（免疫学专业论文）基因工程重组乳酸乳球菌的构建.pdf

目录 内蒙古医学院学位论文原创性声明 中文摘要( 1 ) 英文摘要( 2 ) 论文题目( 3 ) 材料与方法( 5 ) 结果与分析( 1 5 ) 讨论( 1 9 ) 结论( 2 3 ) 参考文献( 2 3 ) 文献综述( 2 6 ) 参考文献( 3 5 ) 主要缩略词表( 3 8 ) 攻读学位期间发表文章情况( 3 9 ) 个人简历( 4 0 ) 致谢( 4 1 ) 中文摘要 。 目的构建含有过氧化氢酶基因( c a t a l a s e ，c a t ) 的基因工程乳酸菌( l a c t i ca c i db a e t e r i a ，l a b ) ，为发展环境抗性的基因工程乳酸菌提供试验方法，奠定理论基础。方法培 养大肠杆菌( e c o l iw 3 1 1 0 ) ，提取基因组d n a ，采用限制性内切酶s a u 3 m 进行部分酶 切，分离纯化1 5 k b 以上的d n a 片段ob a m h i 酶切大肠杆菌质粒p u c l 8 后，与经 s a u 3 a i 部分酶切不同片段用t 4 连接酶进行连接，转化大肠杆菌d i - i s a o 通过b h i 一单宁 酸培养介质，先厌氧培养，再有氧培养，诱导过氧化氢酶酶活性，从而筛选出含有过氧化 氢酶的基因克隆。将筛选出的基因片段与经b a m h i 酶切后的乳酸乳球菌表达载体质粒 p r y 3 0 0 连接，将重组质粒p r y 3 0 0 一c a t 电转入乳酸乳球菌n z 9 0 0 0 中，筛选出转化子 n z 9 0 0 0 一c a t ，对重组菌株进质粒抽提，鉴定。结果分离到了大肠杆菌过氧化氢酶基 因，并将重组质粒p r y 3 0 0 一c a t 电转入n z 9 0 0 0 0 成功构建了含有c a t 基因的重组载体 p r y 3 0 0 一c a t ，经酶切，p c r 鉴定后与预期结果完全吻合。结论成功的利用限制性内切 酶s a u 3 a i 部分酶切大肠杆菌基因组d n a ，并筛选出e c o l ic a t 基因。为e c o l i c a t 基因 通过载体p r v 3 0 0 在乳酸乳球菌中表达奠定了基础。 关键词过氧化氢酶基因质粒载体p r y 3 0 0 乳酸乳球菌 本项目得到广东省自然科学基金项目( 0 6 0 2 9 3 5 4 ) 资助。 c o n s t r u c t i o no fr e c o m b i n a n tl a c t o c o c c u sl a c t i s a b s t r a c t o b j e c t i v et h ec o n s t r u c t o no fg e n g e t i ce n g i n e e r i n g1a c t i ca c i db a c t e r i ac o n t a i n i n gc a t a - l a s ep r o v i d se x p e r i m e n t a lm e t h o d sa n dl a y st h et h e o r e t i cf o u n d a t i o nf o rd e v e l o p i n gt h ef o o d g r a d el a c t o c o c c u sl a c t i sp o s s e s s i n gh a r d i n e s si nt h ee n v i r o n m e n t m e t h o d s e c o l iw 3 11 0 w e r ec u l t i v a t e d g e n o m i cd n aw a se x t r a c t e da n d t h e nw a sp a r t i a l l yd i g e s t e dw i t hr e s t r i c t i v e e n z y m es a u 3a j g e n o m i cd n af r a g m e n t so v e r1 5k bw e r es e p a r a t e da n dp u r i f i e d v e c t o r p u c l 8a f t e rd i g e s t e d 谪t l lb a m h lw a sl i n k e dt ot h ed i f f e r e n td n a f r a g e m e n t sp a r t i a l l yd i g e s t e d 证t l ls a u 3 a lb yl i g a s e st 4 a n dt h e nt h en e wl i g a t e dp r o d u c t sw e r et r a n s f o r m e di n t ot h ee c o l i c o m p e t e n td h 5 a t h et r a n s f o r m e n t sw e r ei n c u b a t e da n a n a e ro b i c a l l yo nb r a i nh e a r ti n f u s i o n ( b h i ) c o n t a i n i n gt a n n i ca c i d ，t h e nw e r ek e p ta e r o b i c a l l yf o raf u r t h e r2 4 h t h em e t h o dc o u l d d e t e c tc a t a l a s ea c t i v i t ya n ds c r e e n e dt h ec a t a l a s e p o s i t i v ec l o n e s t h ec a t a l a s eg e n ew a s l i n k e dw i t ht h el a c t i ca c i db a c t e r i ae x p r e s s i o nv e c t o rp r y 3 0 0w h i c hw a gd i g e s t e dw i t hb a m h i t h er e c o m b i n a n tp l a g m i dw a sn a m e d 鹊p r v 3 0 0 一c a ta n dt h e nt r a n s f o r m e di n t ol a c t o c o c c u s l a c t i sn z 9 0 0 0b ye l e c t m t r a n s f o r m a n tu n d e r1 7 5 0 va n dw a ss c r e e n e db ya m p i c i l l i n p c ri d e n - t i f i c a t i o na n dr e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o n a n a l y s i sc o n f i r m e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p r v 3 0 0 一c a tw a se l e c t r o p o r a t e di n t on z 9 0 0 0 t h er e c o m b i n a n tp r y 3 0 0 一c a tw a so b t a i n e d r e s u l t st h ec a t a l a g ew a gi s o l a t e da n dt r a n s f o r m e di n t ol a c t o c o c c u sl a c t i sn z 9 0 0 0b ye l e c t r o - t r a n s f o r m a t i o n p c ri d e n t i f i c a t i o na n dr e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o nc o n f i r m e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp r v 3 0 0 一c a tw a gc o n s t r c t e ds u c c e s s f u l l y c o n c l m i o n r o t a lg e n o m i cd n aw a s p a r t i a l l yd i g e s t e dw i t hs a u 3 a is u c c e s s f u l l y a n dt h ec a t a l a s ec l o n ew a gi n d u c e d t h eg e n g e t i c e n g i n e e r i n gl a c t o c o c c u sl a c t i sn z 9 0 0 0 一e a tw a ss u c c e s s u l l yc o n s t r u c t e d t h i ss t u d yl a i dt h e t h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o re x p r e s s i n ge c o l ic a tp r o t e i n k e yw o r d s c a t p r v 3 0 0 l a c t o c o c c n sl a c t i s t h ep r o j e c ti sf u n d e db yg u a n g d o n gp r o v i n c en a t u r a ls c i e n c ef u n d a t i o n ( 0 6 0 2 9 3 5 4 ) 基因工程重组乳酸乳球菌的构建 。 益生茵概述 益生菌是指具有生物活性，摄入适当量时可以对宿主产生有益作用的微生物【l 】o 人 类食用益生菌已有几千年的历史，主要由食物提供，并通过调整机体肠道微生态环境来 达到促进健康的目的。自从1 9 6 5 年美国学者提出益生菌的概念至今，对于益生菌的研 究热潮持续高涨。益生菌在动物体内能对糖类代谢有一定的改善作用，可以诱导体内特 异性及非特异性免疫，容易进行黏膜免疫，具有抗肿瘤活性。益生菌广泛用于农业、工业 和食品产业等领域，具有很重要的经济价值，而且它在医药工程等领域中的长期应用， 巳证明不具有致病性，被公认属于安全级( g e n e r a l l yr e c o g n i z e d 弱s a f e ，g r a s ) 微生物【2 】o 目前世界范围使用比较广泛的主要是乳酸菌属和双歧菌属j ，随着人们对益生菌的进一 步认识，益生菌的医疗保健功能也逐渐被人们认可，这些功能包括：预防胃肠道感染、抗 肿瘤、抗过敏免疫调节、调节血脂、促进新陈代谢h 1 等方面。在我国随着科技的进步，已 经开始重视益生菌产品的研究和生产，分别从丹麦、芬兰等国外著名企业引进菌种开展 合作，生产适合东方人的益生菌属。可以预见，随着益生菌研究生产技术的不断提高和 发展，具有积极作用的益生产品将越来越造福于人类生活o 乳酸菌的益生作用和抗氧化性研究 乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i al a b ) 是一类革兰氏阳性菌，属兼性厌氧菌，大多数g + c 含量比较低、广泛地分布于自然界，是与人类关系密切的益生菌之一。近年来乳酸菌 的特殊生理活性和营养保健功能越来越受到人们的重视。乳酸菌能够增加肠道有益菌 的繁殖，起到整肠作用，且作用效果温和自然，同时产生有抑菌和杀菌作用的细菌素，拮 抗有害细菌如葡萄球菌、沙门氏菌的产生”jo 乳酸菌有很强的抗酸能力，能够产生大量 的乳酸从而有效的杀灭不耐酸的细菌，同时减轻了肝脏的解毒负荷，从而起到保护肝脏 的作用。乳酸菌还能激活免疫细胞的活性，刺激肠粘膜淋巴结，增强机体免疫力，减少致 癌物质在人体内的存积，具有一定的抗肿瘤的能力【6 】o 乳酸菌还可以增强乳糖的代谢， 尤其适合乳糖不耐人群食用。在预防幽门螺杆菌感染方面也有积极的作用，经研究发现 干酪乳杆菌可有效的抑制幽门螺杆菌的繁殖，同时减轻炎症【7 】。此外，乳酸菌还有降低 胆固醇、降血压、预防肠炎，抗突变等作用。 乳酸菌具有的特殊的营养医疗保健功能，但研究发现，在有活性氧自由基的环境中， 。 凼鐾直匿堂瞳亟堑壅生堂焦迨塞( 垫! q 至2 具有抗氧化活性的乳酸菌的生存时间要远长于无抗氧化活性的1o 所以对乳酸菌抗氧 化性研究越来越受到食品科学、预防医学等诸多门类科学研究者的关注。k u l l i s a a rt 等 研究者发现部分菌株的嗜酸乳球菌无细胞提取物中具有一定的抑制脂质体过氧化的能 力，其中含有少量s o d ，同时具有一定螯和f e 2 + 的能力。对此类乳酸菌中s o d 基因研究 发现，其二级结构以a 螺旋为主，且序列有较高的保守性。l i n 等人在对长双歧杆菌研究 发现该菌属具有一定的完整细胞抗氧化活性，对抗坏血酸的自动氧化具有抑制作用。有 报道称大多数乳酸菌可能是通过产少量的s o d 酶和谷胱甘肽来清除一定量的羟自由基 和过氧化氢 9 】，且有些作用机制还有待于进一步研究ot e r a h a r a i o 】等研究后指出乳酸菌 的抗氧化效果与维生素e 极为相似，但化学性质和肠道的吸收途径却大不相同。虽然一 些乳酸菌具有抗氧化活性，但是在接触酶实验当中发现在新鲜培养的菌苔上滴加h ：0 ：， 观察后无气泡产生，表明无过氧化氢酶产生，为接触阴性菌【l o 因此对乳酸菌的抗氧化 性研究应进一步加深。 过氧化氢酶的生理作用。 生命体的代谢过程不断产生各种有活性的氧自由基，指独立存在的一个或几个不配 对电子的原子或原子集团，如超氧阴离子自由基( 0 2 一) ，羟自由基( h o ) ，过氧化氢 ( h ：0 ：) 等，通称活性氧2 1o 其含有的单电子有强烈的配对倾向，通过氧化作用攻击遇到 的任何大分子，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸等物质氧化损伤，使细胞坏死或突变。由 于自由基极高的氧化性，造成脂质过氧化增强，脂质过氧化物又可分解为多种自由基，从 而引起连锁反应 1 3 1o 生命体在进化过程中逐渐形成防御自由基损害的防御系统，主要 包括酶类和非酶类两大类。抗氧化酶类主要指超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶 ( c a t ) 、过氧化物酶( p o d ) 等。其中除s o d 是通过清除超氧阴离子自由基而起到抗氧 化作用，后两种则是通过清除自由基前体，h ：0 ：和脂质过氧化物来抑制自由基的形 成n4 1 。过氧化氢酶是分解h ：0 ：专用酶，又称触酶，催化反应式为h ：0 ：+ h ：0 ：学 2 h ：0 + 0 ：，从而产生无害的h ：0 和0 2 0 过氧化氢酶基因广泛存在于原核生物和真核生 物中引，根据其理化特性，可划分为典型性( t y p i c a l ) 、非典型性( a t y p i c a l ) 以及c a t 一过 氧化物酶( c a t a l a s e p e r o x i d a s e s ，c a t p o d ) o 典型性c a t 是由4 个具有相同多肽链的 亚基组成，每个亚基含有一个血红素辅基作为活性位点，大约含有7 0 4 6 0 个氨基酸残 基。其研究成果在抗毒、防癌以及环境生物监测方面都有重要的影响u 引。而c a t p o d 目前仅在原核生物真菌中，部分植物组织中发现，非典型性c a t 则非常少见u o 乳酸乳球菌属兼性厌氧菌，其主要原因之一是缺乏抗氧化酶，特别是缺乏过氧化氢 凼鐾直匿堂陵亟婴塞生堂焦迨塞( 兰q ! q 生2 o 酶( c a t ) ，不能抑制有氧环境下活性氧产生的，从而对细胞生理产生多种影响。因而，氧 环境的协迫成为限制乳酸乳球菌不能长期定植的因素之一。过氧化氢酶是一种细菌的 高活力保守蛋白酶，是清除h ：o ：的专用酶，其功能最为主要的就是参与活性氧代谢过 程。氧分子对生物体是无毒性的，一旦氧分子的电子分布发生改变，就变成活性氧。c a t 可以催化过氧化氢分解，防止膜脂过氧化，可避免细胞生长过程中由活性氧引起的损伤。 原核c a t 主要来源于需氧微生物中，需氧的细菌、真菌、放线菌中含有大量的c a t 【l 引，因 此，从大肠杆菌染色体d n a 中分离c a t 基因是可行的。 本研究从大肠杆菌中染色体中分离、筛选c a t 基因，再将其克隆到乳酸乳球菌载体 中，为发展食品级环境抗性的基因工程乳酸菌提供试验方法o 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌株与质粒 e c o l iw 3 1 1 0 菌株 p u c l 8d n a n z 9 0 0 0 p r v 3 0 0 d h 5 仅感受态细胞 1 1 2 试剂 内蒙古医学院微生物教研室保存 大连宝生物工程有限公司 内蒙古农业大学馈赠 法国农业科学院馈赠 北京天根生化科技有限公司 d l 3 0 0 0d n am a r k e r 南京博尔迪生物技术有限公司 d l 2 0 0 0d n am a r k e r南京博尔迪生物技术有限公司 5 0 0 b pd n a m a r k e r大连宝生物工程有限公司 细菌基因组d n a 提取试剂盒( d p 3 0 2 ) 北京天根生化科技有限公司 s a u 3 a i 限制性内切酶德国n e b 公司 b a m h i 限制性内切酶大连宝生物工程有限公司 t 4 d n al i g a s e大连宝生物工程有限公司 普通琼脂糖凝胶d n a 回收试剂盒( d p 2 0 9 ) 北京天根生化科技有限公司 高纯质粒小量制备试剂盒( d p l 0 0 1 ) 北京百泰克生物技术有限公司 2x t a qm a s t e rm i x南京博尔迪生物科技有限公司 溶菌酶( 5 0 m g m 1 )北京天根生化科技有限公司 1 0x l o a d i n gb u f f e r大连宝生物工程有限公司 o a m p i c i l l i n 琼脂糖 脑一心浸膏培养基( b h i ) 单宁酸( t a n n i ca c i d ) l b 牛肉膏培养基 m r s 肉汤培养基 m r s 琼脂培养基 其余常用试剂均为国产分析纯 1 1 3 主要仪器表 凼鏊直匡堂医亟婴塞生堂焦迨塞i 垫! q 生2 南京博尔迪生物技术有限公司 b i o e s t 产品 广州环凯微生物科技有限公司 生工生物工程( 上海) 有限公司 北京天根生化科技有限公司 广州环凯微生物科技有限公司 广州环凯微生物科技有限公司 l 试验主要仪器一览表 1 1 4 培养基、抗生素及常规试剂的配制 a m p i c i l l i n 组分浓度：l o o m g m l 配制量5 0 r a l 配置方法：1 称取5 9a m p i c i u i n 置于5 0r i l l 离心管中2 加人4 0m l 灭菌水，充分混 凼鏊直匡堂暄亟婴塞生堂焦迨塞( 垫! q 生2e 合溶解后，定容至5 0i n l3 用0 2 2 u r n 滤器过滤除菌4 分装后，一2 0 。c 保存o l b ( l u r i a b e r t a n i ) 培养基 组分浓度：2 1m g m l 配置方法：称取l b 牛肉膏培养基4 2 9 ，置于2 0 0m l 锥形瓶中，加入1 0 0 m l 超纯水，充分溶解后，定容至2 0 0i n l ，1 2 0 高压灭菌2 0 分钟，4 保存。 l b ( l u r i a b e r t a n i ) a m p 培养基 组分浓度：l b2 1m g i i l l a m p1 0 0 斗m 1 配置方法：称取i j b 牛肉膏培养基4 2 9 ，置于2 0 0m l 锥形瓶中，加入1 0 0 m l 超纯水， 充分溶解后，定客至2 0 0 m l ，1 2 0 高压灭菌2 0 分钟，待冷却后，加入2 0 0 l a , l - a m p ( 1 0 0m g m 1 ) 混合后，4 。c 保存o l b ( l u r i a b e r t a n i ) 琼脂培养基 组分浓度：l b2 1m g m l a m p1 0 0 l a , g m l 琼脂糖1 5 配置方法：称取l b 牛肉膏培养基4 2g ，置于2 0 0m l 锥形瓶中，加入1 0 0m l 超纯水， 充分溶解后，定容至2 0 0m l 加入3 9 琼脂糖，煮沸混匀，1 2 0 。c 高压灭菌2 0 分钟，待冷却 后，加入2 0 0 止a m p ( 1 0 0m g m 1 ) 混合后，4 。c 保存。 脑一心浸膏浸萃培养基( b i n ) 配置方法：称取脑一心浸膏浸萃培养基5 1 9 ，置于2 0 0m l 锥形瓶中，加入8 0 血超纯 水，充分溶解后，定容至1 0 0m l ，1 2 0 ( 2 高压灭菌2 0 分钟，待冷却后，加入1 0 0 1 a , l a m p ( 1 0 0 n e g n a ) 混合后，4 a c 保存。 2 单宁酸溶液 配置方法：称取单宁酸粉末1g ，置于1 0 0 m l 锥形瓶中，加入4 0 d 超纯水，充分溶解 后，定容至5 0 r i d ，避光常温保存o m r s 肉汤培养基 配置方法：称取m r s 肉汤培养基1 0 4 5g ，置于2 0 0m l 锥形瓶中，加入1 0 0r n l 超纯 水，充分溶解后，定容至2 0 0m l ，1 2 0 高压灭菌2 0 分钟，4 。c 保存o m r s 琼脂培养基 配置方法：称取m r s 琼脂培养基1 2 8 6g ，置于2 0 0m l 锥形瓶中，加入1 0 0m l 超纯 。 豳蓥直匡堂暄亟婴壅生堂焦迨塞( 垫! q 生2 水，充分溶解后，定容至2 0 0m l ，1 2 0 y ；高压灭菌2 0 分钟，4 保存。 电穿孔缓冲液 配置方法：2 7 2r e t o o l 1 蔗糖，1 m m o l 1m g c l 2 ，7m m o l 1k h 2 p 0 3 ( p h 7 4 ) o 1 2 方法 1 2 1 1 大肠杆菌的培养 自l b 琼脂培养基挑取大肠杆菌w 3 11 0 单菌落接种于2 0i l l ll b 液体培养基中，3 7 。c 、2 0 0 转分振荡过夜培养o 1 2 1 2 大肠杆菌基因组d n a 的提取 大肠杆菌基因组d n a 的抽提按照北京天根生化科技有限公司细菌基因组d n a 提 取试剂盒操作步骤进行，具体步骤如下： ( 1 ) 取菌液4 5m l ，1 0 0 0 0 r p m 离心1 分钟。 ( 2 ) 向菌体沉淀加入2 0 0 一缓冲液c a ，振荡至菌体彻底悬浮。 ( 3 ) 向管中加入2 0 山蛋白酶k ，混匀o ( 4 ) 加入2 2 0 斗1 缓冲液g b ，振荡1 5 秒，7 0 ( 2 放置1 0 分钟，溶液应变清亮，简短离心以 除去管盖内壁的水珠o ( 5 ) 加2 2 0 山无水乙醇，充分振荡混匀1 5 秒，此时出现絮状沉淀，简短离心以除去管 盖内壁的水珠o ( 6 ) 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱c b 3 中，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 秒， 倒掉废液，将吸附柱c b 3 放入收集管中o ( 7 ) 加入5 0 0 山缓冲液g d ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 秒，倒掉废液，将吸附柱c b 3 放入收集 管中o ( 8 ) 加入7 0 0 一漂洗液p w ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 秒，倒掉废液，将吸附柱c b 3 放人收集 管中o ( 9 ) 2 n a s o o 山漂洗液p w ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 秒，倒掉废液，将吸附柱c b 3 放人收集 管中o 1 2 0 0 0 r p m 离心1 2 0 秒，倒掉废液，将吸附柱c b 3 开盖放置于室温中5 分钟，以晾 干吸附材料中残余的漂洗液。 仰将吸附柱c b 3 转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加7 0 出高压 d d h 2 0 ，室温放置5 分钟，1 2 0 0 0 r p m 离心1 2 0 秒，将溶液收集到离心管中，- 2 0 e 保存。 1 2 1 3 基因组d n a 定量 内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 l o 年) o ( 1 ) 空白对照为2 5 0 p l d d h 2 0 ，吸取样本1 出加入2 5 0 u ld d h 2 0 在自外分光计上测定 和a 瑚的值，可得到d n a 浓度和粗略估计样品纯度。 ( 2 ) 吸取样品2 w l ，用1 琼脂糖凝胶电泳，9 0 v 电压下电泳3 0 分钟，观察电泳结果o 1 2 1 4 限制性内切酶s a u 3 a i 对基因组d n a 部分酶切1 9 基因组d n a 用限制性内切酶s a u 3 a i 进行部分酶切回收1 5 k b 以上片断，需要调整 酶量、d n a 含量、反应时间，选择最适反应条件。结果表明最适酶量为0 4u 峭d n a ， 反应时间为3 0 一4 0 分钟。可以获得具有完整c a t 序列的基因片断os a u 3 a i 酶切位点为 5 ，上g a t c 3 ，o 酶切体系为： 1 0 n e b 缓冲液 5 出 d n a 6 1 a 1 1 0 0 b s a 0 5 一 内切酶s a u 3 a 1 0 5 止 灭菌d d h 2 03 8 山 t 0 t a l 5 0 出 将上述溶液混匀，3 7 。c 恒温水浴锅，酶切3 0 分钟，加入1 0 l o a d i n gb u f f e r5 山结束 反应。取1 0 山酶切产物进行1 琼脂糖凝胶电泳检测o 1 2 1 5 目的片断的胶回收 按照北京天根生化科技有限公司普通琼脂糖凝胶d n a 回收试剂盒操作步骤进行， 具体步骤如下： ( 1 ) 柱平衡步骤：向吸附柱c a 2 ( 吸附柱放入收集管中) 加入5 0 0 止平衡液b l ， 1 2 0 0 0 r p m 离心6 0 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放人收集管中o ( 2 ) 将1 5 k b 以上的d n a 条带从琼脂糖凝胶中切下，放人离心管中称取重量。凝 胶重0 7 9 ( 带胶离心管1 6 5 9 一空离心管0 8 5 9 = 0 7 9 ) 加入2 1 0 0 一溶胶液p n ，5 0 。c 水 浴放置l o 分钟，其间不断上下翻转离心管，确保胶块充分溶解o ( 3 ) 将上一步所得溶液加入一个吸附柱c a 2 中，室温放置两分钟，1 2 0 0 0 r p m 离心6 0 秒，倒掉废液，将吸附柱c a 2 放入收集管中。 ( 4 ) 向吸附柱c a 2 中加入6 0 0 心漂洗液p w ，1 2 0 0 0 r p m 离心6 0 秒，倒掉废液，将吸附 柱c a 2 放人收集管中o ( 5 ) 向吸附柱c a 2 中加人6 0 0 “漂洗液p w ，1 2 0 0 0 r p m 离心6 0 秒，倒掉废液。 。 凼苤直匿堂瞳亟婴窒生堂焦迨塞f 2 q ! q 生2 ( 6 ) 将吸附柱放入收集管中，1 2 0 0 0 r p m 离心1 2 0 秒，倒掉废液，尽量除净漂洗液。将 吸附柱c a 2 置于室温放置数分钟，彻底晾干o ( 7 ) 将吸附柱c a 2 置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加5 0 肛l 洗脱 缓冲液e b 。室温放置两分钟，1 2 0 0 0 r p m 离心1 2 0 秒，收集d n a 溶液，一2 0 。c 保存。取 5 山连接产物进行1 琼脂糖凝胶电泳检测o 1 2 2 1 重组质粒p u c l 8 一e a t 的构建 1 质粒载体p u c l 8 的单酶切 p u c l 8d n a 购自大连宝生物工程有限公司，链长2 6 8 6 k b ，浓度为1 ，o o o w g r a l ，单 酶切步骤按照限制性内切酶b a m h i 说明书进行，酶切位点为g g a t c co 酶切体系为： b a m h i 1 山 1 0 kb u f f e r 2 山 p u c l 8d n a1 “ 灭菌d d h 2 01 6 山 t o t a l 2 0 山 将上述溶液混匀，放置于3 0 a c 恒温水浴锅，酶切1 5 小时，加入1 0 l o a d i n gb u f f e r 2 1 a , 1 终止反应o 2 酶切产物胶回收 将酶切后的p u c l 8 产物5 山进行琼脂糖凝胶电泳检测，并按照按照北京天根生化科 技有限公司普通琼脂糖凝胶d n a 回收试剂盒操作步骤进行胶回收，步骤同1 2 1 5 并 用紫外分光光度计测定其浓度o 3 载体p u c l 8 与胶回收的目的片断进行连接 2 5 山连接反应体系如下： 1 0 t 4 d n a l i g a s eb u f f e r2 5 山 d n a 片断2 0 出 载体d n a ( p u c l 8 ) 1 5 山 t 4d n al i g a s e 1 山 t o t a l 2 5 一 将上述溶液混匀，放置于1 6 。c 水浴过夜，加入2 5 # m c l a 3c o o n a ( p h 5 2 ) ，加入 6 2 5 山的冷无水乙醇，- 2 0 。c 放置3 0 分钟，1 2 0 0 0 r p m 离心3 分钟回收沉淀，用7 0 冷乙 内蒙古医学院硕士研究生学位论文f 2 0 l o 年) o 醇清洗沉淀一次，1 2 0 0 0 r p m 离心3 分钟回收沉淀，干燥，3 0 “高压d d h 2 0 溶解，- 2 0 。c 保 存o 4 转化d h 5 仅感受态细胞 ( 1 ) 取感受态细胞1 0 0 一置于冰浴中，向感受态细胞中加入连接产物l o 一，轻轻旋转 离心管以混匀溶液，在冰浴中静置3 0 分钟。 ( 2 ) 将离心管至于4 2 。c 水浴中，放置6 0 秒，然后快速将离心管转移到冰浴中，使细 胞冷却2 分钟 ( 3 ) 向离心管中加入5 0 0 山灭菌l b 培养基，混匀后3 7 a c 摇床振荡培养l 小时( 1 5 0 转小时) ( 4 ) 吸取1 0 0 山培养物，加到含有氨苄青霉素a m p ( 0 1m g m 1 ) 的l b 琼脂培养基 上，用无菌弯头玻璃棒将细胞均匀涂开，将平板至于室温至液体被吸收，倒置平板于3 7 恒温培养箱培养1 6 小时o 1 2 2 2 重组子p u c l 8 一e a t 的筛选1 9 】 ( 1 ) 用灭菌环挑取单克隆白色菌落，接种于1 0m l l b a m p 培养基中，3 7 振荡过夜。 ( 2 ) 将高压灭菌后的b h i 介质中加入5 m 1 2 单宁酸溶液，用无菌弯头玻璃棒将溶液 均匀涂开，再将过夜培养的菌液5 0 m l 涂布于培养基上，用无菌弯头玻璃棒将菌液均匀涂 开o ( 3 ) 将培养皿放人放有2 9 焦化默食子酸粉末( 滴加1m l1 m o l 1 n a c h o ，) 的密封袋 中，用封口机封口，放人培养箱中，3 7 。c 厌氧培养2 天，再有氧培养1 天o ( 4 ) 培养基变暗后，在超净台中挑取菌落，在l b a m p 琼脂培养基上划线，3 7 。c 培养 1 6 小时后，挑取单克隆白色菌落，接种于1 0m l l b a m p 培养基中，3 7 振荡培养过夜。 1 2 2 3 重组子p u c l 8 一e a t 提取。 按照北京百泰克生物技术有限公司高纯质粒小量制备试剂盒说明书步骤进行： ( 1 ) 取4 5i i l l 过夜培养菌液，9 0 0 0 r p m 离心3 0 秒，收集菌体。 ( 2 ) 用2 5 0 山溶液p 1 ，重悬菌体沉淀o ( 3 ) 加2 5 0 1 x l 溶液p 2 ，温和上下翻转1 0 次使菌体彻底溶解，溶液变得清亮o ( 4 ) 加4 0 0 1 山1 溶液p 3 ，温和上下翻转l o 次，室温放置5 分钟，室温1 3 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟 ( 5 ) 将上清加入到吸附柱a c 中，1 3 0 0 0 r p m 离心1 分钟，弃滤液。 ( 6 ) 加5 0 0 山去蛋白液p e ，1 3 0 0 0 r p m 离心1 分钟，弃滤液。 囱苤直匿堂瞳亟婴塞生堂焦迨塞( 兰q ! q 生2 ( 7 ) 加入5 0 0 1 山1 漂洗液w b ，1 3 0 0 0 r p m 离心1 分钟，弃滤液。 ( 8 ) 重复步骤七，空柱1 3 0 0 0 r p m 离心2 分钟。室温放置5 分钟，除去乙醇。 ( 9 ) 将吸附柱a c 放入离心管中，在吸附膜中间部位加人7 0 出洗脱缓冲液e b ，室温 放置1 分钟，1 3 0 0 0 r p m 离心1 分钟。 对提取质粒进行1 琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察结果。 仰重组子p u c l 8 一e a t 的酶切鉴定 单酶切步骤按照限制性内切酶b a m h i 说明书进行 酶切体系为： b a m h i 1 止 1 0 kb u f f e r 2 0 a p u c l 8 一e a t2 山 灭菌d d h 2 01 5 m t o t a l 2 0 1 山1 将上述溶液混匀，放置于3 0 。c 恒温水浴锅，酶切1 5 小时，加入1 0 l o a d i n gb u f f e r 2 1 x l 终止反应o1 琼脂糖凝胶电泳胶回收1 5 k b 大小的基因片断o 1 2 3 重组表达质粒p r y 3 0 0 一c a t 的构建 1 2 3 1 重组质粒p r v 3 0 0 的酶切 ( 1 ) 用灭菌环挑取单克隆白色菌落，接种于1 0r r dl b a m p 培养基中，3 7 。( 2 振荡过夜。 ( 2 ) 质粒p r y 3 0 0 的提取方法同1 2 2 3 ，1 琼脂糖凝胶电泳鉴定o ( 3 ) 鉴定正确的p r y 3 0 0 用b a m h i 进行单酶切，然后琼脂糖凝胶电泳并胶回收。 酶切体系为： b a m i - i i 1 1 0 kb u f f e r 2 0 a p r y 3 0 03 山 灭菌d d h 2 01 4 止 t o t a l 2 0 山 将上述溶液混匀，放置于3 0 恒温水浴锅，酶切1 5 小时，加入1 0 l o a d i n gb u f f e r 2 一终止反应o 1 2 3 2 质粒p r y 3 0 0 与e a t 基因片断连接 2 5 山连接反应体系如下： 内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 l o 年) o 1 0 t 4 d n a l i g a s eb u f f e r 2 5 一 i n s e r td n a ( c a t 基因) 1 5 山 载体d n a p r v 3 0 0 5 一 t 4d n al i g a s e1 山 灭菌d d h 2 01 5 山 将上述溶液混匀，放置于1 6 。c 过夜，加入2 5 出的3 m c h 3c o o n a ( p h 5 2 ) ，加人6 2 5 止的冷无水乙醇，一2 0 。c 放置3 0 分钟，1 2 0 0 0 r p m 离心3 分钟回收沉淀，用7 0 冷乙醇 清洗沉淀一次，1 2 0 0 0 r p m 离心3 分钟回收沉淀，干燥，3 0 m 高压d d h 2 0 溶解。取5 一连 接产物进行1 琼脂糖凝胶电泳检测o 1 2 3 3 重组质粒p r y 3 0 0 一c a t 的电转化及转化子n z 9 0 0 0 一c a t 的筛选 1 乳酸乳球菌感受态细胞n z 9 0 0 0 的制备觚2 1 】 ( 1 ) 从m r s 琼脂培养基上挑取n z 9 0 0 0 单克隆接种到m r s 液体培养基中，3 0 。c ，2 0 0 转分振荡培养过夜o ( 2 ) 第二天将培养物( 1 0 0 m ) 转种2 于m r s ( 5 m 1 ) 液体培养基中，3 0 。c 继续培养至 o d = o 7 5 放置于冰上，放置1 0 分钟o ( 3 ) 取3 m l 菌液，离心( 4 ，5 0 0 0 r p m ，1 0 分钟) 收集菌体，用预冷的电穿孔缓冲液 1 0 m l 洗涤细胞两次，分别离心( 4 ，5 0 0 0 r p m ，1 0 分钟) ，用预冷的电传孔缓冲液1 0 0 u l 重 悬菌体，一8 0 。c 冷冻保存备用。 此操作必须在无菌条件下进行 2 重组质粒p r y 3 0 0 一c a t 的电转化及筛选2 2 】 ( 1 ) 取冻存的乳酸乳球菌感受态细胞n z 9 0 0 0 1 0 0 山，加入质粒1 0 一，吹打混匀，置于 冰上1 0 分钟o ( 2 ) 转入电转化杯中，电击( 1 7 5 0 v ，2 0 0 f l ，2 5p l f ) ，电击4 5 - 5 o m s o ( 3 ) 电转后，冰上放置5 分钟，将电转液转入另一灭菌e p 管中，加入6 0 0 止m r s 液 体培养基，3 0 。c 静置培养两小时，取1 0 0 出涂布于a m p ( 1 0 0 p l g m 1 ) 的m r s 琼脂培养基 上，3 0 培养3 6 小时o 1 2 3 4 重组子的鉴定 1 酶切鉴定 ( 1 ) 挑取m r s 琼脂培养基上的单克隆，置于含a m p ( 1 0 0 i i l l ) 的m r s 液体培养基 3 0 培养1 6 小时。 。 凼苤直匿堂瞳亟巫窒生堂焦迨塞( 垫! q 生2 ( 2 ) 收集4 5i i l l 菌液，沉淀菌体，加入稀释后的溶菌酶( 2 0 m g m 1 ) o 5t l l l 彻底悬浮， 3 7 。c 水浴半小时，后续质粒抽提操作步骤与1 2 2 3 相同，并用紫外分光光度计测定其 浓度o ( 3 ) 对抽提到的重组质粒组单酶切鉴定，酶切体系如下： b a m h i 1 1 0 kb u f f e r 2 “ p r y 3 0 0 一c a t2 肛l 灭菌d d h 2 01 5 山 t o t a l 2 0 一 将上述溶液混匀，放置于3 0 。c 恒温水浴锅，酶切1 5 小时，加入1 0 l o a d i n gb u f f e r 2 m 止反应ol 琼脂糖凝胶电泳鉴定o 2 p c r 鉴定 ( 1 ) 根据g e nb a n k 公布的大肠杆菌w 3 1 1 0 基因序列，用p r i m e r 5 0 设计引物，由上 海生工生物技术公司合成。 上游引物： p 1 ：5 一g g g c a t g g c g g c c g c a g t i - i g g c a c 从a g c a c a a c c - 3 下游引物： p 2 ：5 一g g g c g c g c a t g c c a a a c a g a g g t a t t g t r c g 哪g 一3 ( 2 ) 以抽提到的重组质粒为模版进行p c r 扩增，2 5 一反应体系为 表2p c r 反应体系 试剂名称 加样体积 2 t a qm a s t e rm i x 质粒p r v 3 0 0 一c a td n a 模版 上游引物p 。( 1 斗1 彤山) 下游引物p 2 ( 1 斗m 一) 灭菌d d h 2 0 t o t d 1 2 5 1 出 1 5 山 1 5 w 8 5 止 2 5 一 ( 3 ) 扩增反应条件为 9 4 t 23 分钟 凼苤直匿堂陵亟壁塞生堂垡迨塞( 垫! q 生2 o 9 4 5 0 秒、 5 0 。c1 分钟1 3 0 个循环4 。c 保存 7 2 1 分钟j 7 2 5 分钟 扩增产物用1 琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察扩增结果o 2 结果与分析 2 1 1 大肠杆菌基因组d n a 的提取 对e c o l iw 3 1 1 0 进行基因组d n a 提取，对提取产物进行1 的琼脂糖电泳分析，在 9 0 v 电压下，电泳4 5 分钟，表明菌液中提取细菌染色体d n a 与理论一致。结果见图2 1 。 b p h， 图2 1 大肠扦菌蔫因组 d 黼电泳图 i m i ：5o o b p d h rm a r k e r 1 j e c 0 1 w 3 1 1 馥基因 组d i n r 2 1 2 限制性内切酶s a u 3 a i 对基因组d n a 部