（农业昆虫与害虫防治专业论文）中华稻蝗有效物质综合提取研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 一躲秆鬻友 签字日期：2 缈7 年f 月尹日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解选豳壅些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授 权可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印， 缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用 本授权书) 学位论文储躲研 导师签名。阁易杓 营久 签字日期：2 矿7 年彳月f - b签字日期：么矿年6 月 签字b 期- j - 矿少7 年f 月i t - 7 - 。日 签字矿少年月 日 沈阳农业大学硕士学何论文 摘要 中华稻蝗是一种分布广、数量大、营养价值高的资源昆虫，含有优质的脂肪、蛋白 质和壳聚糖等宝贵资源。本文主要围绕中华稻蝗的深加工，详细研究了综合利用中华稻 蝗资源提取脂肪、蛋白质和壳聚糖等物质的生产工艺条件，为中华稻蝗的深加工和综合 利用提供一条可参考的途径。 首先，以丙酮和石油醚的混合液为提取液，对中华稻蝗脂肪进行抽提。结果表明， 中华稻蝗脂肪最佳提取工艺条件为：液固比为2 5 4 m l g 、溶剂混比为1 1 ( 丙酮石油醚) 、 提取时间为8h 、水浴温度为8 5 c 。在此条件下，脂肪得率为5 8 7 5 ，碘值为1 1 6 ，人 体必需脂肪酸含量为4 1 7 4 1 0g k g 。 其次，利用碱溶酸沉原理，对中华稻蝗脱脂虫粕进行蛋白质提取工艺研究，确定了 蛋白质最佳提取工艺条件为：n a o h 溶液浓度为0 2 0m o l l 、浸提温度4 5 c 、液固比为 2 5m l g 、浸提时问为1 2h 。该条件下，蛋白质得率为4 6 1 0 。 再次，以脱脂脱蛋白的中华稻蝗虫粕为原料，进行脱盐制备甲壳素，研究甲壳素的 制备工艺，获得的最佳工艺条件为：h c i 溶液浓度为0 8m o l l 、反应温度为6 0 、反 应时间为2 4h 。在此条件下几丁质的失重率平均为4 5 3 0 。 最后，利用微波法，对自制的中华稻蝗几丁质迸行脱乙酰化反应，制备壳聚糖，筛 选出的最佳工艺条件为：n a o h 溶液浓度为4 5 、反应时间为7 m i n 、液固比为1 8 m l g 。 在此条件下，中华稻蝗壳聚糖得率平均为7 1 2 0 ，脱乙酰度平均为8 6 4 0 。 关键词：中华稻蝗，脂肪，蛋白质，甲壳素，壳聚糖，提取工艺 a b s t r a c t a b s t r a c t o x y ac h i n e n s i st h u n b e r gi sak i n do fr e s o u r c ei n s e c t ，w h i c hi sd i s t r i b u t i n gw i d e l y , g r e a t a m o u n ta n d h i g hn u t r i t i o u sv a l u e ，h a v i n gg o o dq u a l i t yf a t ，p r o t e i na n dc h i t o s a nr e s o u r c e s t h e e x t r a c t i o no fo x y ac h i n e n s i st h u n b e r gf a ta n dp r o t e i n ，a n dp r e p a r a t i o no fc h i t i na n dc h i t o s a n f r o mo x y ac h i n e n s i st h u n b e r ga r es t u d yi nt h i sp a p e r f i r s t l y , t h ef a to fo x y ac h i n e n s i at h u n b e r gi se x t r a c t e db yt h es o l v e n tw h i c hi st h e m i x t u r eo fa c e t o n ea n de t h a n 0 1 t h ed a t eo b t a i ns h o wt h a tt h eo p t i mc o n d i t i o no f e x t r a c t i n g f a tf r o mo x y ac h i n e n s i at h u n b e r gi s ：r a t i oo fl i q u i d s o l i di s2 5 4m l g ，r a t i oo fa c e t o n e e t h a n o li s1 1 ，t h e ne x t r a c t8h o u r sa t8 5 i nt h i sc o n d i t i o n t h eo b t a i nr a t eo ft h ef a ti s 5 8 7 5 ，t h ei o d i n ev a l u eo ft h ef a ti s11 6 ，n e c e s s a r yf a t t ya c i dc o n t e n to ft h ef a ti s4 1 7 4 1 0 g m g s e c o n d l y , t h ep r o t e i no fo x y ac h i n e n s i at h u n b e r gi se x t r a c tw i t hn a o hs o l u t i o n a n di s d e p o s i t e db yh c is o l u t i o n t h eo p t i u mc o n d i t i o no fe x t r a c t i n gp r o t e i nf r o mo x y ac h i n e n s i a t h u n b e r gi s ：n a o hs o l u t i o ni s0 2 0m o l l ，r a t i oo f l i q u i d s o l i di s2 5m l g ，e x t r a c ta t4 5 c f o r 1 2h ，i nt h i sc o n d i t i o n ，t h eo b t a i nr a t eo f p r o t e i ni s4 6 1 0 t h i r d l y , t h ec h i t i no fo x y ac h i n e n s i at h u n b e r gi se x t r a c tf r o mt h ed t a f f , b yg e t t i n gr i do f s a l t s s t u d y i n go nr e a c t i o nc o n d i t i o n so fc h i t i ne x t r a c t i o n ，f o u n dt h eo p t i u mc o n d i t i o no f e x t r a c t i n gc h i t i nf r o mo x y ac h i n e n s i at h u n b e r gi s ：w i t ho 8 0m o l lh c la t6 0 。cf o r2 4h i n t h i sc o n d i t i o n ，t h er a t i oo f d e s a l tf r o mc h i t i ni s4 5 3 0 l a s t l y , c h i t o s a ni sp r e p a r e df r o mc h i t i nb yd e a e e t y l a t i o n i nt h i sp a p e r , m a k i n gu s eo f m i c r o w a v e ，t h ec h i t o s a ni sp r e p a r e df r o mo x y ac h i n e n s i at h u n b e r gc h i t i n t h eo p t i u m c o n d i t i o no fc h i t o s a np r e p a r a t i o ni sf i l t r a t e d ，w h i t hi s ：a tr a t i oo fl i q u i d s o l i di s18m l g ，w i t h 4 5 n a o ht r e a t ef o r7m i n i ta c h i e v e dah i 【g hd e g r e eo fc h i t i nd e a c e t y l a t i o nf o rab e t t e r p r e p a r a t i o no fc h i t o s a n i n t h i sc o n d i t i o n ，t h e y i e l do fc h i t o s a ni s7 1 2 0 ，a n d t h e d e a c e t y l a t e dd e g r e eo f c h i t o s a ni s8 6 4 0 k e y w o r d ：o x y ac h i n e n s i at h u n b e r g ，f a t ，p r o t e i n ，c h i t i n ，c h i t o s a n ，e x t r a c t i o nc o n d i t i o n 2 沈阳农业大学硕士学位论文 刖罱 中华稻蝗( o x y a c h i n e n s i s t h u n b e r g ) 为直翅目，蝗总科，斑腿蝗科，稻蝗属，广泛 分布于我国及东南亚各水稻产区，在辽宁全省均有分布，数量很大，是一种重要的农业 害虫( 仵均祥，2 0 0 2 ) ，但将其作为一种资源昆虫加以开发利用，不仅有利于中华稻蝗 的综合防治，并且可为人类提供丰富的、高质量的动物蛋白等资源，也能够使人们从另 一个角度来认识农业昆虫，可以说是一种变害为利的好途径。 1 中华稻蝗的营养价值 中华稻蝗是一种高蛋白的动物蛋白源，富含人体必需的8 种氨基酸、多种维生素及 矿物质等微量元素，属优质的保健功能食品( 葛春华，1 9 9 5 ) 。据乔太生等( 1 9 9 2 ) 对 中华稻蝗营养成分的初步分析，中华稻蝗粗蛋白占总干物质的7 3 4 ，氨基酸齐全，必 需氨基酸含量占总氨基酸含量的4 7 7 3 ，蛋白质品质好，与鸡蛋蛋白质相似，并含有丰 富的维生素、微量元素等，营养成分较全面。 中华稻蝗脂肪中饱和脂肪酸含量相对较少，约占总量的1 7 ，其组成主要是软脂酸。 不饱和的脂肪酸以油酸、亚油酸及亚麻酸为其主要成分，约占脂肪酸总量的8 3 ，而且 富含脂溶性维生素a 和维生素e 。多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值( p s ) 为3 3 9 “4 6 ， 比大多数动物油脂的p s 都高( 赵云涛，2 0 0 2 ) 。 中华稻蝗体壁中含有一定量甲壳素，是一类品质极高的壳聚糖资源。甲壳素在医学、 药学制剂学、化工、食品、环保等方面具有广泛的用途。目前，尚未见到有关中华稻蝗 甲壳素开发利用的报道( 赵云涛，2 0 0 3 ) 。 2 中华稻蝗资源的开发利用 2 1 中华稻蝗脂肪的开发 中华稻蝗油脂中脂肪酸组成更接近鱼油，可作为天然的优质营养调和食用油，具有 很高的开发价值( 彭伟正，2 0 0 3 ) 。中华稻蝗脂肪中不饱和脂肪酸最显著的特点是亚麻 酸含量高，约占总脂肪酸的5 8 。亚麻酸是人体自身不能合成的必需脂肪酸，对人体机 能具有重要的生理功能，因此中华稻蝗脂肪在保健食品和药品方面极具开发前景。 提取昆虫脂肪多是采用溶剂萃取法( 吴时敏，2 0 0 i ) ，此外，还有超临界流体萃取 法( 高晓旭，2 0 0 5 ) ，但是超临界流体萃取法受到高压、安全等条件的限制( 倪培德， 2 0 0 3 ) 。溶剂萃取法多使用单一溶剂来提取脂肪，脂肪得率不高，为此生产上开始应用 前言 混合溶剂来提取动植物脂肪，脂肪得率和品质都有所提高，所以中华稻蝗脂肪提取可以 采用混合溶剂法。 2 2 中华稻蝗蛋白质的开发利用 中华稻蝗蛋白质含量高，必需氨基酸含量丰富，氨基酸组成合理，可以作为蛋白质 营养源，直接添加到食品中，也可以制取水解蛋白和氨基酸，经过去苦味处理( p e d e r s e n b ，1 9 9 4 ；m a s a h i r ot a m u r a ，1 9 9 0 ；m u r r yt k ，1 9 5 2 ) ，应用于食品、化妆品、医药 等行业( s v e nf r i k j a e r ，1 9 9 4 ；王光慈，2 0 0 1 ) 。因此，中华稻蝗蛋白质可能成为具有 较高药用食用价值的动物源蛋白质。 对中华稻蝗蛋白质的开发利用，首先在于对其蛋白质的有效分离。目前对昆虫蛋白 质的提取分离已有很多报道。主要的方法有碱溶酸沉法和盐溶酸沉法等。碱溶酸沉法具 有灰分低，含量高的优点，但易使蛋白质变性，破坏氨基酸，影响品质。据李广宏( 1 9 9 6 ) 报道，提取蝇蛆蛋白，盐溶酸沉法优于碱溶酸沉法，该法与碱溶法比较，不仅提高了产 量和效率，而且由于抽提液p h 值近于中性，使蛋白质易保持天然状态，从而提高了蛋白 质的品质，但是，从成虫体壁中提取蛋白质，盐溶法的作用效果不好，原因是碱溶液对蛋 白质与甲壳素的结合具有较强的破坏性，能够使蛋白质与甲壳素分离，从而溶解到水溶 液中。 2 3 中华稻蝗甲壳素壳聚糖的开发利用 甲壳素是中华稻蝗体内宝贵的天然生物资源，主要分布于中华稻蝗的外表皮，中华 稻蝗甲壳素可用来开发高附加值的甲壳素衍生物。现已证明利用甲壳素开发的壳聚糖具 有降低胆固醇、强化免疫、抑菌防腐、降血压等许多功能( 刘高强，2 0 0 2 ) ，可应用于 食品( 刘高强，2 0 0 4 ) 、药品( 钟振兵，2 0 0 5 ) 等行业。 目前甲壳素和壳聚糖生产原料主要是虾、蟹壳。由于虾、蟹壳资源利用率极低，污 染较大，而且原料受季节和地域限制，原料收集保存困难，前处理麻烦，且对设备要求 严格( 范娟，2 0 0 2 ) ，因此开发利用其它甲壳素资源( 如微生物和昆虫) 具有较大的经 济效益和社会价值，许多学者在这方面进行了大量的研究工作，己经成功提取出蚕蛹甲 壳素( 王金华，2 0 0 3 ) 、蝇蛆甲壳素( 彭仁，2 0 0 4 ) 、黄粉虫甲壳素( 刘怀如，2 0 0 3 ) 等多种昆虫源甲壳素。 甲壳素的生产主要采用稀酸稀碱处理法，生产过程中产生的废水污染严重、蛋白质 4 沈同| 农业_ 人学硕十学位论文 资源浪费较大。为此，我国在2 0 世纪8 0 年代初就提出采用综合利用法制各甲壳素及壳聚 糖，加强对蛋白质、钙质等物质的回收利用。这样不仅提高了利用率，而且降低了原料 成本。目前，该方法已在蚕蛹、蝇蛆、黄粉虫等工厂化昆虫上得以采用。这都为综合开 发利用中华稻蝗资源奠定了理论和技术基础。 3 国内外研究开发现状 昆虫是生物界中最大群体，其生物量超过其它所有动物生物量总和的l o 倍以上，是 迄今地球上尚未被充分利用的最大生物资源( c h e l ax i a o m i n g ，2 0 0 2 ) 。自古代起，昆 虫就成为了人类的滋补品，昆虫能提供给人类具有高生物学价值的营养元素 ( r a m o s e l o r d u yb j ，1 9 9 7 ) 。在老挝、缅甸等国家，人们大多有食虫的习俗，那里大 约有1 6 4 种可食用的昆虫( y h o u n g a r e ej ，2 0 0 5 ) 。在日本，人们将蝗虫制成罐头食品 出售( m i t s u h a s h ij ，2 0 0 5 ) 。在非洲，有2 5 0 种可食用昆虫，它们是当地人重要食物源 ( h u i s a ，2 0 0 3 ) 。 由于农业技术的发展，昆虫的人工养殖已成为资源昆虫产业发展的趋势，并可以作 为一项可持续农业进行发展( r a m o s e l o r d u y j 1 9 9 7 ) 。d e f o l i a r tg r ( 2 0 0 5 ) 建议将更 多农业害虫转变为食用昆虫，并大力发展食用昆虫的人工养殖，使其形成工厂化。 随着科学技术的进步，营养分析已成为资源昆虫利用的一种有效方式，墨西哥的 j u l i e t a r a m o s e 博士，分析了1 0 0 种民间食用昆虫，其中以直翅目蝗科的成虫蛋白质含量 最高( 文礼章，1 9 9 8 ) 。c e r d ah ( 2 0 0 1 ) 测定了美洲棕榈象幼虫的营养成分。a m a d ie n 等( 2 0 0 5 ) 对菜棕黄蛾幼虫进行了营养分析。当被分析的昆虫不断增多，昆虫有效物质 的提取技术也发展起来，g r a h a ml a u r i e ，a 等( 2 0 0 5 ) 成功提取了雪蛾防冻蛋白等。 我国昆虫资源利用和产业化按其技术特点可划分为四个层次，第一个层次是养虫 业。第二个层次是生物农药产业，第三个层次是昆虫资源的综合利用，形成的相关产业 包括昆虫信息素、激素生产以及昆虫保健食品、药品开发产业。第四个层次就是目前正 在兴起与昆虫资源相关的基因工程。目前，昆虫资源开发重点正由第一、第二层次转向 第三、第四层次( 张传溪，2 0 0 0 ；2 0 0 1 ) 。一直以来，蝗虫资源主要是作为高蛋白替代 型饲料或活体饵料应用到养禽业、畜牧业、渔业和蛙业( 何忠，1 9 9 1 ；孟涛，2 0 0 2 ：何 小风，2 0 0 2 ) 。 近年来，蝗虫资源的开发利用越来越受到人们的关注，并取得了一定研究进展( 庞 凌云，2 0 0 4 ) 。科技工作者们分析了东亚飞蝗( 林玉真，2 0 0 0 ) 、短额负蝗( 韩凤英， 前言 2 0 0 2 ) 、中华蚱蜢( 庞凌云，2 0 0 4 ) 等多种蝗虫的营养成分。赵云涛( 2 0 0 2 ) 分析了各 龄期中华稻蝗的营养成分。国兴明等( 2 0 0 2 ) 对中华稻蝗水解蛋白和氨基酸营养液方面 进行了研究，李俐等( 2 0 0 1 ) 研究了中华稻蝗蛋白质的酶解工艺。 4 本文研究内容及意义 本试验以中华稻蝗为研究对象，逐次从中华稻蝗成虫虫体中提取及制备脂肪、蛋白 质、甲壳素和壳聚糖等有效物质，探索中华稻蝗资源的综合开发利用方法。同时利用单 因素试验与正交试验相结合的试验方法，筛选优化上述四种物质的提取及制备工艺条 件，并组合成为一套中华稻蝗综合利用方案。其中，中华稻蝗甲壳素和壳聚糖的制备研 究，填补了有关中华稻蜱甲壳素壳聚糖研究的空白，而中华稻蝗有效物质综合提取研究， 更属国内首例。 本研究旨在为中华稻蝗资源的开发利用提供可行途径，并为其它资源昆虫的综合开 发提供可借鉴的方法。 6 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章中华稻蝗脂肪提取研究 l 材料与方法 1 1 实验材料 1 1 1 供试虫源 中华稻蝗成虫，十月份采集于沈阳市东陵区汪家镇水稻田。 1 1 2 实验试剂 丙酮，石油醚( 6 0 , - 9 0 ) ，溴化碘，碘化钾，硫代硫酸钠，可溶性淀粉，四氯化碳 ( 以上药品及试剂皆为分析纯) 。 1 1 3 实验仪器 电子恒温水浴锅上海科析试验仪器厂 电热鼓风干燥箱南京市上江电器仪器厂 高速万能粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司 j a 2 0 0 3 电子天平上海悦丰仪器仪表有限公司 岛滓gc 16a 气相色谱仪日本岛津公司 索氏提取器及蒸馏烧瓶沈阳华侨玻化有限公司 碱式滴定管( 5 0m 1 ) ，碘量瓶( 2 5 0m 1 )沈阳华侨玻化有限公司 1 2 实验方法 1 2 1 样品制备 将从稻田地采集回来的活体中华稻蝗成虫饥饿处理2 4h 后，速冻致死，洗净，在 6 0 。c 电热鼓风干燥箱中烘干，然后用高速万能粉碎机粉碎，冷藏备用。 1 2 2 溶剂筛选 提取脂肪常用溶剂有石油醚、丙酮、无水乙醚、无水乙醇、环己烷、异丙醇等( 苏 壮，2 0 0 1 ) ，其中无水乙醚极易挥发，存在安全隐患( 俞建瑛，2 0 0 5 ) ，而无水乙醇、环 己烷、异丙醇在9 5 以上才能大量蒸发，不易用于索氏提取法。所以，只有丙酮和石油 醚适合本试验。 本试验采用混合溶剂，即以石油醚与丙酮不同比例的混合液作为脂肪提取液，对中 华稻蝗的脂肪进行抽提试验。 1 2 3 脂肪提取方法 7 第一章中华稻蝗脂肪提取研究 本试验采用索氏提取法( 卢艳花，2 0 0 5 ) 提取中华稻蝗脂肪。 1 2 4 单因素试验 1 2 4 1 测定溶剂混比对中华稻蝗脂肪提取的影响 分别称取1 0g 中华稻蝗虫粉，用脱脂滤纸包好，放入索氏提取器的抽提管中，在液 固比为2 5 2n 1 1 g ，水浴温度为8 0 。c ，抽提4h 的条件下，设定有机溶剂混比( 丙酮石 油醚) 为0 1 0 、1 9 、1 4 、3 7 、2 3 、1 1 、3 2 的不同混合液及1 0 0 丙酮等8 种处理， 采用索氏提取法进行试验，每个处理重复3 次，绘制脂肪得率曲线图，比较脂肪得率。 脂肪得率( ) = 抽提出的脂肪重量( g ) 处理前虫粉重量( g ) 1 0 0 1 2 4 2 测定抽提时间对中华稻蝗脂肪提取的影响 分别称取1 0g 中华稻蝗虫粉，用脱脂滤纸包好，放入索氏提取器的抽提管中，在溶 剂混比( 丙酮石油醚) 为1 4 ，液固比为2 5 2m l g ，水浴温度为8 0 c 的条件下，设定l h 、2h 、4h 、6h 、8h 、1 0 h 、t 2h 、1 4h 等8 个不同提取时间，采用索氏提取法进行 试验，每个处理重复3 次，绘制脂肪得率曲线图，比较脂肪得率。 1 2 5 正交试验 在单因素试验的基础上，按照l 1 6 ( 4 5 ) 正交表( 宋代军，2 0 0 1 ) 进行正交试验，对溶 剂混比、抽提时间、液固比和水浴温度四个影响因素进行中华稻蝗脂肪抽提工艺条件的 优化。正交试验各因素水平见表l 。1 。 裹1 1 因素水平表 t a b l e1 1t h el e v e l so f t h ef a c t o r 1 2 6 脂肪碘值的测定 碘值的测定方法( 朱俭，1 9 8 1 ) ：准确称取0 3g 中华稻蝗脂肪，置于两个2 5 0m l 碘瓶中，加入i om l 四氯化碳，使脂肪溶解。加入2 5m l 溴化碘溶液，塞好瓶塞，在2 0 3 0 。c 暗处放置3 0 分钟，并不时轻轻摇动。放置3 0 分钟后，用新配制的1 0 碘化钾1 01 1 1 l 8 沈r 农业大学硕士学位论文 和蒸馏水5 0m l 将瓶塞和瓶颈上的液体冲洗入瓶中，混匀。用o 1m o l l 硫代硫酸钠溶液 迅速滴定至浅黄色，加入1 淀粉溶液1m l ，继续滴定至蓝色消失为止，即达到滴定终 点。另作2 份空白对照，除不加脂肪样品外，操作同上。 碘值计算公式：碘值= ( a b ) t 1 0 0 c 式中：a ：滴定空白用去的硫代硫酸钠溶液的平均毫升数； b ：滴定碘化后样品用去的硫代硫酸钠溶液的平均毫升数； c ：脂肪样品的克数； t ：o 1m o l l 硫代硫酸钠溶液相当的碘的克数。 1 2 7 脂肪中脂肪酸含量的测定 本实验利用气相色谱仪测定中华稻蝗脂肪中脂肪酸的含量，测定方法( 鲍士旦， 1 9 9 6 ) 如下： 精确称取中华稻蝗脂肪lg ，置于1 0 m l 试管中，加入0 5m o l l 氢氧化钾甲醇溶液2 m 1 ，通入氮气，在6 0 水浴中皂化约2 0m i n ，待油珠溶解后放冷，加入1 5 - 三氟化硼乙 醚溶液2m l ，通入氮气，于6 0 c 水浴中酯化约1 0m i n ，放冷，精确加入2m l 正己烷，振 荡，加入饱和氯化钠2 “振荡后静置3 0m i n ，分层后取上层液作色谱实验用。 色谱条件为日本岛津g c 1 6 a 气相色谱仪，固定相为5 d e g s ，担体为c h r o m o s o r b w a wd m c s8 0 1 0 0 目，载体为氮气，流速1 2 0m l m i n ，检测器f i d ，柱温1 9 0 ，检测 器温度2 4 0 c ，汽化至2 3 0 ，进样量0 5u l 。 2 结果与分析 2 1 单因素试验结果分析 2 1 1 有机溶剂混比对脂肪提取的影响 从图1 中可以看出，在溶剂混比( 丙酮石油醚) 1 4 至1 l 之间，脂肪得率较高， 脂肪得率为5 2 5 3 5 6 1 1 ，并且高于单纯用丙酮提取的得率5 1 2 6 ：单纯以石油醚作 溶剂的脂肪得率最低，只有4 0 7 4 。证明将两种有机溶剂按照一定比例混合，来提取 脂肪，不但可以缩短提取时间，而且可以提高脂肪得率。提取中华稻蝗脂肪的有机溶剂 混比( 丙酮石油醚) 以1 伟v 1 l 之间较为合适。 9 第一章中华稻蝗脂肪提取研究 毒 糌 建 蟹 磐 0 1 01 9t 42 3 l i t3 2 1 0 0 丙酮 石油醚与丙酮混比 圈1 1 溶剂混比对膳肪得翠的影响 f i g 1 i t h e i n f l u e n c eo f t h er a t i oo f a c e t o n e e t h a n o l t o t h e y i e l do f f a t 2 1 2 抽提时间对脂肪提取的影响 从图2 中可以看出，在1 8h 范围内，随着提取时间的延长，中华稻蝗脂肪的得率 明显提高，但超过8h 之后，脂肪得率的提高幅度甚微，所以，从节约能源和时间的角 度考虑，适宜的提取时间为8h 。 术 v 褂 啦 拯 u 12 4 6 31 01 21 4 提取时间( h ) 图1 2 提取时间对脂肪得率的影响 f i g 1 2t h ei n f l u e n c eo f t h et i m eo f e x t r a c t i o nt ot h ey i e l do f f a t 2 2 正交试验结果分析 根据正交设计表1 1 ，共进行1 6 组试验，2 次重复，试验数据及其计算分析结果如下 1 0 7 6 5 4 3 2 鲨婴查些查堂堡堂垡堡塞 衰i 2 正交试验结果 一! ! ! ! ! ：! ! ! ! 竺竺! ! ! ! 竺! ! ! ! 竺塑! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 型竺! 竺塑! ! 兰! 试验号 溶剂混比 提取时阃液固比水搭温度脂肪得率( ) a ( v ，v ) b ( h ) c ( m l g )d ( ) 重复i重复 瓦 4 7 8 5 1 3 5 ，4 5 5 6 9 5 0 8 5 5 0 5 ，4 5 5 1 2 4 ，8 3 5 6 4 5 3 0 5 5 0 5 4 9 j 2 1 5 4 7 5 3 4 5 1 4 5 4 4 5 2 2 5 7 9 4 4 2 5 4 0 5 5 5 5 1 9 4 8 0 5 ，l i 5 3 6 5 4 8 5 4 5 5 0 6 5 6 8 5 3 2 9 9 2 1 0 5 7 1 0 6 7 1 14 8 9 5 0 1 0 9 1 1 0 1 03 l 9 6 3 lo 7 5 1 0 6 6 1 0 9 8 j 0 9 4 1 0 2 7 1 1 1 5 1 0 6 6 五 4 2 “ 3 9 9 94 2 1 44 2 1 7 疋 4 1 7 l4 2 4 9 4 2 24 2 4 8 是 4 2 0 24 3 4 84 0 8 8 4 1 5 8 l 4 3 0 2 4 3 4 3“1 74 3 1 6 局5 3 3 “0 5 2 75 2 7 为 5 2 l 5 3 15 2 85 3 l 局 5 2 55 4 45 1 l 5 2 0 】05 3 85 4 35 5 25 4 0 置o1 6 3 8n 4 3 6 30 4 1 1 3o 1 9 7 5 注：五：每组试验2 次重复结果之和；t ( r l ，五、乃、n ) 各因素在不同水平下8 个试验结果之和；r ：撮值 1 2 3 4 3 4 2 4 3 2 ， 2 ， 4 3 l 2 3 4 2 l 4 3 3 4 i 2 4 3 2 l l 2 3 4 i 2 3 4 l 2 3 4 2 3 4 i l ， 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 2 3 4 5 6 7 8 9 m “ 挖 n h b 惦 第一章中华稻蝗脂肪提取研究 如表1 2 中极差分析结果所示，各因素的极值大小关系是：r b 尺c r d 震a 。表明： 中华稻蝗脂肪得率受提取时间和液固比的水平变化影响较大，而丙酮与石油醚体积比和 水浴温度的水平变化对脂肪得率影响不大。由此可知，影响脂肪得率各因素的主次顺序 为：提取时间 液固比 水浴温度 丙酮与石油醚体积比。 表1 3 正交试验方差分析襄 t a b l e1 1 3t h e a n a l y s i so f v a r i a t i o no f t h er e s u l to f t h es q u a r er e g r e s s i v eo r t h o g o n a le x a m i n a t i o n 注：临界值f 0o i ( 3 t1 9 ) = 50 1 、f o ( 3 ，1 9 ) - - 35 2 从表1 3 中的脂肪得率方差分析结果可知，提取时间和液固比对脂肪提取的影响是 极显著的，而丙酮与石油醚体积比和水浴温度为非显著因素。这说明提取时间和液固比 是影响中华稻蝗脂肪提取的主要因素。 主 糌 珐 餐 磐 图1 3 正交试验置观分析围 f i g i 3 t h e a u d i o v i s u a la n a l y s i so f t h er e s u l t o f t h es q u a r er e g r e s s i v e o r t h o g o n a le x a m i n a t i o n 从直观分析图1 3 中可以看出，中华稻蝗脂肪得率最高的提取条件为a 4 8 3 c 4 d 4 ， 即丙酮与石油醚体积比1 4 、提取时间6h 、液固比2 5 4m l g 、水浴温度8 5 。c 。 按照从正交试验结果表中选出脂肪得率最高的组合条件a 1 8 4 c 4 d 4 ，与所筛选的工 艺条件a 4 8 3 c 4 d 4 ，分别对中华稻蝗进行脂肪提取试验，3 次重复，进行正交试验的验 1 2 6 5 4 3 2 l 5 9 8 7 5 5 5 5 5 5 4 4 4 沈阳农业大学硕士学位论文 证试验。结果表明：组合a 1 8 4 c 4 d 4 的平均脂肪得率为5 8 7 5 ，高于组合a 4 8 3 c 4 d 4 的平均脂肪得率5 4 8 8 ，所以最佳工艺条件为a 1 8 4 c 4 d 4 ，即丙酮与石油醚体积比1 l 、 提取时间8 h 、液固比2 5 4 m l g 、水浴温度8 5 。 2 3 脂肪酸含量及碘值的测定 对中华稻蝗脂肪碘值钡4 定结果表明：其碘值为1 1 6 。该碘值与鲸鱼油的碘值 ( 1 1 0 - 1 3 5 ) 接近，高于猪油、羊油和牛油等动物油，而且高于食用植物油，如菜籽油 ( 9 7 1 0 8 ) ( 毕艳兰，2 0 0 5 ) 。 利用气相色谱仪测得脂肪中主要脂肪酸的含量如表1 4 所示： 囊1 4 中华稻徨粗脂肪中主要脂肪酸含量 t a b l e l 4 t h ec o n t e n t o f h t t ya c i d s i n h e f a to f n 删曲加删睹t h u n b e r g 由表1 4 可知，中华稻蝗脂肪中不饱和脂肪酸含量较多，其中单不饱和脂肪酸一油酸 ( c 1 8 ：1 ) 为1 5 5 5 1 0g k g ；多不饱和脂肪酸- 亚油酸( c 1 8 ：2 ) 和亚麻酸( c 1 8 ：3 ) 的含 量分别为1 3 8 6 4 0g k g 、2 7 8 7 7 0g k g ；而作为饱和脂肪酸的棕榈酸( c 1 6 ：0 ) 和硬脂酸 ( c 1 8 ：0 ) 的含量分别为5 2 1 3 0g k g 、7 9 8 6 0g k g 。 3 结论与讨论 3 1 利用混合溶剂( 丙酮+ 石油醚) 提取中华稻蝗脂肪，其脂肪得率高于单用丙酮或石 油醚作为溶剂的脂肪得率，而且能够缩短提取时间。在影响中华稻蝗脂肪提取的四个因 素中，提取时间和液固比对脂肪得率的影响最为显著，是主要因素。因此，根据具体情 况，适当延长提取时间或加大提取液体积，是可以提高脂肪得率的。 3 2 利用正交试验对中华稻蝗脂肪提取条件进行筛选得知：最佳工艺条件为液固比2 5 4 、 溶剂混比1 1 、提取时间8h 、水浴温度8 5 。在该条件下脂肪得率为5 8 7 5 。 3 3 中华稻蝗脂肪的碘值为1 1 6 ，远远高于人类日常食用的猪油( 4 0 7 0 ) 、羊油( 3 2 5 0 ) 和牛油( 3 1 4 6 5 ) ( 倪培德，2 0 0 3 ) ，可见中华稻蝗脂肪是高碘值的动物脂肪；该脂肪中 不饱和脂肪酸含量很高，其中人体必需脂肪酸( 亚油酸和亚麻酸) 的含量为4 1 7 4 1 0g m g ， 因此，中华稻蝗是富含人体必需脂肪酸的动物营养源。 第二章中华稻蝗蛋白质提取研究 第二章中华稻蝗蛋白质提取研究 1 材料与方法 1 1 实验材料 1 1 1 供试虫源 中华稻蝗成虫，十月份采集于沈阳市东陵区汪家镇水稻田。 1 1 , 2 实验试剂 盐酸( a r ) ，氢氧化钠( a r ) 1 1 3 实验仪器 电热鼓风干燥箱南京市上江电器仪器厂 高速万能粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司 j a 2 0 0 3 电子天平上海悦丰仪器仪表有限公司 h z q f 1 6 0 全温数显摇床 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 离心机金坛市实验仪器厂 酸度计上海精密仪器仪表有限公司 1 2 实验方法 1 2 1 样品制备 将脱脂后的中华稻蝗虫粕放在电热鼓风干燥箱内，6 0 。c 下烘干，除去脱脂虫粕上残 留的有机溶剂，作为提取蛋白质的原料。 1 2 2 蛋白质提取方法 本试验采用碱溶酸沉法( 张寒俊，2 0 0 5 ) 提取中华稻蝗蛋白质。即用稀碱将蛋白质 从原料中溶解到水溶液中，再用稀酸调节p h 值到蛋白质的等电点，使蛋白质从水溶液 中沉淀出来。 1 2 3 中华稻蝗蛋白质等电点的测定 本试验利用等电点沉淀法( 陈来同，2 0 0 3 ) ，测定中华稻蝗蛋白质的等电点。 称取3 0g 中华稻蝗脱脂虫粕，加0 2 0m o l l 的n a o h 溶液3 0 0m l ，提取温度为3 0 ，提取9 h 后，每3h 换一次提取液。用8 层纱布过滤提取液，量取等量滤液8 份， 每份3 0m l ，用o 1 0m o l l 的h c i 标准溶液将各等份滤液调成p h 为3 6 、3 8 、4 1 、4 4 、 4 6 、4 8 、5 1 、5 4 ，调酸后，沉淀2h ，离心1 5r a i n ，4 0 0 0r m i n ，弃去上清夜，6 0 c 烘 1 4 沈阳农业大学硕士学位论文 千，恒重后记录蛋白质质量( g ) ，重复3 次，蛋白质沉淀量最大为等电点。结果见图2 1 。 p h 值 图2 1 番白质等电点的测定 f i g 2 1 t h e d e t e r m i n i n go f i s o e l e c t r i cp o i n to f p r o t e i n 1 2 4 单因素试验 1 2 4 1 测定碱浓度对中华稻蝗蛋白质提取的影响 分别称取5g 中华稻蝗脱脂虫粕，在液固比为1 5m 1 倌，提取温度为3 0 。c ，提取时 间为9h 的条件下，设计n a o h 溶液浓度为o 0 5m o l l 、0 1 0m o l l 、0 1 5m o i l 、0 2 0m o l l 、 0 2 5m o l l 等5 种处理，每提取3h 换一次提取液，用o 1 0m o l l 的h c i 标准溶液将提 取液的p h 值调到4 4 ，沉淀2h 后，离心速度4 0 0 0r m i n ，1 5m i n ，最后得到蛋白质产 品，6 0 下烘干至恒重，称重。求出蛋白质得率，绘制蛋白质得率曲线图，比较蛋白质 得率。 1 2 4 2 测定液固比对中华稻蝗蛋白质提取的影响 分别称取5g 中华稻蝗脱脂虫粕，在n a o h 溶液浓度为o 2 0m o l l ，提取温度为3 0 ，提取时间为9 h 的条件下，设计液固比为1 0 m l g 、1 5 m l g 、2 0 m l g 、2 5 m l g 、3 0 m l g 等5 种处理，每提取3h 换一次提取液，用o 1 0m o l l 的h c i 标准溶液将提取液的p h 值调到4 4 ，沉淀2 h 后，离心速度4 0 0 0r m i n ，1 5m i n ，最后得到蛋白质产品，6 0 c 下 烘干至恒重，称重。求出蛋白质得率，绘制蛋白质得率曲线图，比较蛋白质得率。 1 2 4 3 测定提取温度对中华稻蝗蛋白质提取的影响 分别称取5g 中华稻蝗脱脂虫粕，在n a o h 溶液浓度为o 2 0 m o f l ，液固比为1 5 m l g ， 提取时间为9h 的条件下，设计提取温度为l o c 、2 0 c 、3 0 c 、4 0 。c 、5 0 c 、6 04 c 等6 种处理，每提取3h 换一次提取液，用o 1 0m o l l 的h c i 标准溶液将提取液的p h 值调 到4 4 ，沉淀2h 后，离心速度4 0 0 0r m i n ，1 5m i n ，最后得到蛋白质产品，6 0 c 下烘干 第二章中华稻蝗蛋白质提取研究 至恒重，称重。求出蛋白质得率，绘制蛋白质得率曲线图，比较蛋白质得率。 1 2 4 4 测定提取时间对中华稻蝗蛋白质提取的影响 分别称取5g 中华稻蝗脱脂虫粕，在n a o h 溶液浓度为0 2 0 m o l l ，液固比为1 5 m l g ， 提取温度为3 0 。c 的条件下，设计提取时间为3 h 、6h 、9 h 、1 2 h 、1 5h 等5 种处理，每 提取3h 换一次提取液，用o 1 0m o l l 的h c i 标准溶液将提取液的p h 值调到4 4 ，沉淀 2h 后，离心速度4 0 0 0r m i n ，1 5r a i n ，最后得到蛋白质产品，6 0 下烘干至恒重，称重。 求出蛋白质得率，绘制蛋白质得率曲线图，比较蛋白质得率。 1 2 5 正交试验 在单因素试验的基础上，设计一个关于n a o h 溶液浓度( m o l l ) 、提取温度( ) 、 液固比( m l g ) 、提取时间( h ) 四因素四水平的正交试验表，进行正交试验，确定碱溶 酸沉法提取中华稻蝗蛋白质的最佳工艺条件，每次试验平行2 次，操作顺序与单因素试 验相同。 表2 1 因素的水平表 t a b l e2 1t h el e v e l so f t h ef a c t o r 2 结果与讨论 2 1 单因素试验结果分析 2 1 1 碱浓度对中华稻蝗蛋白质提取的影响 如图2 2 所示，中华稻蝗蛋白质得率随着提取液的碱浓度的增大而不断提高。当 n a 0 h 溶液浓度在0 0 5 - + 0 1 5m o l l 之间时，蛋白质得率提高幅度较大，当n a o h 溶液浓 度达到o 1 5m o l l 以后，蛋白质得率随n a o h 溶液浓度增大而提高的幅度越来越小，尤 其在0 2 0 0 2 5m o l l 之间，蛋白质得率提高幅度甚微。 1 6 沈阳农业大学硕士学位论文 0 0 5 0 10 1 50 20 2 5 n a o h 浓度( m o l i l ) 围2 2n a o h 浓度对蛋自质得翠的影响 f i g 2 2 t h e i n f l u e n c e o f t h ec o n s i s t e n c y o f s o d i u mh y d r o x i d e t o t h e y i e l do f p r o t e i n 2 1 2 提取温度对中华稻蝗蛋白质提取的影响 在蛋白质的提取过程中，提取温度是一个比较关键的因素。为了保证所获得的蛋白 质未发生变性，试验往往采用在低温条件，提取蛋白质，但温度过低会降低蛋白质的溶 解性，不利于获得大量蛋白质，而高温易使蛋白质发生酸败，从而降低了蛋白质的品质。 所以本试验采用6 0 ( 2 以下的温度条件来提取中华稻蝗蛋白质。 从图2 3 中可知，中华稻蝗蛋白质得率随着提取温度的升高而不断提高，当提取温 度在1 04 c + 2 0 。0 之间，蛋白质得率提高的速度很快，在2 0 1 2 5 0 c 之间，蛋白质得率的 提高速度缓慢，5 0 + c 以后，其速度又开始加快，当提取温度达到6 0 1 2 时，蛋白质平均得 率高达4