉 a 等，2 0 0 5 ) 。药剂浸种可以防止蔗种感染赤腐病，但对生长期间的甘蔗发病没有作用。 生长期间喷施农药对蔗茎发生的病害作用不大。由于我国甘蔗赤腐病大多是轻度发生， 生产上很少采取防治措施，也没有进行抗赤腐病品种的研究( 王伯辉等，2 0 0 7 ) 。 1 1 2 7 甘蔗梢腐病 甘蔗梢腐病是甘蔗生长中期发生的一种真菌性病害，几乎所有的甘蔗生产国都有发 生。由于甘蔗罹病后在梢头产生畸形或扭曲，以至腐烂死亡，在气候适宜时便会在蔗区 突然暴发，故此病很受人们重视。该病近几年在广西蔗区频繁发生，尤其是从台湾引进 的新台糖系列品种如新台糖1 6 号、新台糖2 5 号、新台糖2 7 号等( 王伯辉等，2 0 0 7 ) 。 梢腐病主要发生在甘蔗生长最旺盛的7 9 月，高温高湿、干旱后遇到降雨或干旱后充 分灌水、施用氮肥过多，都可引发梢腐病大发生。施用药剂可以较有效地控制病害的发 4 生，喷施农药应该在发病初期进行，同时在蔗区内对甘蔗品种进行合理搭配，也是防治 该病的关键。目前我国没有进行抗梢腐病的育种工作 1 1 2 8 其他病害： 1 1 2 8 1 斐济病 该病为病毒引起，因首次发现于太平洋斐济丙得名，曾在澳大利亚、菲律宾及菲洲 等地造成甘蔗产量的严重损失。感病植株症状为植株矮化，叶鞘及叶背沿叶脉形成条形 肿瘤，严重时病株上部叶片短粗而硬挺，更甚者导致蔗株畸形和死亡( 周国辉a 等， 2 0 0 5 ) 。在台湾曾有该病毒的报道，但大陆尚未见该病发生的相关报道。 1 1 2 8 2 条纹病 该病是一些非洲国家甘蔗上的重要病害之一。由病毒经多种叶蝉传播引起，严重时 引起产量损失约5 0 。其典型症状是在叶片上形成系统性的褪绿斑及细长的褪绿条纹， 随着抗病品种的推广，该病已成为一个次要病害，在我国尚未有该病发生的报道( 周国 辉a 等，2 0 0 5 ) 。 1 1 3 甘蔗选育种现状 人类栽培甘蔗已有2 0 0 0 多年的历史。甘蔗糖业的发展，依靠甘蔗生产的发展，甘蔗 生产的发展，关键在于甘蔗种质改良和高产高糖新品种的育成和推广( 陈如凯等，2 0 0 3 ) 。 据国际甘蔗技师协会( i s s c l i ) 统计，甘蔗品种改良对全球蔗糖业的科技贡献率为6 0 坂骆 君骗，1 9 9 2 ) 。因此，世界各国均将甘蔗遗传改良作为发展本国蔗糖经济的科技战略( 何 顺长，1 9 8 7 ) 。 1 1 3 1 杂交育种 杂交育种是甘蔗遗传改良的主要途径。1 8 8 7 1 8 8 8 年荷兰人s o t 、v a d e lf 和美国人 h a r i i s o n e t 相继在爪哇和巴巴多斯发现了甘蔗实生苗，从此便掀开了甘蔗杂交育种的历史 篇章。1 8 9 0 年，j e s 、e i t 等人提出甘蔗：“高贵化 m b l e l l i 盟t i o n ) 育种理论，即：以丰产、 多汁、高糖的甘蔗热带种( s o f j 眈i 玎a n 蛐) 为轮回亲本，以抗逆、抗病、生活力强的割手密 ( s s p o n t a n e u m ) 野生种为供体亲本，进行杂交和回交，目标是育成大茎、高产、高糖、 抗病、抗逆性强的新品种；1 9 2 1 年，他利用p o j 2 3 6 4 ( 1 ( 私s 0 i c r 与c h e r i b o n 回交f 2 代) 与e k 2 8 回交，选育出p o j 2 8 7 8 、p o j 2 7 2 5 、p o j 2 7 1 4 、p o j 2 8 8 3 等品种，其中p o j 2 8 7 8 在产量、 糖分、抗性方面表现优越，不仅是甘蔗生产上的主栽品种，也成为当时及以后数十年的 优良亲本材料，在当今世界甘蔗栽培品种中，十之八九都含有它的血缘，有“世界蔗王 的美誉。1 9 2 0 1 9 3 0 年间，印度的v e n k a 舡a m 觚采用“热带种名0 手密印度种 3 个种的 高贵化育种，育成可与p o j 2 8 7 8 相媲美的c 0 2 8 l 、c 0 2 9 0 、c 0 4 1 9 等品种( 骆君辅，1 9 9 2 ) ： 1 9 3 7 年，美国夏威夷的m a n g e l s 瓣用“熔炉杂交法 ，育成含有4 个种( 热带种、割手 密、印度种、大茎野生种) 血缘的h 3 7 1 9 3 3 ( 骆君骗，1 9 9 2 ) 。 可以说，以上的“高贵化育种、“三元杂种玎、“熔炉杂交法”使甘蔗育种家先后育 成近百个良种，虽在生产上发挥了重要作用，但它们却有7 3 5 的亲代是c p 4 9 5 0 、f 1 3 4 、 5 n c 0 3 1 0 和c p 2 8 1 l ，而这四个品种又l o o 是p o j 2 8 7 8 的后裔，也是野生种的第6 、7 代( 骆 君辅，1 9 9 2 ) 。另外，到目前为止，我国大陆栽培的甘蔗当家品种仍然是2 0 世纪8 0 年代 以前引进的f 1 3 4 以及9 0 年代以后引进的r o c l 0 和r o c l 6 等( 陈如凯等，2 0 0 3 ) 。这些现象 表明，我国甘蔗杂交育种尚未取得根本性突破。 由此可见，全球甘蔗商业栽培品种的改良是利用十分有限的种质资源完成的。一方 面，由于甘蔗所含“种”的血缘数少、异质性小，导致遗传基础过于狭窄：另一方面， 由于近亲繁殖，导致甘蔗品种间血缘关系太近，而且随着杂交次数的增加，野生种血缘 成分逐代减少。这是造成我国甘蔗杂交育种没能突破的“瓶颈 ( 陈如凯等，2 0 0 3 ) 。因 此，采用传统的杂交育种方法很难克服这些不足。基因工程的出现，为解决这些问题提 供了一个全新的途径。 1 1 3 2 生物技术育种 基因工程的发展为甘蔗的遗传改良提供了快捷有效的新技术，使得在优良品种中导 入目的基因进行品种改良成为可能。其中，植物遗传转化是植物基因工程中关键的步骤 之一，它避免了有性过程，克服任何杂交障碍，使基因在生物间相互转移成为可能。 自1 9 8 7 年以原生质体为受体，首次进行甘蔗遗传转化尝试以来，已培育出许多基因 工程甘蔗，其主要成就见表l 。由表1 可知，目前，在甘蔗上应用的具有农艺重要性的基 因有抗除草剂的b a r 基因和c p 4 e p s p s 基因、抗甘蔗花叶病毒病的s c m v - c p 基因、抗甘 蔗斐济( 绚i ) 病毒病的厕i v i l m c p ( s c f - c p ) 基因、抗虫的蛋白酶基因及b t 基因、甘蔗抗 旱的t s 嬲e 基因等。已成功培育出转基因甘蔗的转化方法有电穿孔法、基因枪法和农杆菌 介导法等3 种。所采用的受体类型包括完整细胞( 悬浮培养细胞) 、胚性愈伤组织和分生组 织。自1 9 8 7 年世界首次报道甘蔗遗传转化研究以来已有2 0 多年的历史，通过不同的转化 方法已培育出多种转基因甘蔗，而且有些已进入田间试验阶段。其中主要涉及到抗虫、 抗病、抗除草剂、抗逆性等多种基因。 表l 国内外基因工程甘蔗进展一览表 t a b l e1t h eg e n e t i ce n g i n e e r i n go fs u g a r c a n ei nt h ew o r l d m e 吐1 0 do f r u i t 仃锄1 s f 0 眦a t i g u s g u s g u s s c m v c p c a l l u s ，s u s p e n s i o nc e n g e g i l n c e i i s u s p e n s i o n ，e m b 叮o g 即 g e 舱g u n i cc a l l i n a c tc e l l e l o c l o p o r a t 0 n m e r i s t e m e m b 拶o g e n i c g 锄eg u n c a l l i 6 岫s g e n i cp l 觚t【7 1 ，7 2 】 n 硼s i 饥t 【9 1 1 e x p r 鹤s i o n 咖s 舻n i cp l a n t【5 9 】 缸勰蹭i cp l 锄t f 1 0 5 ，1 4 5 l t 均n s i 朗t b a r p m t 叩l a s t l is u s p 叭s i o nc k 咖p o r a l 胍蛾口咿s i 蚰【8 0 1 i a 酗 b a r 咖b 叮o g 即i cc a l l i g e g i i i 切芦血p k 呲 瞵，韶】 b a r c e i l 叫s p 印s i o n g 衄eg 吼- 幽伊噍咖i t 【1 4 7 】 戳墟 m e r i s t 咖帮曲喇两唧删难- 瞳矗盘譬瞌p 协t【8 7 i &h渤随cell e k 蜘啊栅m 、- 盈唾蓼_ i c 曲m t【6 1 】 b t 锄b 叮o g 锄i cc a i i i+ 鹅f d l 磁搬i u 缸m o d 函“切啊g e i i c 衄t【5 8 】 c f y 巩( b )啪b 叮o g 叭i cc a l l i 贸吨斌蚯切嘲萨畹p l a n t【5 7 】 啦心撕e m b 叮o g e n i cc a l i i 球：c t i ，p o 枷妇瞄静斑p h i l t【6 2 】 g f p 啪b r y o g e n i cc a j l ig 眦g l i l l 翩岬i cp i 觚t 【7 l 】 g f p 锄b r y o g e n i cc a l l i 驾i o b a 烈e r i h 珊d i 捌位瞄碧霉n 记p i a m【8 5 1 p i o 痂岱础i 嘟 啪b u o g 饥i cc a i i ig e 嘴g 嗌蛔哟酮血p l 觚t【1 2 8 】 c 陴e p s p s e m b r ) ，o g 叭i cc a l l i g 舶eg l l n 呻i c p i 锄t【8 8 】 s c f c p 锄时o g e n i cc a j l i g e l i eg i i n 托p o l i【1 4 7 】 1 妇辩 哪b t y o g e n i cc a l l i 乎o b 嬲吲瑚姗| e d 柚酊们哟酗i cp i 锄t【1 4 2 】 c p e m b o g e n i cc a i l ia 目d 珊c t e f i 疆m n 曩i 耐白m s 岫p l a m【1 0 2 】 u b i 印a锄b 叮o g e n i cc a l i i删删瑚m m e d 盈们璐鲫i cp i 锄t【8 0 】 u b i - f d v 亡m b r y o g e n i cc a j l ia g r o b 蜊咖胁啦蝴咖昭疵p l 雒t【12 2 】 a l b i )i r i t a c tc e i lg 锄eg 哪衄瞳释啦p i a i i 【1 6 7 1 加di 曲l c t l l g 铋e g 哪妇曩孵n i cp l a n t【1 3 8 】 p a t 啪b r ) ，o g e n i cc a l la 卿a 硎硼瓶e 凼硇一妇丘臀疵p l a n t【1 13 1 u b i g m c s f 锄b d ，o g e n i cc a l l ia 鼬砌响删n o d 砌恤雩既i cp l 狮t【l5 7 】 p p oi n t a c t u g 饥e g 叽妇啮鬯c 噍p i 觚t【1 5 3 】 1 1 1 ：r t 勰e - i n h m i r o r e m b t ) r o g e n i cc a i i i g eg 岫 i t p i 砒 【5 5 】 s p s i n t a c tc e h g m eg 咖岫l 罾m i c p l a r i c 【l5 3 】 1 2 植物抗病毒基因工程 当前利用基因工程技术培育抗病毒的植物品种已经取得了很大的进展，其主要技术 路线包括：利用病毒的外壳蛋白基因、应用r n a a 险硒) 干扰技术、病毒的卫星i u n a 、 反义r n a 技术、病毒非结构蛋白基因，特别是复制酶基因叫；利用病毒移动蛋 白基因、与昆虫介体传播相关的基因、人工构建的缺损干扰颗粒、以及植物本身编码的 抗病基因和动物的干扰素基因；利用中和抗体法技术、设计核酶剪切病毒r n a 等( 王关 林，1 9 9 8 ：俞德超，1 9 9 3 ) 7 1 2 1 病毒外壳蛋白基因介导的抗性 p o w e l l 等( 1 9 8 6 ) 首次将唧外壳蛋白基因导人烟草，培育出抗病毒的转基因植株 在转基因烟草中，鲫外壳蛋白基因的表达量占细胞内可溶性蛋白的o 0 5 0 1 。当这 些转基因烟草受到唧侵染时，出现感病症状的时间明显推迟。 目前已经克隆到多种病毒的外壳蛋白基因，这些病毒包括：删，c m v ，苜蓿花 叶病毒( a l m ，p v x ，p v y ，烟草脆裂病毒( n 和番木瓜环斑病毒( p r ：v ) 。并且，已 经获得了多种植物的转病毒外壳蛋白基因的植株，包括烟草、马铃薯、番茄、番木瓜、 欧洲李、杏、水稻等作物。 虽然导入病毒外壳蛋白基因的技术路线取得了很大的进展，但利用病毒外壳蛋白基 因介导的病毒抗性存在一定的局限性，一是转基因植株只能抗一种特定的病毒或几种密 切相关的病毒，二是转基因植株大多只能延迟发病，而不能彻底根治。 1 2 2 应用砌妊( r n 础) 干扰技术 对蛆( 】卧i a i ) 干扰现象也属于沉默( 朱剑等，2 0 0 7 ) ，r n a j 是由双链r n a 介导的、在 转录后水平关闭相应序列基因表达的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默 s l s c r i p t i o r i a lg c n es i l e n c i i l g ) 。在自然状态下，病毒在植物体内复制中断时会产生， 这就为植物体内提供了一个诱导起始物，从而引发了植物体内的耐妊i 机制，降解病毒 的基因组，导致植物体对病毒具有天然的抵抗力，因此删系统是植物天然的病毒防 御系统。在植物抗病毒的研究中有广阔的应用前景。根据这一原理，可以人为地将与病 毒同源的d s i a 导入植物体内，使其引发植物体内的l 矾加机制，对病毒基因组进行特 异的切割降解，阻止病毒的复制扩散，从而保护植物不受病毒的侵害( 张恭等，2 0 0 7 ) 。 已知植物病毒的基因组中9 9 以上的都是单链i 矾a ( 李毅等，2 0 0 1 ) ，病毒基因组在依 靠病毒自身编码的依赖i 斟a 的i 斟a 聚合酶进行复制时都有病毒基因的d s r n a 形式产生， 这就为i 玳作用提供了很好的条件。随着近年来干扰机制研究的不断深入，利用干扰 的高效性和特异性来控制植物的病毒病己开始得到重视和应用( w a n gm b e ta l l ，2 0 0 0 ) 。 目前在植物抗病毒方面应用较多的是利用农杆菌介导的转化和直接注射的方法，使可表 达的d s 烈a 的t - d n a 片断整合到植物体基因组，然后检测转化体对病毒抗性的方法。 这种病毒诱导的转录后基因沉默在植物的抗病毒基因工程及其它植物基因工程研 究中已经显示出了一定应用前景，但尚不能投入到大规模生产中去。况且l 州是植物 本身固有的一种抗病毒的防御机制，而病毒为了顺利完成侵染，就必须避开或抑制植物 体r n a 干扰对其的作用。目前己在多种病毒中发现能编码抑制植物对病毒融蛆干扰的蛋 白质即沉默抑制因子，这些抑制因子对i 矾加的抑制存在不同的作用方式( 张恭等， 2 0 0 7 ) 。这种由双链r n a 介导对病毒抗性的机制主要是通过转化病毒来源的基因序列使 植物获得对病毒的抗性饵a u l c o m b ed c ，1 9 9 9 ) 。 1 2 3 病毒卫星鼬妊策略 病毒卫星烈a 是指依赖于病毒进行复制的一类低分子量的r n a ，它可以改变植物 暑 r n a 病毒的致病能力，加强或减弱病毒的致病力。利用减轻病症的卫星m 峪进行生物防 治已经开始在生产中应用，将此类卫星鼢呵a 转入植物细胞也可获得相应的抗性。例如， 表达c m v 和r s v 卫星序列的转基因烟草植株，当被相应的病毒侵染时，其发病症状减轻。 利用卫星r n a 赋予植物的抗性不会因病毒的接种量而被克服，但应用卫星对峪的范围有 限，同时存在加重感病程度的风险。 1 2 4 反义对姐技术 反义m 蛆技术是指与1 盼队或d n a 互补的小型单链砌妊分子，其长度一般不到2 个核昔酸。将它导入靶细胞后，通过形成d n 刖鼢执杂交双链，从而抑制基因表达，或 者通过与m r n a 的s d 序列互补导致翻译水平上的抑制，或者是通过与m r n a 的非编码区 形成复合物，从而导致i n 心情失活达到基因控制的目的( 娄虹等，2 0 0 5 ) 。由于d n a 病毒 和鼬、a 病毒在复制和表达过程中都必须经过附呵a 生物合成阶段，这成为应用反义技术进 行抗病毒研究的主要理论依据( 李毅等，2 0 0 1 ) 。应用反义r n a 抑制病毒基因的表达与复 制有可能成为预防病毒感染的有效途径( 娄虹等，2 0 0 5 ) 。将病毒基因反向连接在真核启 动子后导入植物，植物细胞中表达的反义r n a 与病毒附蛆互补，从而抑制病毒i n 】孙a 的 翻译。例如在r s v 病毒基因组的r n a 4 的两个编码区m 托a d i 】唱矗狮e ，o r d 之间存在 非编码区即基因间隔区( i 唧i l i cr e 西。玛i r ) ( h o n 舒v c i 珏c ca 1 ，2 0 0 2 ) 。设想如能在转基 因水稻内表达出瓜区域反义i 淑a 必将与r s v 亚基因组鼢敞的启动序列相结合，封闭启动 子，干扰病毒亚基因组转录，从而干扰r s v 蛋白基因等的正常表达。此外，瓜反义i 矾a 可以和己合成的亚基因组r n a 结合阻碍其正常翻译表达。因此非编码瓜序列反义r n a 在转录和翻译两个水平上均有可能干扰病毒复制。己有资料表明，应用反义技术来抑制 植物病毒，对于d n a 病毒是成功的；而对于砒蛆病毒，只能获得相当低的抗性，人们设 计了植物病毒不同基因的反义链基因，转入植物体内，希望利用病毒的反义链对怕在控 制植物病毒病中发挥作用，但所获得的转基因植物的抗病效果都不明显( 娄虹，2 0 0 5 ) 。 利用反义技术来提高植物抗性的方法也在不断的改良中。 1 2 5 病毒复制酶基因介导的抗性 病毒复制酶是病毒非结构蛋白，一般是在病毒进入寄主细胞并结合到寄主核糖体之 后形成的。把r i r n a 编码的1 2 6 k d 蛋白的通读部分 瓢l m m u 曲) 5 4 k d 的基因导入 烟草，转基因植株对删表现出绝对高的抗性。病毒复制酶基因的作用机理还不十分清 楚，但病毒复制酶基因所介导的抗性对某些作物远远高于外壳蛋白基因所介导的抗性。 1 2 6 核糖体失活蛋白基因 核糖体失活蛋白( r i b o s o m e i i l 枷v 撕n gp r o t e i l 塔，r j p s ) 是一类能抑制蛋白质生物合成 的蛋白质，广泛存在与高等植物体内。根据它们的结构，l 心s 可分为两种类型，i 型i 唧s 是单链碱性蛋白质，其分子质量约为3 0 k d a ，可以带有糖基也可以