（免疫学专业论文）一个新的血影蛋白超家族成员（8b7）的结构与功能分析.pdf

一! 里塑塑垦型查堂堡主堂垡丝塞 中文摘要 8 8 7 c d n a ( g e n b a n k 登记号a f 0 4 3 2 9 0 ) 是本实验室克隆的。其编码蛋白质分 子中有血影蛋白重复序列，因此是血影蛋白蛋白超家族的一个新成员。我们称此蛋白 质为8 8 7 血影蛋白。生物信息学分析显示，此c d n a 的核苷酸序列与定位于核膜的 血影蛋白超家族成员e n ap f i n 、n e sp r i n 一1 、m y n e 一1 、s y n e 1 等的c d n a 的3 端 1 8 3 5 b p 核苛酸序列1 0 0 同源。它们均位于人第6 号染色体长臂2 区5 带，是同一 个基l 司通过m r n a 变位剪接产生的。e n a p t i n 、n e sp r i n 1 、m y n e 1 及s y n e 1 蛋白 质的分子中有多个核定位信号序列( n l s ) ，而8 8 7 血影蛋白分子中则缺失了这些核 定位信号序列。这样，就产生8 8 7 血影蛋白的亚细胞定位问题。我首先作了8 8 7 血 影蛋白在c o s 一7 细胞中的亚细胞定位，观察到它在核膜也有定位。我对8 8 7 血影蛋 白分子的氨基酸序列作了进步分析，见其c 一端的跨膜螺旋结构附近有与果蝇的 k i a r s i c h t 蛋白高度同源的一段氨基酸序列。这段保守的蛋白序列被称为k i a r s i c h t 样 结构域，k l s 结构域，k a s h 结构域。它与核膜定位也相关。为证明是这个结构域决定 了8 8 7 血影蛋白在核膜的定位，我构建了插入有全长8 8 7 c d n a 、切除了k i a r s i c h l 样结构域的8 8 7 c d n a 、或切除了3 端核苷酸序列但保留了k l a r s i c h t 样结构域的 8 8 7 c d n a 的重组定位载体，转入c o s - 7 细胞后观察到切除了k i a r s i c h t 样结构域后， c d n a 编码的蛋白质在核膜上无表达，而保留k i a r s i c h l 样结构域者均在核膜有表达。 这就证明了是k i a r s i c h t 样结构域决定了8 8 7 血影蛋白在核膜的表达。 血影蛋白重复序列多存在于结构蛋白中，在结构上具有蛋白质与蛋白质相互作用 的潜在位点，在功能上常作为骨架蛋白组装的结构平台。8 8 7 血影蛋自也必然与其它 蛋白质相互作用，发挥其生物学作用。我采用酵母双杂交技术寻找与8 8 7 血影蛋白 相互作用的蛋白质，得到了5 2 个阳性蛋白克隆。有待深入研究它们与8 8 7 血影蛋白 的关系。 关键词：血影蛋白重复序列，酵母双杂交技术，k i a r s i c h t 样结构域，亚细胞定位 ! 里垫翌堕型查兰堡圭堂垡丝壅 a b s t r a c t 8 8 7 c d n a ( g e n b a n kn o a f 0 4 3 2 9 0 ) w a si s o i a t e di nt h i s l a b o r a t o r 矿t h e p r o t e i ne n c o d e db yt h ec d n ac o n t a i n ss p e c tr i nr e p e a t s t h u s ，8 8 7p r o l e l ni san e w m e m b e ri nt h es p e c tr | ns u p e r f a m i l yw ec a i t8 8 7s p e c tr i n b i o i n f b m a t i ca n a l y s i s r e v e a i e dt h a tl h e8 8 7 c d n aw a sc o m p i e l e i yh o m o l o g o u st 0t h e3 18 3 5b p n u c i e o l i d es e q u e n c eo fe n a p t i n ，n e s p r i n 一1 、m y n e 一1 、s y n e 一1c d n a s t h ep r o t e i n s e n c o d e db yt h e mb e i o n gt ot h e s p e c t r i ns u p e 柏m i l 矿a t h em r n a sf o rt h e s e p r o t e i n sa r et r a n s cr i p t e db yt h es a m eg e n e1 0 c a t e da th u m a nc h l o m o s o m e6 q 2 5 v l am r n aa i l e r n a l i v es p i i c i n g a t h ee n a p t i n ，n e s p n n 一1 、m y n e 一1 、s y n e 一1i o c a l ea t n u c l e a rm e m b r a n e t h e s ep r o t e i n sc o n t a i ns e v e r a ln u c l e a ri o c a l i z a l i o ns e q u e n c e s ( n l s ) i nt h e i rm o l e c u i e s h o w e v e 8 8 7p r o t e i ni a c k st h e s en l si ni l sm o l e c u l e t h u s ，l h e 竹r s tq u e s l i o nlw a n t e dt oa d d r e s sw a sw h e r e8 8 7s p e c t r i ni o c a i i z e di n c e i l st h ei o c a | i z a t i o n o f8 8 7d r o t e i ni nc o s 一7c e w a se x a m i n e d a n di tw a s o b s e r v e dl h a lt h ep r o t e i nw a sl o c a z e da tt h en u c i e a rm e m b 阳n e i nt h ea n a i y s i so f t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo ft h e8 8 7p r o t e i n ，ak i a r s i c h t - i i k ed o m a i n ( k l s ) n e a rt h e l r a n s m e m b r a n er e g i o nw a sf o u n d t h ek l sh a sb e e nf o u n dt ob er e i a t e dt o n u c l e a re m b r a ni o c a i i z a t i o n i no r d e rt ov a r 耐i tw a st h ek l sw h i c hr e s p o n d e dt o t h en u c l e a rm e m b r a n ei o c a | z a t i o n ，t h r e er e c o m b i n a n tp i a s m i d sf o re x a m i n i n gt h e c o n t f i b u t i o n go ft h ek l st oh en u c l e a rm e m b r a n ei o c a z a 百o nw e r ec o n s t r u c t e d o n ep i a s m i dc o n t a i n e dt h ef u 8 8 7c d n a ，t h es e c o n dc o n t a i n e dt h ec d n a f r a g m e n tw i t h o u tt h ek l sd o m a i n ，a n dt h et h i r do n i yc o n t a i n e dt h ek l sd o m a i n i t w a sf o u n dt h a tt h ec o s 7c e st r a n s f e c l e dw 计ht h ef - r s to rt h et h i r dc o n s t r u c t s h o w e dg r e e nf l u o r e s c e n c eo nt h en u c i e a rm e m b r a n e b u tt h es e c o n do n ed i dn o l s h o wa n vf i u o r e s c e n c eo nt h en u c i e a rm e m b r a n e ，i n d i c a t i n gt h a ti l i st h ek l s d o m a i nw h i c hi sr e s d o n s _ b i ef o rt h en u c i e a rm e m b r a n ei o c a i i z a t i o n an u m b e ro fs t r u c t u r a lp r o t e i n sc o n t a i ns p e dr i nr e p e a t si na t h e i rm o i e c u i e s s p e c t r i nr e p e a ts t r u c t u r ei st h ep o i e n t i a is i l e sf b rp r o t e j n p r o t e i ni n t e r a c t i o n i fo f t e n 2 中国协和医科大学硕士学位论文 f u nc t i o n sa sap i a t f o r mf o ra s s e m b l eo fc ”o s k e i e t a ip r o t e i n s 1 ti ss u g g e s t e dt h a t 8 8 7 s p e c t r i nm i g h ta i s oi n t e r a c tw i t ho l h e rp r o t e i n s 1 nm yt h e s i s ，y e a s tt w oh y br i d l e c h n i q u ew a su s e dt 0 啊n dt h ep r o t e i n si n t e r a c t e dw l l h8 8 7s p e c l r i n 5 2p o s i t i v e c i o n e sw e r eo b l a i n e d w h i c hp r o t e i n si nt h e s ec i o n e sw o u i dr e a yi n t e r a c tw i t h8 8 7 s d e c l i nr e m a i n st 0b es t u d e d k e y w o r d s ：s p e c t r i nr e p e a t ，k i a r s i c h t - k ed o m a i n ，y e a s lt w oh y b r i dt e c h n o i o g y s u b c e u l a rl o c a l i z a t i o n - 3 ! 塑塑垦型查兰堡主堂堡堡奎 英文缩略词 a d e a m d b l a s t b d b s a c d n a c i d a b d e p c d m s o d n t p d t t e b e d l _ a f b s f i t c g s 丁 h i s h r p i p t g k d a l b l e u b m e m o p s a d e n i n e a m d i c i i i i n b a s i cl o c a ia l i g n m e n ts e a r c ht o o i b a s ed a i r b o v j n es e r u ma l b u m j n c o m p l e m e n l a r yd n a c u r i e 3 ，3 一d i a m i n o b e n z d i n e d i e t h y i p y r o c a r b o n a t e d 订n e t h y i s u l f o x i d e d e o x y n u c i e o t i d etr p h o s p h a t e d j t h i o t h r e i t o l e 廿1 j d ；u mb r o m j d e e t l l y i e n ed i a m i n et e l r a c e t i ca c i d f e t a | b o v i n es e r u m f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e g u t a 什i i o n es ，t r a n s f e r a s e h l s l j d i n e d e r o x i d a s ef r o mh o r s e r a d i s h i s o p r o p y i t h i o p d g a i a c t o s i d e k l o d a i f o n l u r i a b e r t a n i l e u c l n e p m e r c a p t o e t h a n o i 3 一( n m o r p h o l n o ) p r o p a n e s u i f o 几i c 4 腺嘌呤 氨苄青霉索 局部序列对准搜寻基础工具 碱基对 牛血清白蛋白 互补脱氧核糖核酸 居里 二氨基联苯胺 焦碳酸二乙酯 二甲基亚砜 脱氧三磷酸核苷酸 二硫苏糖醇 溴化乙啶 乙二胺四乙酸 胎牛血清 异硫氰酸荧光素 谷胱甘肽s - 转移酶 组氨酸 辣根过氧化物酶 异丙基硫代一b d 一半乳糖苷 千道尔顿 l b 培养基 亮氨酸 8 - 巯基乙醇 3 n 一吗啉代丙磺酸 中国协和医科大学硕士学位论文 o d p a g e p b s p c r r n a r n a s i n r p c r s d s s s c t r j s t r d x g a a c i d o p t i c a ld e 九s j t y p o y a c r y l a m j d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e p o i y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r b o n u c l e i ca c i d r i b o n u c i e a s ei n h i b l t o r r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o i y m e 阳s e c h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c v is p i f a t e s o d i u mc h i o r l d e s o d i u mc 陆r a l e b u f f e r t i h y d r o x y m e l h y i a m i n o m e t h a n e t r y p t o p h a n 5 一b r o m o 4 - c h i o r o 一3 一i n d o i y i b d - g a i a c t o s i d e 光密度 聚丙酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 聚合酶链反应 核糖核酸 核糖核酸酶抑制剂 反转录聚合酶链反应 十二烷基磺酸钠 氯化钠柠檬酸钠缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 色氨酸 5 一溴4 - 氯一3 一吲哚b d 半乳糖 苷 中国协和医科大学硕士学位论文 前言 本实验室以往克隆到一个长1 8 3 5 b p 的c d n a ，其内的8 8 1 1 7 9b p 为一个开放 阅读框( o r f ) ，编码3 6 3 个氨基酸的蛋白质分子。本实验室以8 8 7c d n a 的名称登 记于g e n b a n k ( a f 0 4 3 2 9 0 ) 。由于其编码产物的氨基酸序列中有血影蛋白重复结构 域( s p e c t r i nr e p e a to rs p e c ) ( 图1 ) ，故我们初步将其命名为8 8 7 血影蛋白。 图1 8 8 7c d n a 编码产物氨基酸序列的保守结构域分析 s p e c 为s p e c t r i n ( 血影蛋白) 的缩写 血影蛋白重复序列( s p e c t n nr e p e a t ) 最初发现于人红细胞血影蛋白( s p e c l r i n ) 分子中( s p e i c h e re ta l ，1 9 8 3 ；1 抽e ta 1 ，1 9 9 3 ) ，是蛋白结构中较为普遍的模序性重复 元件，由反向转角和卷曲螺旋结构连接的三个a 螺旋组成( 图2 ) ( s p e i c h e re ta 1 ，1 9 8 4 ； y 撕e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。该重复序列主要存在于大分子量的结构蛋白中，如d y s t r o p h n a a c l j n i n 和s d e c t r j n 等。传统上的将血影蛋白重复序列视为用于分开大分子最结构 蛋白中功能性结构域的模序性组件。凡带有该重复序列的蛋白质分子均属于血影蛋白 超家族中的成员( b r o d 矗c k a n dw i n d e r 2 0 0 2 ；d i i n o v i c e t a l ，2 0 0 2 ) 。 图2 血影蛋白霪复序列的晶体结构图 s p r 为s p e c t r t nr e p e a t 的简写 6 一一 一 ! 塑塑塑垦型查兰堡主堂堡堡壅 血影蛋白重复序列普遍存在予结构蛋白中，在结构上具有蛋白与蛋自相互作用的 潜在位点，在功能上多作为骨架蛋白组装的结构平台( d _ 洳o v i c e ta l ，2 0 0 2 ) 。真核细 胞的结构与功能依赖于纤维样细胞骨架成份的存在，如肌动蛋白( a c l i n ) 、中间纤维 ( i n t e r m e d i a t e n i a m e n t ) 和微管( m i c r o t u b u i e ) ，以及与骨架成份相互作用的蛋白质 分子的存在。微丝样蛋白通过彼此之间的相互作用以及与这些蛋白分子的相互作用， 在真核细胞中排列组织，形成多样化的细胞骨架结构，如大量簇集在一起的肌动蛋白 承力纤维( a c l i ns l r e s sf i b e r s ) 、表层的肌动蛋白网架结构( c o r t i c a ia c 帅m e s h w o r k ) 、 肌球蛋白肌小节结构( a c t o m y o s i ns a r c o m e r e s ) 、及微管的轴丝与中心粒 ( m i c r o i u b u i a ra x o n e m e sa n dc e n t n o l e s ) 绔构等( k e v i ngy o u n ga n dr a s i k o m a r y ，2 0 0 5 ) 。血影蛋白重复序列在细胞骨架的组装中多作为骨架成份中结构蛋白 相互作用的接触位点，在细胞骨架结构的形成中具有重要的作用( d j i n o v i c e ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。 细胞骨架的纤维成份是否也存在于完整的间期核内，在很长一段时间内存在有争 议。但现已明确，细胞核内确实存在着这些微丝样的蛋白，如目前发现，肌动蛋白 ( ac t n ) 是核内的重要组成成份( r a n d oa n dz h a o ，e ta 1 ，2 0 0 0 ；p e d e r s o na n da e b i 2 0 0 2 ；b e t t i n g e ra n d g i l b e n e ta 1 ，2 0 0 4 ) ；存在于内核膜下由核纤层蛋白( i a m i n ) 构 成的纤维网络结构是核骨架的主要组成部分等( h o l a s k a a n d w i l s o n e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。然 而，肌动蛋白和核纤层蛋白，以及和它们相互作用的蛋白分子在核内的真正生物学意 义还有待于进一步阐明( b e t t i n g e ra n dg i l b e r t e ta 1 ，2 0 0 4 ；z a s t m wa n d v l c e k e ta 1 ， 2 0 0 4 ) 。 近年来在细胞核内发现了一组与细胞骨架相关的蛋白分子( r e v i e w e db yk e v i n 肌dr a s h m i ，2 0 0 5 ) 。由于其分子结构中带有多个血影蛋白重复序列，故统称为核内的 血影蛋白超家族，根据该家族中蛋白分子同源性的高低，又进一步将核内的血影蛋白 超家族中同源性较高的蛋白分子划为一个蛋白家族，并命名为s y n e 蛋白家族 ( z a s t r o w v l c e ka i l dw i l s o n ，2 0 0 4 ) 。在不同蛋白分子中发现的血影蛋白重复序列均由 大约1 0 6 个氨基酸残基组成，这些保守的重复序列在结构上的一致性特点提示：这 些蛋白分子可能存在与进化相关的特殊功能。在果蝇( d r o s o p | h a ) 和雅典线虫( c e e g a 几s ) 中分别发现了一个己知与核功能相关的大分子量结构蛋白m s p 一3 0 0 和 一 生璺塑塑墨型查堂堡主兰竺堡兰 a n c 一1 ，它们与哺乳动物s y n e 蛋白家族的成员高度同源，故也将s y n e 蛋白家族称 为s y n e ，m s p 一3 0 0 ，a n c - 1 蛋白家族，以提示该家族中成员在进化上可能具有与细胞 核功能相关的功能特点( s t a 仃a n dh a t l ，2 0 0 2 ；v 0 1 k ，t ，1 9 9 2 ；r 0 s e n b e 唱e ta l ，1 9 9 6 ) 。 目前认为s y n e 蛋白家族的成员均产生于位于人类两个不同染色体的同一个基 因。该家族中成员主要包括s y n e 一1 和s y n e - 2 ( a p e le ta 1 ，2 0 0 0 ) ，n e s 州n 一1 和 n e s p n 一2 ( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) ，m y n e 一1 年口m y n e 一2 ( m i s l o we ta 1 ，2 0 0 2 a ) ，e n a p t i n ( p a d m a k u m a re ta 1 ，2 0 0 3 ) 和n u a n c e ( z h e ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。其中s y n e 一1 、n e s p r i n 一1 、 m y n e 一1 、和e n ap l i n 蛋自由位于人第6 号染色体的同一个基因所编码，而s y n e 一2 、 n e s p r i n 一2 、m y n e 一2 、和n u a n c e 蛋白则由位于人第1 4 号染色体的同一个基因所编码。 它们可能都是由一个基因通过变位剪接等机制所产生的不同异构体分子( a p e le t a 1 2 0 0 0 ；z h a n ge ta 1 ，2 0 0 l ；m i s l o we ta 1 ，2 0 0 2 a ；z h e ne ta 1 ，2 0 0 2 ；p a d m a k 眦a re ta 1 2 0 0 3 、。 图3 人多组织n o 附l e m 印记杂交，以8 8 7 c d a 预测的开放阅读框( o r f ) 为探针，显示人多种组织中8 8 7m r n a 均有表达 对8 8 7 c d n a 序列进行染色体定位和基因组结构分析发现，该c d n a 序列与 s y n e 一1 、n e sp r i n 1 、m y n e - 1 、e n a p t i n 等c d n a 序列共同定位于人类第6 号染色体的 同一个基因；对该处基因组结构的分析发现，8 8 7 c d n a 与s y n e 一1 、 n e sp r i n 一1 、 m y n e 一1 、e n ap l | n 等c d n a 均产生于该处基因不同的外显子与内含子的拼接，即变位 剪接机制。以往我们用8 8 7 c d n a 的开放阅读框( 0 r f ) 序列进行的人多组织n o m e m 一 生里堡翌墨登；：苎；兰堡主堂堡堡苎 印记杂交中显示，除1 9 k b 的8 8 7 c d n a 转录本外，在入的多种组织中均存在大小不 同的多个转录本( 图3 ) 。故我们认为8 8 7 c d n a 与s y n e 一1 、n e s 洲n 一1 、m y n e 1 、 e n a p i j n 等c d n a 可能均是由位于人类第6 号染色体的同一个基因通过变位剪接机制所 产生的不同转录本，且8 8 7 c d n a 是目前所报道的最小转录本。 e n a 叫nc d n a 是目前发现的该基因最长的转录本，对8 8 7 c d n a 进行“b l a s l n ”分 析发现( 见实验结果一栏) ：1 8 3 5 b p 的8 8 7c d n a 、s y n e 1c d n a 、n e s 州n 1c d n a 、 m y n e 一1 c d n a 等在核酸序列上均对应于e n a p 帅c d n a 序列的3 端，其编码产物在蛋白 序列及结构上均是n 一端截短形式的e n ap 1 n 蛋白。由于8 8 7 c d n a 编码产物与s y n e 蛋 白家族成员具有核酸序列上的高度同源性和蛋白结构上的一致性，故我们认为 8 8 7 c d n a 编码产物是s y n e 蛋白家族中的一个新成员。 ，嚣钢辩 醮j ! ! l i 媳 酾骥 s 鳓钢e s 舰 雌博j 一啪捌卜饼： ! 一瑚 t 翻扣科、删 一。嗣蹦脚孵嘲昏删棚 科_ i l 图4 s y n e 蛋白家族中部分成员结构示意图 静代表血影蛋白重复( s p e c t r i nr e p e a t ) 结构域 代表跨膜( t r a n s m e m b r a n e ) 结构域n l s 指核定位信号序列 k a s h 结构域为图中跨膜结构域附近( 包括跨膜区在内) 的大约由6 0 个 氨基酸残基组成的一段保守的蛋白序列 ! 璺垫塑垦型查兰! 堕主兰堡笙兰 s y n e 蛋自家族的成员普遍具有在细胞核膜定位的亚细胞分布特点，该家族成员 蛋白分子c 一端都有一个功能性的核锚定结构域一k a s h 结构域，以及在该结构域中预测 的疏水性跨膜螺旋区，已有实验证明在s y n e 蛋白家族成员的核膜定位中k a s h 结构域 和该结构域中预测的跨膜螺旋区具有功能性的作用( a p e le ta 1 ，2 0 0 0 ；z h a n ge ta 1 ， 2 0 0 1 ；m i s l o we ta 1 ，2 0 0 2 a ；z h e ne ta 1 ，2 0 0 2 ：p a d m a k u m a re t a l ，2 0 0 3 ) 。此外，在该 家族成员蛋白分子n 一端的血影蛋白重复序列中带有大量预测的核定位信号序列 ( n l s ) ，但这些序列在核膜定位中的真正作用还没有得到实验上验证。8 8 7 c d n a 编 码产物在氨基酸序列上是e n a p t i n 蛋白c 端的3 6 3 个氨基酸，故8 8 7 c d n a 编码产物具 有与s v n e 蛋白家族成员一致性的k a s h 结构域，但n 一端的两个血影蛋白重复序列中没 有预测的核定位信号序列( 图4 ) ，所以本论文首先要明确的是8 8 7 c d n a 编码产物在 细胞内的定位。其次，血影蛋白重复序列作为细胞骨架组装的结构平台，具有蛋白与 蛋白发生相互作用的潜在位点，8 8 7 c d n a 编码产物n 一端由两个血影蛋白重复序列形 成的螺旋棒状结构多存在于与细胞骨架相关的结构蛋白中，且多为蛋白与蛋白发生相 互作用的功能位点，所以本论文的第二部分工作是用酵母双杂交技术寻找与 8 8 7 c d n a 编码产物可能发生相互作用的蛋白质分子。 中国协和医科 学硕士学位论文 实验材料 1 角株 ec o 盯d 卜5 “为本实验室保存，s c e ，b 协妇es t r a na h 7 0 9 购自c i o n l e c h 。 2 质粒载体 1 ) p g b k t 7d n a b dc l o n i n gv e c t or = 真核表达载体，含g a l 4d n a 结合结构 域编码序列，用于酵母双杂交实验，购自c i o n t e c h 。 2 ) p g a d t 7 一r e c a d c o n i n g 、，色c t o r ( s m a i n e a r i 弛d i ) ；真核表达载体，含g a l 4 转录激活结构域编码序列，用于酵母双杂交实验，购自d o n t e c h 。 3 、d e g f p c lv e c 幻r ：真核表达载体，含绿色荧光蛋白编码序列，用于细施内 定位实验，本实验室保存。 4 ) d u c m tv e c l o r ：两端带有一个突出碱基丁的取链线性质粒，用于p c r 产物 的克隆和测序，购自上海生工。 5 ) p c m v m y cv e c t o r ：哺乳动物真核表达载体，含c - m y c 表位标签，用于免疫 共沉淀实验，本实验室保存。 6 1d c m u h a v e c t o n 哺乳动物真核表达载体，含h a ( h e m a 9 9 i u t i n i n ) 表位标签r 用于免疫共沉淀实验，本实验室保存。 用于免疫共沉淀实验，本实验室保存。 - l l 型里! 塑匡型奎兰堡主堂竺堡壅 实验材料 1 菌株 ec 0 d f ，5 口为本实验室保存，s c e m 汛妇es l r a l n a h 7 0 9 购自c i o n l e c h 。 菌株 基因型 用途 s c e m w s a e m a t a ，t r p l 9 0 1 ，i e u 2 3 ，112 u r a 3 5 2 h i s 3 2 0 0 ， a h 7 0 9 g a l 4 。g a l 8 0 ，l y s 2 ： g a l lu a s - g a l l t a t a h l s 3 g a l 2 u a s g a l 2 丁a t a - a d e 2 u r a 3 ：m e l lu a s m e l l t a t a i a c z m e l l e c o 打d _ h 5 盯 s u p e 4 4 i a c u l 6 9 ，h s d r l 7 ，r e c a l 。e n d a l ， g y r a 9 6 t h i - 1 。r e i a l ，n a i r 酵母双杂交 质粒的扩增和 转化 2 质粒载体 1 ) p g b k t 7d n a b dc i o n j n gv b c c o r t 真核表达载体，含g a | 4d n a 结合结构 域编码序列，用于酵母双杂交实验，购自c l o n t e c h 。 2 ) p g a d t 7 一r e c a dc i o n i n gv e c t o r ( s m a i n e a r i 恐d 1 ) ：真核表达载体，含g a l 4 转录激活结构域编码序列，用于酵母双杂交实验，购自c l o n t e c h 。 3 ) p e g f p - c 1v e c t o r ：真核表达载体，含绿色荧光蛋白编码序列，用于细胞内 定位实验，本实验室保存。 4 ) p u c m tv e c l o r ：两端带有一个突出碱基t 的双链线性质粒，用于p c r 产物 的克隆和测序，购自上海生工。 5 ) p c m v - m y cv e c l o r ：哺乳动物真核表达载体，含c m y c 表位标签，用于免疫 共沉淀实验，本实验室保存。 6 ) p c m v - h av e c l o r ：哺乳动物真核表达载体，含h a ( h e m a g g | u l i n i n ) 表位标签， 用于免疫共沉淀实验，本实验室保存。 1 i 一! 里塑塑堕型查堂堡主兰垡笙壅： 7 ) p g e m 一3 z _ 8 8 7c d n a ：本实验室构建。 所用载体的结构图： m t 诽h 堆# r 卟b 口v 吣r c - 耐y co p 呐p p t a g e a 66 a a m l w p i m i 鼬 觚 眦眦m 矗m 6 m 龇w 帅蝴t b l 罂堂鲤墅坠旦! 塑塑坠g g c 姐。矗矗矗 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - l f 口啪o 翻嘣嘲p m 时 哪洲联珏t m 峨b 口鲫t i m n i m 目p h r 图1 p g b k t 7v e c t o r 结构和多克隆位点 1 2 一 一 ! 里塑塑堕型查兰堡主堂些堡奎 s m a r t 一t e i i l i l s - h a e p 诖o p e t a g s e q u e n c e u e n c e t 7 s 呻u 们c h g 阿m 口r w m m i * a t c t t t a a ta c g a c t 9 1 5 兰= = = = 。 盯埘坠型! ! ! 理 ， c a c t a t a 6 6 g c 6 a g c g c c 8 c c a t g6 a g l a c c c a t a c 6 a cg 1 r a c c a g a 下t a c g c t 攀!燮盟!卿 c a t 舡6 6 c c a t g6 a g 6 c c a 6 t g a a t r c c a c c c a a 6 c a g t 6 g t m 从c 6 c a 6 a 6 t g g e c a t l a t g gc c c c b 3 把r m l 洲s 2 0 s n t i g g a a a a a a 醑谣话丽撕丽西蕊蕊西苔谳g g6 t eb g c a t c g 鲥a c gg 6 a t c c 2 0 9 5g 伸p j = 一。 a 丁c g a g c t c 6 a 6 盯oc a g a t g a a t c 6 孙g a t a c t g a a a a a c c c c 6 c a a g 丌c a c t t c 十而而函而蔬鬲蒹磊磊蕊孑 2 1 5 2 图2 p g a d t 7 - r e cv e c l o r 结构和多克隆位点 1 3 中国协和医科大学硕士学位论文 后加0 ，0 9 l 5 岫 旦! 1 7 t 直c 8 i 篮酊c m e i 受u i 让5 7 7 】 图3 ，p e g f p c 1v e c l o r 结构和多克隆位点 ，窭 “弓嚣等“虹等黯 盎i a n m 喜 图4 p u c m tv e c l o r 结构和多克隆位点 i 4 中国协和医科大学硕士学位论文 嘲椰神 蝴 a c e 巫g ! 丛坠遗垒丛垡! i 塑i 丛i 丛受h h t q a 图5 p c m v - h av e c f o r 结构和多克隆位点 4 n w 眩r 锄 啪a 鲫 8 ca c c 堑坠! 坠丛i 鲢丛璺壅! 坠丛堑量! 堡c t 千 咖 蛳蝴9 目5 n 世丛瞬掣。警麝6 譬嚣醣帮浮黯群焉严 图6 p c m v m y cv e c l o r 结构和多克隆位点 1 5 ! 里堡塑垦型查堂堡圭堂堡鎏苎 3 引物 1 ) 定位实验引物( 连接于p e g f p c 1v e c l o r ) ( e c o ri b a m hi ) ( 1 ) 5 d 4 全长引物 f l u p p e r ：5 gg a 芦汀t cca t ga a g c a ga a c c t cc a g a a g3 f l - d o w n ：5 c g 鱼鱼璺盥t c ag a g t g g a g g a g gg c 3 。 ( 2 ) c 端缺失k a s h 结构域引物 l a c k k a s h ：5 c gg g a t c cc c tg c t a t gt g g a c tg c3 ( 3 ) n 端缺失s r 结构域引物 l a c k s r ：5 gg a a l t ccg a cg t gt c aa g t a g t c a g3 2 ) r t _ p c r 引物( 根据5 d 4c d n a 序列) u p p e r ：5 a t g a a gc a g a a cc t cc a g a a g t g g c a g c3 l 0 w e r ：5 t c gt g ta t ct g a g c a t g g g g tg g aa 1 ga c3 3 ) 酵母双杂交引物( 连接于p g b k t 7v 9 c l o r ) ( e c o ri b a m hi ) ( 1 ) 5 d 4 全长引物 f l - u p p e r ：5 g 垦i 垒垒g j 6 汀ga a gc a g a a cc t cc a g a a g 3 。 f i d o w n ：5 c gg g a t c ct c a g a g t g ga g ga g gg c3 1 ( 2 ) 5 d 4 膜内段引物 i n m ：5 c g 鱼鱼垒工q qt c gg a g g a ct c tg a ac a3 1 f 以上引物由上海博亚生物技术有限公司合成下划线部分为添加的酶切位点) ( 3 ) l d p c rd sc d n a 扩增引物 5 p c rp r i m e r 5 。一t t c c a c c c a a g c a g t g g l 。芦汀c a a c g c a g a g t g g 一3 3 p c rpr i m e r 5 。g 1 碍r c g a r g c c c a c c c t c l _ a g a g g c c g a g g c g g c c g a c a 一3 1 ( 4 ) g a l 4a d 插入筛选扩增引物 1 6 - ! 里塑塑堕型查堂婴主堂堡垒壅 a d5 p r i m e r ： 5 l c r _ a t t c g a 丁g a t g a a g a - r a c c c c a c c a 氐a c c c 一3 a d3 p r i m e r ： 5 l g t g a a c t t g c g g g g l _ 几一r t c a g w 盯c 1 _ a c g a t 一3 ( l d - p c rd sc d n a 扩增引物及g a l 4a d 插入筛选扩增引物购自c l o n t e c h 公司) 4 ) 免疫共沉淀引物 ( 1 ) p c r 产物连接于p u c m - tv e c l o r u p p e rp r i m e r sf o rl a m i na ，c ：5 a t g g a g a c c c c g t c c c a g c g3 l o w e rp r i m e r sf o ri a m i na ，c ：5 t 1 - a c a l _ g a l - g c t g c a g t t c t g g g g g3 u p p e rp r j m e r sf o re m e n n ： 5 a t g g a c a a c t a c g c a g a t c t t t c g g3 l o w e rp r i m e r sf o re m e r l n ：5 c 1 a g a a g g g g t t g c c t t c t t c a g c3 ( 2 ) l a m i na ，c 连接于p c m u m y cv e c i o r ( e c o ri & x h oi ) u p p e r ： 5 gg a 芦j t cc ga t gg a ga c cc c gt c cc a g3 l o w e r ：5 1 c c gc t c g a