（作物遗传育种专业论文）甘薯茎线虫病抗性的分子标记及相关基因片段的克隆.pdf

摘要 本研究以高抗甘薯茎线虫病品种徐7 8 1 和高感茎线虫病品种徐薯1 8 的杂交f 】代分离群体为 材料，对甘薯抗茎线虫基因进行分子标记研究。通过遗传分析推测甘薯茎线虫病抗性受单基因控 制。采用b s a ( b u l ks e g r e g a n ta n a l y s i s ) 法和s r a p ( s e q u e n c e - r e l a t e da m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s m ) 技 术对甘薯抗茎线虫病基因进行分子标记研究，用抗感基因池共筛选了2 0 0 对s r a p ；l 物，得到能 在抗感基因池之间扩增出多态性带的引物组合7 7 对。选取其中的6 2 对引物用分离群体进行鉴定， 共获得4 个与抗病基因连锁的分子标记，其中引物组合a d 3 4 找到3 个标记，分别命名为n s p l 、 n s p 2 和n s p 3 ，与抗茎线虫基因的遗传距离分别为4 7 1 c m 、4 7 1 c m 和6 3 2 c m ：引物组台a 3 8 6 找到了1 个标记，命名为n s p 4 ，与抗茎线虫基因的遗传距离为9 1 3 c m 。 甘薯新品系农大6 0 3 是从感茎线虫病品种徐薯1 8 的辐照后代中获得的一个抗茎线虫病的突 变体。根据已报道的植物线虫抗性基因的核苷酸结合位点( n b s ) 保守氨基酸序列设计兼并引物， 用r g a p ( r e s i s t a n c eg e n ea n a l o gp o l y m o r p h i s m s ) 技术及自行改进的s s a p ( m o d i f i e d s e q u e n c e s p e c i f i ca m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s m s ) 方法，对农大6 0 3 和徐薯1 8 的基因组进行p c r 扩 增，从农大6 0 3 中扩增出含有植物抗病基因n b s 保守序列的差异片段4 个( 片段5 8 、片段5 4 、 片段7 2 和片段7 7 ) 。在g e n b a n k 上序列搜索和比对发现，克隆序列与已报道的植物抗病基因之 间同源性较低。根据克隆片段的d n a 序列设计引物，以抗、感茎线虫病的甘薯品种的基因组d n a 为模板进行p c r 扩增，结果显示由片段5 8 、片段7 2 和片段7 7 设计的引物在抗、感品种上没有 扩增出多态性带；由片段5 4 设计的引物在抗痛品种和感病品种之闻扩增出多态性带，认为片段 5 4 可能是与甘薯抗茎线虫病有关的r g a 。 根据片段5 4 的序列设计特异 f 物如。，同时根据其它植物线虫抗性基因的b i b s 保守氨基酸 序列设计1 个兼并引物p 2 ，对农大6 0 3 和徐薯1 8 的块根m r n a 进行r t - p c r 扩增，获得一个大 小4 8 3 b p 基因片段，该基因在农大6 0 3 上的表达量明显高于徐薯1 8 。同源性比较发现，该基因片 段与其它植物肌醇1 磷酸台成酶( m y oi n o s i t o l - 1 - p h o s p h a t es y n t h a s e ，m i p s ) 基因有较高的同源性。 采用3 r a c e 技术扩增出目的基因的3 末端e d n a 。根据植物m i p s 基因5 端保守的氨基酸序列 设计兼并引物，并与3 端的特异引物组合，扩增出该基因的5 端c d n a 序列。所克隆的基因的 e d n a 全长为1 8 5 6 b p 。同源性比较表明，目的基因与其它植物m i p s 基因的同源性较高，如与大 豆、番茄的m i p s 基因d n a 序列同源性分别为8 3 6 3 和8 3 8 9 ；氨基酸序列同源性分别为9 2 1 6 和9 0 + 5 9 ，因此认为所克隆的基因是甘薯m i p s 基因，并推测该基因可能与甘薯抗茎线虫病有 关。甘薯肌醇1 磷酸合成酶基因全长c d n a 的克隆，有利于进一步研究该基因与甘薯对茎线虫病 抗性的关系。 关键词：甘薯，茎线虫痫，分子标记，r g a ，基因克隆 a b s t r a c t w i t haf 1 s e g r e g a t i o np o p u l a t i o no b t a i n e df r o mt h ec r o s sb e t w e e nx u7 8 1h i g h l yr e s i s t a n tt o s w e e t p o t a t os t e mn e m a t o d e ( s s n ) a n dx u s h u1 8h 诎l ys u s c e p t i b l et os s n ，m o l e c u l a rm a r k e r sl i n k e d t os s nr e s i s t a n c eg e n e sw e r ed e v e l o p e d b yu s i n gb s a ( b u l ks e g r e g a n ta n a l y s i s ) a n ds r a p ( s e q u e n c e r e l a t e da m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s m ) t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ei n h e r i t a n c eo ft h e r e s i s t a n c et os s nw a sc o n t r o l l e db yas i n g l eg e n e t h es c r e e n i n go f2 0 0s r a pp r i m e rp a i r sa g a i n s t r e s i s t a n ta n ds u s c e p t i b l eb u l k sr e s u l t e di nt h ei d e n t i f i c a t i o no f7 7p a i r so fp r i m e r sw h i c ha m p l i f i e d p o l y m o r p h i cb a n d sb e t w e e nr e s i s t a n ta n ds u s c e p t i n l ep o o l s o f7 7p a i r so fp r i m e r s 6 2w e mt e s t e dw i t h f 1p o p u l a t i o na n d4m a r k e r sl i n k e dt os s nr e s i s t a n c eg e n e sw e r ei d e n t i f i e d t h r e em a r k e r s ，n a m e da s n s p l ，n s p 2a n dn s p 3 ，r e s p e c t i v e l y , w e r eo b t a i n e dw i t ht h ep r i m e rp a i ra 9 8 4 ，w h o s eg e n e t i cd i s t a n c et o s s nr e s i s t a n c eg e n e sw e r e4 7 1 c m ，4 7 1 c ma n d6 3 2 c m ，r e s p e c t i v e l y o n em a r k e r , n a m e da sn s p 4 ，w a s o b t a i n e d w i t ht h ep r i m e rp a i r a 3 8 6 , w h o s eg e n e t i cd i s t a n c et os s nr e s i s t a n c eg e n ew a s8 7 3c m am u t a n t ，n o n g d a6 0 3 ，r e s i s t a n tt os s nw a so b t a i n e df r o mt h eg a m m a - i r r a d i a t e dp r o g e n i e so f s w e e t p o t a t oc v x n s h u1 8s u s c e p t i b l ei os s n d e g e n e r a t ep r i m e r sw e r ed e s i g n e df r o mt h ec o n s e r v e d n b s ( n u c l e o t i d e - b i n d i n gs i t e ) m o t i f so fp l a n tn e m a t o d er e s i s t a n c eg e n e si s o l a t e df r o mo t h e rc r o p s r g a p ( r e s i s t a n c eg e n ea n a l o gp o l y m o r p h i s m s ) a n dm s s a p ( m o d i f i e ds e q u e n c e s p e c i f i ca m p l i f i c a t i o n p o l y m o r p h i s m s ) w e r eu s e di nt h ep c ro fa m p l i f y i n gt h eg e n o m i cd n a o fn o n g d a6 0 3a n dx u s h u1 8 f o u rf r a g m e n t s ( f r a g m e n t s5 8 ，5 4 ，7 2a n d7 7 ) w i t hn b sc o n s e r v e dd o m a i no fp l a n tr e s i s t a n c eg e n e s w e r ea m p l i f i e df r o mn o n g d a6 0 3 ，n o tf r o mx u s h u1 8 d n aa n dp e p t i d e - s e q u a n c es i m i l a r i t ya n d h o m o l o g yb e t w e e nt h es e q u e n c eo ff r a g m e n t sc l o n e da n dt h er e s i s t a n c eg e n e sr e p o r t e di no t h e rc r o p s w e r ed e t e r m i n e db yb l a s ta n a l y s e st h r o u g hg e n b a n k t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e s ef o u rs e q u e n c e s h a dl o wh o m o l o g yt op l a n tr e s i s t a n c eg e n e sr e p o r t e d p r i m e r sd e s i g n e df r o mt h es e q u e n c e so ft h ef o u r f r a g m e n t sc l o n e dw e r eu s e di np c ra m p l i f i c a t i o nw i t ht h et e m p l a t e so ft h eg e n o m i cd n a o fr e s i s t a n t a n ds u s c e p t i b l es w e e t p o t a t oc u l t i v a r s p o l y m o r p h i cb a n d sw e r eo b t a i n e db yt h ep c rw i t ht h ep r i m e r s f o rf r a g m e n t5 4 ，w h i l en op o l y m o r p h i cb a n dw a sa m p l i f i e db yt h ep r i m e r sf o rf r a g m e n t5 8 ，f r a g m e n t 7 2 a n df r a g m e n t7 7 t h u s ，i ti st h o u g h tt h a tf r a g m e n t5 4m i g h tb ear g a r e l a t i v et os s nr e s i s t a n c e t h em r n a so fs t o r a g er o o t so fn o n g d a6 0 3a n dx u s h u1 8w e r eu s e da sm a t e r i a l s b yu s i n ga d e g e n e r a t ep r i m e rp 2d e s i g n e df r o mt h en b sc o n s e r v e da m i n o - a c i ds e q u e n c eo fp l a n tn e m a t o d e r e s i s t a n c eg e n e sa n das p e c i f i cp r i m e rp 5 4d e s i g n e df r o mt h es e q u e n c eo ff r a g m e n t5 4 ，r t - p c ra n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tac d n af r a g m e n t ( 4 8 3 b p ) w a sa m p l i f i e da n dt h em r n aa m o u n to ft h eg e n ew a sh i g h e r i nn o n g d a6 0 3t h a ni nx u s h u1 8 t h eb l a s ta n a l y s i si ng e n b a n ks h o w e dt h a tt h es e q u e n c eo ft h e f r a g m e n tc l o n e dh a dh i g hh o m o l o g yw i t hm i p sg e n e so fo t h e rp l a n t s t h e3 e d n ao ft h ea i m e dg e n e w a sa m p l i f i e du s i n g3 r a c ea n dt h e5 c d n ao ft h ea i m e dg e n ew a sa m p l i f i e db yp c ru s i n gt h e s p e c i f i cp r i m e r so f3 e d n aa n dt h ed e g e n e r a t ep r i m e td e s i g n e db a s e do nt h ec o n s e r v e da m i n o a c i d s e q u e n c eo ft h e5 e n do fp l a n tm i p sg e n e s t h ef u l l - l e t i g t hc d n a o ft h ec l o n e dg e n ew a s1 9 5 6 b p t h e d n aa n da m i n o a c i ds e q u e n c ea l i g n m e n ts h o w e dt h a tt h eg e n ec l o n e dh a dh i 曲h o m o l o g yw i t hm i p s g e n e so fo t h e rp l a n t s t h ei d e n t i f i e so fd n as e q u e n c e sb e t w e e nt h eg e n ec l o n e da n dm i p sg e n e so f s o y b e a n t o m a t ow e r e8 3 6 3 a n d8 3 8 9 r e s p e c t i j e l y ；t h ei d e n t i t i e so fa m i n o a c i db e t w e e nt h eg e n e c l o n e da n dm i p sg e n e so fs c y b e a r d t o m a t ow e r e9 2 1 6 a n d9 0 5 9 r e s p e c t i v e l y s oi tw a ss u g g e s t e d t h a tt h ec l o n e dg e n ew a sm i p sg e n eo fs w e c t p o t a t oa n dt h eg e n ew a sr e l a t e dt os t e mn e m a t o d e r e s i s t a n c e t h ec l o n i n go fs w e e t p o t a t om i p sg e n ei su s e f u lf o rt h ef u r t h e rr e s e a r c ho ft h er e l a t i o n s h i p b e t w e e ns w e e t p o t a t om 1 p sg e n ea n ds w e e t p o t a t os l e mn e m a t o d er e s i s t a n c e k e yw o r d s ：s w e e t p o t a t o ，s t e mn e m a t o d e ，m o l e c u l a rm a r k e r , r g a , c l o n i n go fg e n e 1 1 i 本论文由 国家杰出青年科学基金( 3 0 2 2 5 0 2 8 ) 国家“8 6 3 ”( 2 0 0 4 a a 2 4 1 1 8 0 ) 教育部教学科研奖励计划 联合资助 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：例舷j 参 时间：加r 年占月，7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 孝厂屯4 l 导师签名： 时间：m r 年月j 7 日 时间：彬年6 月j 阳 第一章文献综述 1 1 分子标记的种类及其在植物遗传育种中的应用 1 1 1 分子标记的种类 广义的分子标记是指可遗传的并可检测的d n a 或蛋白质。狭义的分子标记只是指d n a 分子 标记。分子标记按所用的技术分为两大类，即以分子杂交为基础和以p c r 技术为基础的分子标 记。 1 1 1 1 基于分子杂交技术的分子标记技术 1 1 1 1 1 限制性片段长度多态l 生( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) r f l p 的基本原理是将不同生物个体的基因组d n a 经限制性内切酶酶切后得到的d n a 片段 转移到支持膜上，与经过标记的单拷贝或低拷贝d n a 探针杂交，获得反映个体特异性的r y l p 图谱( w y m a n 等，1 9 8 0 ) 。它是种共显性的分子标记，但d n a 多态性的探针制备较为困难， 实验操作较繁琐且成本费用高。 1 1 1 i 2 单核苷酸多态性( s i n g l en u e l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) s n p 是指基因组d n a 中某一特定核苷酸位置上发生变化引起的多态性，比微卫星标记密度 高( h a l u s h k a 等，1 9 9 9 ) 。s n p s 一般只有2 个等位基因和3 种基因型，又称为双等位基因标记， 它包括基因编码区的功能性突变及随机分布于基因组的大量单碱基变异。s n p s 可通过如下途径 进行检测：( 1 ) 从现有数据库中筛选d n a 序列获取( m a r t h 等，1 9 9 9 ) ；( 2 ) 根据s n p s 可以改 变d n a 分子构像的特点，通过电泳或色谱技术来检测( n i c k e r s o n 等，2 0 0 0 ) ；( 3 ) 通过对样本 d n a 直接测序检测s n p s ( b o n d 等，1 9 9 8 ) ；( 4 ) 毗d n a 分子标记技术，如r f l p ，r a i d 等， 也可以检验到s n p s ；( 5 ) 近几年发展起来的基因芯片技术在s n p s 检测中的应用极大地提高了操 作的自动化程度及效率。s n p 的优点是：( 1 ) 数量多，覆盖密度大；( 2 ) 由于s n p s 一般只有2 个等位基因，在检测时只要通过一个简单的“+ ，”方式即可进行基因分型：( 3 ) 遗传稳定性强；( 4 ) 多态性丰富。 1 1 1 2 基于pcr 技术的分子标记技术 1 1 1 2 1 模板需要酶切处理的标记技术 1 1 1 2 1 1 酶切扩增多态性序列( c l e a v e d a m p l i f i e d p o l y m o l p h i s m s e q u e n c e s ，c a p s ) c a p s 是p c r 和r f l p 技术结合的一种方法。c a p s 的基本原理是利用已知位点的d n a 序 列资源( 基因数据库、基因组或e d n a 克隆等) 设计一套特异性的p c r 引物( 1 9 2 7 b p ) ，然后 用这些引物扩增该位点的某一d n a 片段，用一种专一性的限制性内切酶切害所得扩增产物，凝 胶电泳分离酶切片段。c a p s 标记揭示的是特异p c r 片段的限制性长度变异的信息。c a p s 是一 类共显性分子标记其优点是避免了r f l p 分析中膜转印这一步骤，又能保持r f l p 分析的精确 度。另外，由于很多限制性内切酶可与扩增d n a 酶切，所以检测到多态性机会较大。 1 1 1 2 1 2 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) a f l p 由z a b e a u 等发明，并于1 9 9 3 年获得欧洲专利局专利，专利权归属荷兰k e y g e n e 公司。 其原理是将基因组d n a 用限制性内切酶双酶解后，将双链人工接头连接到酶切片段的两端，用 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 带有选择性碱基的引物进行选择性扩增，产生不连续的d n a 产物，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳来检测d n a 序列的多态性( v o s 等，1 9 9 5 ) 。a f l p 具有可靠性和灵敏性的特点，且多态性丰 富而分辨率高，是一种十分理想的、有效的分子标记。缺点是该分析试剂盒价格昂贵且对d n a 的纯度和内切酶的质量要求较高。选择性扩增引物的3 ”端还延伸出1 - - 3 个数量不等的随机核苷 酸碱基，通过选用不同数量碱基调节a f l p 产物的条带特异性和数量，从而提供较多基因组多态 性信息。由于a f l p 是显性标记，因此a f l p 也可转为s c a r 标记。 1 1 1 2 1 3 选择性扩增微卫星多态性位点( s e l e c t i v e l ya m p l i f i e dm i c r o s a t e l l i t ep o l y m o r p h i cl o c i ， s a m p l ) 为了提高a f l p 共显性标记的比例，人们又发明了其它技术例如微卫星a f l p 或者称为选择扩增 的微卫星多态d n a ( s a m p l ) ( w i t s e n b o e r 等，1 9 9 7 ) 。此技术与a f l p 相似，使用的模板是a f l p 预扩增的产物。但在第二次扩增中使用一个与a f l p 不同的引物，即s a m p l 引物。s a m p l 引 物是根据植物中复合微卫星序列而设计的。引物含有混台微卫星序列( 含有两个短小重复序列) ， 每个重复序列有两个核苷酸组成，整个引物跃度为1 8 2 0 个核营酸，并用放射性同位素标记。 放射性标记的s a m p l 引物与复合微卫星的连接区域序列互补，因此可以在不知道微卫星侧翼序 列的情况下，扩增模板d n a 中微卫星位点，扩增的片段是从s a m p l 引物到a f l p 引物之间的 片段，此片段中含有微卫星序列。由于s a m p l 技术可以扩增微卫星位点，从而增加了共显性标 记的比例。 1 1 1 2 1 4 序列特异扩增多态性( s e p u e n c es p e c i f i c a m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s m s ，s - s a p ) 根据a f l p 改进而来( w a u g h 等，1 9 9 7 ) ，首先对基因组进行酶切，在选择性扩增时，除接头引 物外，另- - 7 1 物是根据反转录转座子的l t r 末端保守序列而设计，扩增多态性来源于限制性位点 及其两侧序列的变异、l t r 5 味端变异和反转录转座子插入位点的变异。为了检测含l t r 末端保 守序列的特异扩增片段，将l t r 引物用放射性标记或其它标记。对基因组酶切有的是双酶切，有 的是单酶切，s s a p 主要用在遗传多样性研究和遗传作图上( w a u g h 等，1 9 9 7 ；n a g y 等，2 0 0 3 ) 。 b e r e n y i 等( 2 0 0 2 ) 利用蹄j c o p i a 反转录转座子s s a p 对甘薯品种进行遗传分析，发现s s a p 揭 示的多态性高于a f l p 和r a p d 。 1 1 1 2 2 模板不需要酶切处理的分子标记技术 1 1 1 2 2 1 随机扩增多态性d n a 限a n d o m a m p l f f i e dp o l y m o r p h i s m d n a ，r a p d ) r a i d 技术是以随机引物( 般1 0 b p ) 通过p c r 反应非定点扩增d n a 片段，凝胶电泳分离 扩增片段，经染色来显示扩增d n a 片段的多态性( w i l l i a m s 等，1 9 9 0 ) 。r a p d 技术简单、检测 速度快，不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析，并且检测成 本较低等优点。但r a p d 也存在些缺点：( 1 ) r a p d 标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯 台子；( 2 ) j 字在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度d n a 片段，而不能分开那些长度相同但 碱基序列组成不同的d n a 片段；( 3 ) r a p d 技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。 可以将r a p d 标记转化为s c a r 标记，来提高实验的稳定性和重复性。 i i 1 2 2 2 序列标签位点( s e q u e n c et a g g e ds i t e ，s t s ) s t s 是以特异引物序列进行p c r 扩增的一类分子标记的统称。s t s 由己知紧密连锁的r f l p 标记转化而来( o l s o n 等，1 9 8 9 ) ，通过设计特异性引物，使其与基因组d n a 序列中特定结台位 点结合，扩增基因组中特定区域，分析其多态性，任何单拷贝的多态性标记都可转变为s t s 。s t s 2 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 标记最大优点是一种共显性的遗传标记，产生信息非常可靠，从而提供较多基因组多态性信息。 但此标记的开发建立在测序的基础上，费用昂贵，但一旦开发，同行受益。 1 1 1 2 2 3 简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) s s r 又称微卫星d n a 。微卫星d n a 串联重复的核心序列为l 6 b p ，其中最常见的是双核 苷酸重复，即( c a ) n 和f i g ) ，其高度多态性主要来源于串联数目的不同，在群体中多态性高，是 一类很好的分子标记( m c c o u c h 等，1 9 9 7 ) 。s s r 标记的基本原理是：微卫星d n a 两端的序列 一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计一对特异引物，通过p c r 反应扩增微卫星片段来揭 示微卫星d n a 的多态性。s s r 具有以下一些优点：( 1 ) 一般检测到的是一个单一的多等位基因位 点；( 2 ) 微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；( 3 ) 所需d n a 量少。采用s s r 技术分析 微卫星d n a 多态性时必须知道重复序列两端的d n a 序列的信息，如不能直接从d n a 数据库查 寻，则首先必须对其进行测序( 熊立忠等，1 9 9 8 ) 。 1 1 1 2 2 4 简单重复间序列( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) i s s r 由z i e t k i e w i c z 等于1 9 9 4 年创建，其原理就是在s s r 的3 端或5 端加锚1 4 个嘌呤或 嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列s s r 的一段d n a 序列进行扩增，根据电泳谱 带的有无及相对位置来分析样品问的多态性。优点是引物设计比s s r 技术简单，可以揭示较多的 多态性，且稳定性好。缺点是此标记为显性标记，不能对基因组提供完整的信息。 1 1 1 2 2 5 序列特征扩增( s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n s ，s c a r s ) p a r a n 与m i c h e l m o r e ( 1 9 9 1 ) 在r a p d 的基础上发展出s c a r s 。将r a p d 引物扩增的片段 末端测序后，在原来1 0 b p 引物上增加合成上述末端序列的约1 4 b p ，构成s c a r 标记，以这2 4 b p 的引物对基因组再进行扩增分析，这样就可将与原r a p d 片段相对应的单一位点鉴别出来。s c a r 比其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中应用更大，因为具有更高重复性。s c a r 标记是 共显性遗传的，待检d n a 间的差异可赢接通过有无扩增产物来显示。主要缺点是如果仅仅是由 于引物结合位点处某个或一些核苷酸的错配而导致某些r a i d 带的多态性，而这些多态性的带除 在引物结台位点外其余部分序列没有差异，那么选择这些带进行s c a r 分析时，可能得到没有差 异的结果。 1 1 1 2 26d n a 单链构象多态性( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 等长的单链d n a 因核苷酸序列的差异而产生拘象变异，在非变性聚丙烯酰胺中表现为电泳 迁移率的差别。单链d n a 构象分析对d n a 序列的改变非常敏感，常常一个碱基差别都能显示出 来。在s s c p 分析中，利用p c r 技术定点扩增基因组d n a 中某一目的片段，将扩增产物进行变 性处理，双链d n a 分开成单链，再用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化来判 断目的片段中是否存在突变。s s c p 结果判定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位置改变， 从而显示出不同生物个体的d n a 特异性，达到指纹分析目的。s s c p 的主要优点是简单，该技术 主要不足是可能漏检一些突变。 i i 1 2 2 7 反转录转座子插入位点间多态性( i n t c r _ r e o i r a n s p o s o n a m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ，i r a p ) i r a p 由k a l e n d a r 等( 1 9 9 9 ) 发明，其原理是根据反转录转座子的l t r 包含的保守序列而设 计引物，通过p c r 扩增出相邻的同一家族的反转录转座子成员间的片段。也可根据反转录酶基 因的保守序列设计引物进行扩增。 3 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 1 1 1 2 2 8s r a p ( s e q u e n c er e l a t e da m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s m ) s r a p 是一种新的分子标记技术( u 等，2 0 0 1 ) 。针对基因外显子里g c 含量丰富而启动子和 内含子里a t 含量丰富的特点来设计引物进行扩增。因不同个体的内含子和启动子与间隔区长度 不等而产生多态性。其原理是利剐独特的引物设计对o f r ( 开放阅读框架) 进行扩增。上游引物 长1 7 b p ，5 端的前1 0 b p 是一段填充序列，紧接着是c c g g ，它们组成核心序列及3 端3 个选择 碱基，对外显子进行特异扩增。下游引物长1 8 b p ，5 端的前1 1 b p 是一段填充序列，紧接着是a a t t ， 它们组成核心序列及3 端3 个选择碱基，对内含子区域或启动子区域进行特异扩增。与其它分子 标记技术相比，s r a p 具有简便、稳定、高共显性，在基因组中分布均匀的特点。r a p d 方法简 单、成本低但重复性差、检测位点不多；s s r 多为共显性、重复性好，但位点少，引物开发成 本高；a f l p 谱带多，但程序复杂、成本高，而且用甲基化敏感的限制性内切酶时由于基因组d n a 的甲基化可导致“假多态性”。s r a p 技术既克服以上标记技术的缺点，是一个简便、高效的标记 系统，它适用于在不同作物上用于各种目的的研究，如遗传多样性研究( f e r r i o l 等，2 0 0 3 ) 、图 谱构建( 林忠旭等，2 0 0 3 ) 、基因标记与定位( 潘俊松等，2 0 0 5 ) 等。 f e 币o l 等( 2 0 0 3 ) 对甜瓜的2 个变种6 9 份类型代表性材料的遗传多样性进行s r a p 、a f l p 标记与形态学分析，结果表明，与形态变异及类型的进化历史一致性方面，s r a p 标记提供的信 息比a f l p 优良：1 1 个s r a p 引物组合获得8 8 条可重复的条带，其中6 4 条为多态性条带，大小 在1 5 4 6 5 3 之间；测序发现多个标记序列与已知的e s t 高度同源。林忠旭等( 2 0 0 4 ) 对陆地棉、 海岛棉品种产生的f 2 群体多样性进行s r a p 分析，另外还对1 1 份陆地棉材料的遗传多样性进行 s r a p 分析，结果显示了较高多态性标记比率，表明s r a p 是一个评价遗传多样性的有效工具。 林忠旭等( 2 0 0 3 ) 用s r a p 标记构建棉花分子遗传连锁图，作图群体为邯郸2 0 8 和p i m a 9 0 杂交产生的1 2 9 个f 2 群体，筛选了多态性较好的7 6 个引物组合进行群体检测，共得到2 8 5 条多 态性带，平均每个引物组合产生3 7 5 个多态性带，最多的产生1 3 条；对2 8 5 个标记用 m a pk e r e x p 3 0 构建连锁群，2 3 7 个标记进入到3 9 个连锁群中( l o d 3 o ) ，总长3 0 3 0 7 c m ， 在整个连锁群中，标记分布均匀，没有聚焦现象。 潘俊松等( 2 0 0 5 ) 利用s r a p 标记构建了黄瓜的遗传连锁图，并将始花节位的基因定位在第 连锁群上。以黄瓜自交系s 0 6 与$ 5 2 杂交产生的f 2 群体为材料，选用了6 4 个多态性s r a p 引 物组合，共得到1 0 8 条多态性条带。在f 2 群体中对这些多态性位点进行连锁分析，将7 7 个标记 进入9 个连锁群中，同时将始花节位的基因刀h ( f i r s i f i o w e rn o d e ) 定位在第连锁群上，与两侧 标记d c l e m 5 和m e 7 e m 2 a 的距离分别为1 0 3 和1 2 1 c m 。 1 1 1 2 2 9 靶位区域扩增多态性( t a r g e tr e g i o na m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m , t r a p ) t r a p 是一种新型的基于p c r 标记，由美国农业部北方作物科学实验：室l - i n 与v i c k 于2 0 0 3 年提 出的。t r a p 技术与s r a p 、r a i d 和a f l p 等标记技术无须任何序列信息即可直接p c r 扩增不同， 是基于已知的c d n a 或e s t , q * 列信息。目前已获得许多物种基因组序列的丰富信息，包括人类、 拟南芥，水稻和多种微生物，有大量的e s t p j * y 1 可供使用，从而使得可以利用生物信息学工具和 e s t 数据库信息产生出许多靶基因序列的t r a p 多态性标记，而且极易将性状与标记联系起来。 t r a p 技术是从s r a p 技术改进而来的。s r a p 使用两个任意引物，而t r a p 是使用长度为 1 6 2 0 核苷酸的固定引物( f i x e dp r i m e r ) 与任意引物( a r b i t r a r yp r i m e 0 ，固定日l 物以公用数据库中的 靶e s t 序列设计而来。任意引物与s r a p 所用的一样，为一段以富含a t 或g c 为核心、可与内 4 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 含子或外显子区配对的随机序列。固定引物的设计步骤为：从e s t 数据库中鉴别所需序列，再 采用有关引物设计软仆设定核苷酸序列合理长度( 1 8 碱基) 与最适、最大和最小t m 值( 5 3 、5 5 、 5 0 ) ，最后选定最适的引物。任意引物设计完全同s r a p 技术。t r a p p c r 反应条件与s r a p p c r 完全一致。每次t r a p p c r 反应在5 聚丙烯酰胺测序胶上可产生3 0 - - 5 0 条带。 理想韵分子标记必须达到以下几个方面的要求：( 1 ) 具有高度的多态性：( 2 ) 共显性遗传， 即利用分子标记可以鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；( 3 ) 能明确辨别等位基因；( 4 ) 除特殊位 点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；( 5 ) 选择中性，即无基因多效性；( 6 ) 检测 手段简单、快速和实验程序易于自动化；( 7 ) 开发成本和使用成本尽量低廉；( 8 ) 在实验室内和 实验空间重复性好，便于数据交换。但就目前常用的分子标记技术来看与理想的分子标记还有一 定的差距。这些标记只符合其中的部分特点，因此采用哪类分子标记应依据实验目的、实验材料、 实验条件决定。 1 1 2d n a 分子标记在植物遗传育种中的应用 1 1 2 1 构建分子标记连锁图谱 连锁遗传图谱既是遗传研究的重要内容，又是植物遗传资源的收集、保存、育种、定位和克 隆目的基因等许多应用研究的理论依据和基础。过去借助形态标记、生化标记和细胞学标记构建 连锁图，由于标记数量较少，图谱的密度小，使其研究和应用受到限制。随着分子生物学技术的 发展和模式生物基因组序列的不断揭示，新的分子标记技术不断开发和完善，遗传图谱上标记的 密度也越来越高。构建植物遗传连锁图谱的群体包括f 2 代群体、回交群体、回交自交系群体、重 组自交系群体、单粒传系群体、加倍单倍体群体、近等基因系群体。目前构建遗传连锁图谱主要 应用f 2 代群体、重组自交系群体和加倍单倍体群体。构建遗传连锁图谱的方法有三点测交法、两 点测交法、两点白交法和三点自交法。 我国己构建了3 0 多种植物的分子标记连锁图谱( 阮成江等，2 0 0 2 ) ，涉及的作物有水稻( u 等，2 0 0 0 ；徐建龙等，2 0 0 1 ) 、小麦( 贾继增等，1 9 9 8 ) 、玉米( 曹永国等，1 9 9 9 ) 、陆地棉( 左 开井等，2 0 0 0 ) 、