（免疫学专业论文）mcp1基因多态性与丙型肝炎的相关性研究.pdf

目录 中文摘要1 英文摘要3 研究论文m c p 1 基因多态性与丙型肝炎的相关性研究 前言7日u 舌。7 材料与方法8 结果1 4多日才1 + 讨 仑1 8 结论2 0 参考文献2 1 综述丙型肝炎与单核趋化蛋白1 的关系研究进展2 3 致谢3 7 个人简历3 8 中文摘要 m c p 1 基因多态性与丙型肝炎的相关性研究 摘要 目的：丙型肝炎( h e p a t i t i sch c ) 是由丙型肝炎病毒( h c v ) 引起 的，可导致肝硬化和肝癌。除了环境因素即不同类型h c v 的感染，人群 中确实存在着易感性的差异，从而使其对h c v 感染产生不同的效应。目 前研究认为，丙型肝炎的发生、发展是多因子参与的结果，近年来发现， 体内广泛的免疫平衡紊乱所引起的持续炎症性免疫应答是主要的致病机 制。 单核细胞趋化蛋白1 ( m c p 1 ) 是一类c c 单核细胞趋化因子，近年 来一些研究发现，h c v 感染后，肝细胞、星状细胞、单核细胞、巨噬细 胞的m c p 1 的表达量增加，其中，外周血的单核细胞和肝星状细胞是 m c p 1 的主要来源。m c p 1 基因的单核苷酸多态性( t h es i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s ms n p s ) 与乳腺癌、结肠癌、软组织癌预后存在相关性。而 m c p 1 基因多态性与丙型肝炎的关系尚未见研究报道。 本研究旨在探讨m c p 1 启动子2 5 1 8 位点基因多态性在河北沧州地 区丙型肝炎患者和正常人群中的分布情况，从分子遗传学角度探讨m c p 1 基因多态性与丙型肝炎的相关性。 方法： 1 丙型肝炎患者和健康对照的选择：收集丙型肝炎患者9 8 例，均来 自河北省沧州市中心医院和河北省沧州市传染病医院，男性7 7 例，女性 2 1 例，年龄2 3 - 7 2 岁，平均4 8 6 岁，无其他感染性疾病和肝病。健康对 照组9 8 例，男性6 8 例，女性3 0 例，年龄2 0 - - 一7 6 岁，平均4 6 1 岁，无 肝病病史、及感染性疾病，血常规检测正常，相互无血缘关系。 2 血液标本的采集：取研究对象空腹全血，用e d t a 抗凝。 3 全血基因组d n a 的提取：用全血d n a 提取试剂盒提取上述血液 标本的基因组d n a 。 4d n a 基因型分析：应用p c r r f l p 技术，分析m c p 1 2 5 1 8 ( a g ) 位点的多态性，分析m c p 1 基因多态性在实验组与对照组中的分布，探 讨m c p 1 基因多态性与丙型肝炎的关系。 中文摘要 结果： 1 丙型肝炎患者( 实验组) m c p 一1 ( 2 5 1 8 ) a 、a g 和g g 基因 型频率分别为1 2 、4 0 和4 8 ，而健康人( 对照组) 分别为2 0 、5 8 和2 2 ，实验组与对照组之间具有显著性差异( 尸 o 0 5 ) 。 4 实验组和对照组不同基因型及等位基因型之间的性别差异无统计 学意义( 尸 o 0 5 ) 。 结论： l 在河北沧州地区丙型肝炎人群中，m c p 1 基因存在多态性。 2 在河北沧州地区丙型肝炎人群中，m c p 1 2 51 8 g 等位基因频率明 显增高，m c p 1 2 518 g 等位基因可能是丙型肝炎的危险因素， m c p 1 2 5 1 8 ( a g ) 基因多态性与丙型肝炎具有相关性。 3 在河北沧州地区丙型肝炎人群中，m c p 1 2 51 8 ( a g ) 基因多态性与 年龄和性别均无相关性。 关键词：丙型肝炎；单核苷酸多态性( s n p ) ；单核细胞趋化蛋白 一i ( m c p 一1 ) ；- 2 518 ( a g ) 英文摘要 t h ec o r r e l a t i v es t u d yo fm c p 一1g e n ep o l y m o r p h i s mw i t h h e p a t i t i sc a b s t r a c t o b j e c t i v e ：h e p a t i t i sci s c a u s e db yh e p a t i t i scv i r u sa n dc a nc a u s e h e p a t o c i r r h o s i sa n dl i v e rc a n c e r b e s i d e se n v i r o n m e n t a lf a c t o r sw h i c ha r e d i f f e r e n th e p a t i t i sci n f e c t i o n ，t h e r ea r ed i f f e r e n te f f e c t st ot h ei n f e c t i o no f h c vb e c a u s eo fd i s s i m i l a rs u s c e p t i b i l i t yi nh u m a n c u r r e n tr e s e a r c hs h o w s t h a tt h eo c c u r r i n ga n dd e v e l o p m e n to fh e p a t i t i sca r et h er e s u l t so fm u l t i p l e f a c t o r sp a r t i c i p a t i n g ，a n dc o n t i n u o u si m m u n o r e a c t i o n si n d u c e db ye x t e n s i v e d i s o r d e ri m m u n o l o g i cb a l a n c ei nv i v oa r et h em a jo rm e c h a n i s m so fh e p a t i t i s c m o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n1 ( m c p 一1 ) i s ak i n do fc cl i k e m o n o c y t ec h e m o t a c t i cp r o t e i n ，a n ds o m er e s e n ts t u d i e ss h o w e dt h a t i t s e x p r e s s i o ni n c r e a s e di nl i v e rc e l l s ，s t e l l a t ec e l l s ，m o n o c y t e sa n dm a c r o p h a g e s a f t e ri n f e c t i n gh e p a t i t i sc ，i nw h i c hm o n o c y t e sa n dl i v e rs t e l l a t ec e l l si n p e r i p h e r a l b l o o da r et h em a jo rs o u r c eo fm c p - 1 t h es i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m ( s n p ) i sc o n c e r n e d w i t hp r o g n o s i so fb r e a s tc a n c e r , c a r c i n o m a o fc o l o na n ds o f t t i s s u ec a n c e r h o w e v e rt h e r ei sn or e s e a r c ha b o u tt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nm c p - 1a n dh e p a t i t i scb yn o w t h ep u r p o s eo ft h i sp a p e ri st oi n v e s t i g a t et h ed i s t r i b u t i o ns i t u a t i o no fs i t e 2 518p r o m o t o ro fm c p 一1i nh e p a t i t i sce x p e r i m e n t a lg r o u pa n dc o n t r o li n c a n g z h o ur e g i o n ，h e b e ip r o v i n c ea n ds t u d yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nm c p - 1 g e n e t i cp o l y m o r p h i s ma n dh e p a t i t i scf r o mt h ev i e w p o i n to fm o l e c u l a r g e n e t i c m e t h o d s ： 1 n i n e t ye i g h th e p a t i t i scp a t i e n t s w h o l eb l o o dw e r ec o l l e c t e da s e x p e r i m e n t a lg r o u pf r o mc a n g z h o u c e n t r a lh o s p i t a la n dc a n g z h o uc o n t a g i o u s h o s p i t a l ，t h e r ew e r e7 7m a l e sa n d2 1f e m a l e sa g e d2 3t o7 2 ( a v e r a g e4 8 6 ) i n e x p e r i m e n t a lg r o u p ，a n d6 8m a l e sa n d30f e m a l e sa g e d2 0 t o7 6 ( a v e r a g e4 6 1 ) 英文摘要 一一 i nh e a l t h yc o n t r 0 1 a l lh e a l t h yc o n t r o lv o l u n t e e r sh a dn ol i v e rd i s e a s e sh i s t o r y , i n f e c t i o nd i s e a s e s ，a b n o r m a lb l o o dr o u t i n ea n db l o o dr e l a t i o n s h i pe a c ho t h e r 2c 0 1 1 e c t i o no fb l o o ds a m p l e s ：w h o l eb l o o d sw e r ec o l l e c t e di nc o n d i t i o n o f e m p t ys t o m a c h w i t he d t aa n t i c o a g u l a t i o n 3e x t r a c t i o no ft h ew h o l e b l o o dg e n o m ed n a ：t h e w h o l eb l o o dg e n o m e d n aw a se x t r a c t e dw i t hk i t 4a n a l y s i so fg e n o t y p e ：t h eg e n e t i cp o l y m o r p h i s mo fm c p l - 2 5 18 ( a g ) w a sa n a l y z e da p p l y i n gp c r - r f l p , t h ed i s t r i b u t i o ns i t u a t i o no fm c p - 1w a s s t u d i e di ne x p e r i m e n t a lg r o u pa n dc o n t r o l ，a n dt h er e l a t i o n s h i p b e t w e e n g e n e t i cp o l y m o r p h i s m o fm c p - 1a n dh e p a t i t i scw a sd i s c u s s e d r e s u l t s ： im c p 1 ( 2 518 ) a a ，a ga n dg gg e n o t y p ef r e q u e n c yp e r c e n t a g ew a s 12 p e r c e n t ，4 0p e r c e n ta n d 4 8p e r c e n tr e s p e c t i v e l yi nh e p a t i t i scp a t i e n t s ，w h e r e a s i tw a s2 0p e r c e n t ，58p e r c e n ta n d2 2p e r c e n ts e p a r a t e l yi nh e a l t h yc o n t r o l s g o o d n e s so ff i to fx 2t e s tw a sa p p l i e di ng e n o t y p ed i s t r i b u t i o n ，w h i c hp v a l u e s w e r ea 1 1h i g h e rt h a n0 0 5a n dw e r ea c c o r d a n c ew i t hh a r d y - w e i n b e r gl a wo f g e n e t i ce q u i l i b r i u m a n dh a dc o l o n y r e p r e s e n t a t i v e n e s s a n d t h e r ew a s s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e ne x p e r i m e n t a lg r o u p a n dc o n t r o l 2t h em c p 1 2 518 ga l l e l ef r e q u e n c yo fe x p e r i m e n t a lg r o u pw a s6 8 p e r c e n t ，w h i c hw a ss i g n i f i c a n th i g h e r t h a nc o n t r o l ( 51p e r c e n t ) 3t h e r ew a sn os t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c eo fa g ei nd i f f e r e n tg e n o t y p ea n d a l l e l eb e t w e e ng e n o t y p ea n da l l e l ei ne x p e r i m e n t a lg r o u pa n dc o n t r o l ( p o 0 5 ) 4t h e r ew a sn os t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c eo fs e xi nd i f f e r e n tg e n o t y p ea n d a l l e l eb e t w e e ng e n o t y p ea n da l l e l ei ne x p e r i m e n t a lg r o u pa n dc o n t r o l ( 尸 o 0 5 ) c o n c l u s i o n s ： 1m c p 1g e n e t i cp o l y m o r p h i s mi se x i s t e n t i nh e p a t i t i scp a t i e n t si n c a n g z h o ur e g i o n ，h e b e ip r o v i n c e 2t h ef r e q u e n c yo fm c p 1 2 518 gs i t ei n c r e a s e sr e m a r k a b l yi nh e p a t i t i s p a t i e n t sa n di t c o u l db et h er i s kf a c t o ro fh e p a t i t i sci nc a n g z h o ur e g i o n ， 英文摘要 h e b e ip r o v i n c e t h e r ei sc e r t a i nc o r r e l a t i o nb e t w e e nm c p 一1 2 518 ( a c ) g e n e t i cp o l y m o r p h i s ma n dh e p m i f i sc 3t h e r ei s n o r e l a t i o n s h i p b e t w e e nm c p - 1 - 2 518 ( a g ) g e n e t i c p o l y m o r p h i s mw i t hh e p a t i t i scp a t i e n t so fd i f f e r e n ta g ea n ds e xi nc a n g z h o u r e g i o n ，h e b e ip r o v i n c e k e yw o r d s ：h e p a t i t i sc ； s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ( s n p ) ； m o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n tp r o t e i n1 ( m c p 一1 ) ；2 518 ( a g ) 英文摘要 英文缩写 i 沁m 盯l p h 慢 几 m c p 1 p c r h c v r e f b p d n a s n p 主要英文缩写一览表 e n g l i s h a b b r e v i a t i o n 英文全称中文全称 r o t a t i o np e rm i n u t e每分钟转数 r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t h 限制酶切片段长度多 p o l y m o r p h i s m 态 h a r d y w e i n b e r ge q u i l i b r i u m 哈迪温伯格平衡 m i l l i l i t e r毫升 m 。n 。c y t e c h e m 。a t t r a c 僦单核细胞趋化蛋白1 p r o t e i n 1 p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n聚合酶链式反应 h e p a t i t i sc v i r u s丙型肝炎病毒 r e f e r e n c e参考 b a s ep a i r碱基对 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m 单核苷酸多态性 研究论文 m c p - 1 基因多态性与丙型肝炎的相关性研究 _ l _ o 刖吾 丙型肝炎( h c ) 是由丙型肝炎病毒( h c v ) 引起，可导致肝硬化和 肝癌，严重威胁人类健康。目前世界有一亿七千万人是h c v 感染者，占 世界人口的三百分之一【l 】，是艾滋病毒( v ) 感染者的四倍。我国是h c v 感染的高发区，丙型肝炎患者约占全世界的4 0 ，是严重危害我国人民的 一种疾病。 h c v 感染的一个重要特点是具有极易演变成慢性化的趋势。文献报 道不同国家的h c v 感染者自然转归不尽相同，h c v 感染后的慢性化率为 7 5 8 5 ，2 0 年后的h c v 自然清除率为8 4 5 ，肝硬化率为1 0 5 0 ，肝细胞癌的发生率为1 0 - 2 3 ，晚期丙肝病死率为4 - - - 1 5 e 2 3 】。 有的慢性h c v 感染者能自动清除h c v ，但很少，通常发展为肝炎、 肝硬化甚至肝癌。因此，除了环境因素即不同类型h c v 的感染，人群中 确实存在着易感性的差异，从而使他们对丙肝病毒产生不同的效应。 h c v 是有被膜的单股正链r n a 病毒，属黄病毒科丙型肝炎病毒属， 主要在肝细胞中复制，是引起输血后非甲非乙型肝炎的主要致病因子。 h c v 基因组变异大，主要分为6 个基因型，8 0 多个亚型【4 】。h c v 感染 的发生机理是个复杂的动态过程。慢性化的发生与宿主免疫压力之下导致 的病毒序列改变有关，而且与病毒自身抗原表位漂移有关。 丙型肝炎的进展是多因子参与的结果，近年来发现，体内广泛的免疫 平衡紊乱所引起的持续免疫应答是主要的致病机制。丙型肝炎病毒 ( h c v ) 感染不仅可以引起肝脏本身的损害，还可以引起肝外组织损害， 特别是自身免疫性损害。单核巨噬细胞系统在h c v 感染中起着至关重要 的作用，在丙型肝炎发生、发展过程中，h c v 未感染的肝细胞免疫损伤 是导致肝受损的主要原因。 单核细胞趋化蛋白1 ( m o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n tp r o t e i n 1 ，m c p 1 ) 是 一种c c 类单核细胞趋化因子，人类m c p 1 以包含2 3 个氨基酸组成的信 号肽分子的前体蛋白形式分泌，在翻译后加工过程中与信号肽解离后，完 整的m c p 1 由7 6 个氨基酸残基构成。m c p 1 是由单个核细胞和其他非白 研究论文 细胞所分泌，是新近明确的对单核巨噬细胞有趋化、激活双重作用的细 胞因子。 人类m c p 一1 ，由包括正常组织细胞、白细胞及许多肿瘤细胞等多种 细胞分泌。在正常组织细胞中，m c p 1 的主要细胞来源是内皮细胞、成 纤维细胞及单核细胞【5 】。近来一些研究发现，在丙型肝炎患者中，h c v 感染后，巨噬细胞、星状细胞、单核细胞、肝细胞的m c p 1 的表达量明 显增加。 丙型肝炎从某种意义上讲是一免疫性疾病，造成主要损伤的不是病毒 本身，也不是被h c v 感染的肝细胞，而是在h c v 感染宿主后，未被h c v 感染的肝细胞的免疫损伤。对己感染肝细胞的免疫耐受是导致h c v 感染 慢性化的主要机制，同时h c v 感染相关的众多肝外表现( 肾小球肾炎、 冷球蛋白血症等) 也提示h c v 感染后引起免疫反应。 十几年前，“常见位点变异导致常见病变的假说由c o l l i n s 等人率先 提出，他们认为由于人d n a 基因组中一些常见位点发生变异可以导致一 些常见疾病的发生、发展甚至恶化。之所以不同的人对各类疾病有着不同 的临床特征和易患性的差异正是由于这些常见位点的变异所导致的。 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ；s n p ) 是指出现在基 因组水平由单个核苷酸变异引起的d n a 序列多态性，人d n a 基因组的 变异9 0 是由s n p 所贡献的。在1 9 9 6 年由科研工作者作为第三代遗传标 志提出的。最近研究提示：s n p 密度为每3 0 0 b p 就会存在一个s n p 位点， 目前认为可能存在的s n p 数目约为1 0 0 0 万个。 本课题选取了m c p 1 2 5 1 8 ( a g ) 位点与丙型肝炎进行相关性研究。 材料与方法 1 材料 1 1 研究对象 选取2 0 0 9 年1 2 月一2 0 1 0 年1 2 月在河北省沧州市中心医院和河北省 沧州市传染病医院就诊的丙型肝炎患者9 8 例为实验组，男性7 7 例，女性 2 1 例，年龄2 3 一7 2 岁，平均4 8 6 岁；同期选取健康人9 8 份作为实验对 照组，男性6 8 例，女性3 0 例，年龄2 0 - - - ，7 6 岁，平均4 6 1 岁。 研究论文 筛除标准：甲、乙、戊型肝炎病毒携带者；酒精性肝病患者； h i v 感染者；自身免疫性肝病患者。 1 2 研究对象血液标本的采集 ( 1 ) 抽取实验组对照组的空腹全血2 m l ( 用抗凝剂e d t a 抗凝) ； ( 2 ) 血标本详细记录、编号； ( 3 ) 血标本在2 0 冰箱保存备用。 1 3 实验仪器及试剂 1 3 1 主要仪器 仪器厂家 p c r 仪( a b 0 0 7 0 0 0 型)美国a b i 公司 超净工作台美国b 1 0 l o g i c a l 公司 2 0 冰箱 s a n y o 公司 低温超速离心机( s c r 2 0 b 型)日本h i t a c h i 公司 稳压稳流电泳仪( d y e 1 6 b )北京六一仪器厂 恒温水浴箱北京六一仪器厂 v o r t e x 2g e n i e 振荡器s c i e n t i f i ci n d u s t r i e s 公司 g l s 数码凝胶图象处理系统( 配软件)上海天能科技有限公司 1 3 2 主要试剂 试剂厂家 d n a 提取试剂盒北京博迈德生物公司 蛋白酶k北京博迈德生物公司 p c r 引物 i n v i t r o g e nb i o t e c h n o l o g y 公司 限制性内切酶takara b i o t e c h n o l o g y 公司 异丙醇和无水乙醇华美生物工程公司 d n t p北京博迈德生物公司 b l e n d t a q北京博迈德生物公司 1 0 b l e n dt a qb u f f e r ( 已经添加镁离子)北京博迈德生物公司 d n am a r k e r北京康为世纪生物公司 2 实验方法 2 1 实验原理 本研究的s n p 位点基因型的多态性是由聚合酶链式反应一限制性内 研究论文 切酶片段长度多态性法( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ，p c r - r f l p ) 来检测的。 s n p 位点的分型是通过限制性内切酶选择性地识别和切割基因组中 特异的酶切位点来进行。当一个g a 变异的s n p 位点存在于基因组中时， 由于同源染色体的分离和重组，可能存在3 种基因型：a a 、g g 、a g 。 经限制性内切酶p i i 的消化后可识别这三种基因型。经限制性内切酶 p v u i i 识别和切割后电泳表明：g g 基因型两条同源染色体均被切开，呈2 条带；a g 基因型只有一条染色体被切开，另一条染色体不能切开，呈3 条带；a a 基因型两条同源染色体均不能被识别切割，呈1 条带。如图所 示。 夹变型耆限制性嘲切位点 1 | _ 广1 = = _ 1 l r 限制性核敞内切酶蛹切 1 i r 野生郄r 制性酶切位忘棺失 ，r r 1 p c r - r f l p 原理 2 2 主要技术路线 提取基因组d n a ，设计引物 上 用基因组d n a 为模板，以设计好的引物进行扩增 上 特定限制性内切酶消化p c r 产物 上 研究论文 琼脂糖凝胶电泳消化产物 0 鉴定p c r 产物的可能基因型 上 基因计数法计算等位基因频率，进行统计分析 2 3 实验操作 2 3 1 基因组d n a 的提取 ( 1 ) 取2 0 0 p 1 血液，加入3 倍体积的红细胞裂解液s r ( 6 0 0 t 1 ) 上下 颠倒混匀，室温放置5 1 0 分钟，期间上下颠倒2 3 次，混匀。 水当血液样品体积1 0 0 d 时加红细胞裂解液s r 3 0 0 9 l ，以此类推。 ( 2 ) 1 2 0 0 0 r p m ( - 1 3 ，4 0 0 x g ) 离心3 0 秒，吸弃上清，重新加入6 0 0 1 红细胞裂解液s r ，1 2 0 0 0 r p m ( 1 3 4 0 0 x g ) 离心3 0 秒，吸弃上清( 注意 不要触及或吸出管底白色沉淀) ； 凇离心后再管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片 和白细胞团在一起，但不会影响后续试验结果。 木以上步骤，每次充分混匀非常重要，否则易造成细胞裂解不彻底， 导致柱堵塞或d n a 产量降低。 ( 3 ) 加入2 2 0 “1 结合液s b ，上下颠倒离心管充分混匀，5 8 放置1 0 分钟，期间上下颠倒2 - 3 次。 ( 4 ) 加入2 2 0 1 t l 无水乙醇，快速颠倒离心管混匀，此时可能有白色絮 状沉淀出现，应将沉淀和溶液一起转移到吸附柱中，1 2 0 0 0 r p m 离心1 分 钟，弃掉废液。 ( 5 ) 向吸附柱中加入7 0 0 “1 漂洗液p w ( 使用前请先检查是否己加入无 水乙醇) ，1 2 0 0 0 r p m ( - 1 3 ，4 0 0 x g ) 离心3 0 秒，倒掉废液，将吸附柱放入 收集管中。 ( 6 ) 向吸附柱中加入5 0 0 1 漂洗液p w ，1 2 0 0 0 r p m ( - 1 3 ，4 0 0 x g ) 离心 3 0 秒，倒掉废液。 ( 7 ) 将吸附柱放回清空的收集管中，1 2 0 0 0 r p m ( , - - 1 3 ，4 0 0 x g ) 空离心2 分钟。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗 液。 宰注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙 研究论文 醇的残留影响后续的酶反应( 酶切、p c r 等) 实验。 ( 8 ) 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位打入 5 0 1 0 0 t l 洗脱液e b ( 洗脱缓冲液预先在7 0 。c 水浴中预热) ，室温放置3 5 分钟1 2 0 0 0 r p m 离心1 分钟。 木洗脱体积越大，洗脱效率越高，如需要d n a 浓度较高，可以适当 减少洗脱体积，但最小体积不应少于5 0 卜t l ，体积过小降低d n a 洗脱效率， 降低d n a 产量。 ( 9 ) 所得基因组d n a 溶液放置在2 0 保存。 2 3 2p c r 扩增 ( 1 ) p c r 引物的设计与合成 由i n v i t r o g e nb i o t e c h n o l o g y 公司合成引物，引物序列： f o r w a r d5 c c g a g a t g t t c c c a g c a c a g 3 r e v e r s e5 c t g c t t t g c t t g t g c c t c t t 3 ( 2 ) p c r 扩增反应体系 p c r 扩增的反应体系为5 0 p j ，包含： d n a 模板3 “1 d n t p s ( 10 m m o l l )1 “l 上游引物( 2 5 l _ t m 0 1 l )2 9 l 下游引物( 2 5 p m o l l )2 山 m g 离子4 “1 t a q 酶( 5 p 1 ) o 5 9 l lo x b u f f e r 5 1 d 灭菌d d h 2 0 3 2 5 9 l ( 3 ) p c r 扩增反应条件： a 9 4 c 预变性，6m i r a 进入循环 b 变性9 4 ，6 0s c 退火5 5 ，6 0s d 延伸7 2 ，9 0s ；共3 5 个循环 e 终末延伸7 2 ，1 0 m i n 。 ( 4 ) 2 琼脂糖凝胶电泳检测p c r 扩增产物 a 配制2 的琼脂糖凝胶( 含o 5 1 d m l 溴化乙锭) 研究论文 b 取5 9 l 扩增产物与1m 溴酚蓝上样液混匀后加样 c 于1 t b e 缓冲液中，7 5 v 电泳约4 0 分钟 d 电泳结束后，切断电源，取出凝胶，于紫外透射仪灯下观察结果。 m c p 1 基因的p c r 扩增产物为9 3 0 b p 。 2 3 3p c r 扩增产物的酶切反应 限制性内切酶p v u i i 对c a g c t g 序列进行酶切反应。 应用限制性内切酶p v u i i 对p c r 扩增产物进行酶切反应。 ( 1 ) p v u l i 酶切反应体系： 酶切反应体系总体积2 5 9 l ，3 7 水中孵育8 个小时。 p c r 扩增产物 1 0 9 l h 2 0 1 2 9 l ， 10 x b u f f e r 2 “l 内切酶 1 “1 ( 2 ) 2 琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物 a 配制2 的琼脂糖凝胶( 含0 s g l m l 溴化乙锭) 。 b 取5 9 l 酶切产物与1 山溴酚蓝上样液混匀后加样。 c 于1xt b e 缓冲液中，将样本在7 5 v 电泳约4 0 分钟。 d 电泳结束后，切断电源，取出凝胶，于紫外透射仪灯下观察结果。 ( 3 ) 限制性内切酶酶切分析 使用p v u i i 内切酶切可分出3 种基因型： a 纯合子a 基因型：酶切产物为长度9 3 0 b p 的1 条带，因其位点 不能为p v u i i 内切酶所识别切开，故只有l 条带。 b 纯合子g g 基因型：酶切产物为长度2 2 2 b p 、7 0 8 b p 的2 条带，因 其位点能被p i i 内切酶所识别切开，故有2 条带。 c 杂合子a g 基因型：酶切产物为长度2 2 2 b p 、7 0 8 b p 、9 3 0 b p 的3 条 带，g a 位点部分发生突变，而部分未发生突变，所以a g 型总共有3 条带。 2 4 统计分析 本实验所有数据均在s p s s l 3 0 软件包上完成。所有数据及指标经t 检验、方差分析、x2 检验及f i s h e r 精确概率法分析与处理，通过尸 o 0 5 ) ，表明具有可比性。 6 不同m c p 1 基因基因型及等位基因型的患者年龄比较 实验组结果分析，m c p 1 基因两种等位基因型年龄比较f = 2 6 9 4 ，p = o 11 6 ；三种基因型年龄比较f = i 7 11 ，p = 0 2 1 6 ，说明实验组基因型及等 位基因型与年龄差别无统计学意义( 表3 ) 。 研究论文 对照组结果分析，m c p 1 基因两种等位基因型年龄比较f = 2 0 1 3 ，尸 = o 1 4 7 ；三种基因型年龄比较f = 2 0 6 5 ，p = 0 1 5 1 ，说明对照组基因型及等 位基因型与年龄差别无统计学意义( 表4 ) 。 6 1 在实验组中不同m c p 1 基因基因型及等位基因型的患者年龄比较 t a b l e3t h ed i f f e r e n tm c p 一1g e n o t y p i ca g ec o m p a r i s o ni nc a s eg r o u p 6 2 在对照组中不同m c p 1 基因基因型及等位基因型的患者年龄比较 t a b l e4t h ed i f f e r e n tm c p - 1 g e n o t y p i ca g ec o m p a r i s o ni nc o n t r o lg r o u p 7 不同性别m c p 1 基因基因型比较 实验组不同性别m c p 1 基因基因型比较差异均无统计学意义 ( x2 = o 1 8p = 0 9 1 4 ) ( 表5 ) 。 对照组不同性别m c p 。l 基因基因型比较差异均无统计学意义 ( x2 = o 4 1 9p = 0 7 8 3 ) ( 表6 ) 。 7 1 在实验组中不同性别m c p 1 基因基因型的比较 研究论文 t a b l e5t h ed i f f e r e n tg e n d e rm c p 一1g e n o t y p i cc o m p a r i s o ni nc a s eg r o u p 7 2 在对照组中不同性别m c p 1 基因基因型的比较 t a b l e6t h ed i f f e r e n tg e n d e rm c p 一1g e n o t y p i cc o m p a r i s o ni nc o n t r o lg r o u p 实验组和对照组不同性别m c p 1 基因基因型比较差异均无统计学意 义( 尸 0 0 5 ) 。 讨论 丙型肝炎发病机制非常复杂，受多种因素影响。h c v 感染后临床表 型多样，可以是自然清除病毒，或出现隐性型、亚临床型、普通型、暴发 型等，也可以有持续感染导致肝硬化、肝功能衰竭甚至肝细胞癌。近年来， 对丙型肝炎研究较多，但是其具体发生、发展机制仍然未明。单核细胞趋 化蛋白i ( m c p 1 ) 作为一种重要的趋化性细胞因子，在传染性疾病的发生、 发展中发挥着重要作用，可能与越来越受重视的丙型肝炎发生机制的发生 有关。 一、丙型肝炎的现状 丙型病毒性肝炎是一种主要经血液传播、由丙型肝炎病毒( h e p a t i t i sc v i r u sh c v ) 弓i 起的肝脏急、慢性炎症性疾病，感染2 0 年后肝硬化发生率 显著上升，感染3 0 年后肝细胞癌的比率会显著增加。肝硬化和肝癌是慢 性丙型肝炎的主要死因。成年人感染h c v 后，慢性持续性感染高达6 0 研究论文 8 5 ，远远高于乙型肝炎病毒( h e p a t i t i sbv i r u sh b v ) 感染慢性化率( 5 1o ) ，并可进一步发展成肝纤维化、肝癌【6 ，7 】。 二、单核细胞趋化蛋白一1 ( m c p 1 ) 的特性 单核细胞趋化蛋白1 ( m o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n tp r o t e i n 。1 ，m c p 1 ) 是一 条由7 6 个氨基酸组成的碱性蛋白单链。由巨噬细胞、内皮细胞、单核细 胞等释放和分泌机体中大部分的单核细胞趋化蛋白1 。另外，单核细胞趋 化蛋白1 也可以由星形细胞、骨细胞、表皮细胞和某些肿瘤细胞等分泌和 释放。 单核细胞趋化蛋白1 是趋化因子c c 亚家族中的一员，含有四个保守 半胱氨酸，分别位于其分子结构中的11 、1 2 、3 6 、5 2 位，这四个半胱氨 酸之间由二硫键连接，进而形成环状结构；m c p 1 由两个序列来主要表 达其生物学活性，这两个序列分别是：( d t h r - c y s t v r 序列( 第1 0 - - - 1 2 位 氨基酸) ，由s e r 和l y s 组成另一个序列。m c p 1 生物活性的改变可以 通过这些序列的点突变所导致 8 , 9 , 1 0 , 1 1 1 。 近年来，经过大量的研究，人们认识到：m c p 1 在免疫性疾病以及 炎症性疾病的发生、发展中占据着重要的位置，所以m c p 1 的研究工作 越来越受到人们的重视。 三、本实验的研究意义 近来一些研究发现，h c v 感染后，宿主中m c p 一1 的分泌水平上升， 其中，m c p 1 主要是由外周血中的单核细胞、肝星状细胞产生的。m c p 1 对单核、淋巴细胞具有趋化活性，肝窦内皮细胞被活化后的淋巴细胞、单 核细胞所损伤，同时m c p 1 又可以由活化后的单核细胞分泌而成。体循 环中的单核细胞和t 细胞由活化后的单核细胞分泌的m c p 1 所激活，进 而形成“瀑布效应”，扩大对宿主的损伤。 h c v 感染可通过多种机制直接或间接引起肝细胞损伤，形成肝损伤 和慢性硬化，在反复肝修复过程中发生癌变。当m c p 1 的浓度正比于 h c v - r n a 滴度增高的含量，同样，对宿主免疫性损伤的程度也正比于被 激活的单核巨噬细胞数量【1 2 】。丙型肝炎的慢性化主要是由于h c v 感染 肝细胞后可以长期存活所导致，而同期m c p 1 表达水平在未被h c v 感染 的肝细胞中上调，这种上调的表达水平导致了肝功能的进一步损伤。 有研究【1 3 】发现，有两个多态性位点分布于m c p 1 基因调节区中，即 研究论文 2 0