（内科学专业论文）肺气肿大鼠全病程中膈肌功能的研究.pdf

删舢f | f f f f i i f 舢 y 17 6 8 7 9 8 1 3 二、英文缩略语5 三、论文 亩i 言”6 刖舌”o 材料与方法“6 结果1 5 讨论19 结论2 1 四、本研究创新性的自我评价2 2 五、参考文献2 3 六、附录 综述2 5 致谢3 2 个人简介3 3 中文论著摘要 肺气肿大鼠全病程中膈肌功能的研究 目的 本研究应用被动吸烟复制大鼠肺气肿模型，采用酶组织化学、免疫印记技术 等不同的检测方法，检测肺气肿大鼠全病程中的膈肌纤维类型和m t o r 蛋白的变 化，探讨肺气肿全病程中膈肌功能异常的分子生物学机制。 实验材料及方法 一、实验动物和分组 选取7 周龄健康雄性w i s t a r 大鼠1 2 0 只，体重2 5 0 - - - 2 8 0 9 ，由中国医科大学 实验动物中心提供，清洁度i 级，常规饲料自由饮水，温度2 2 a ：1 ，湿度5 0 左 右，明暗周期为1 2 h 。随机被分为3 组，分别为对照组( c ) 、肺气肿吸烟组( e ) 、肺 气肿戒烟组，分别在肺气肿形成0 天、3 月、6 月、1 2 月取材，每组1 0 只。 二、被动吸烟复制大鼠肺气肿模型 将肺气肿大鼠每天放入自制的烟熏舱( 体积为0 2 5m 3 ) ，暴露于1 0 支黄果树 牌香烟，每次被动吸烟l 小时5 天周，持续7 5 天。 三、主要实验方法 ( 一) 肺组织病理：h e 染色 ( 二) 膈肌纤维检测：采用琥珀酸脱氢酶方法，将肌纤维分为氧化型 和酵解型，其中染色深的是氧化型纤维，染色浅的酵解型纤维。 ( 三) m t o r 蛋白测定：w e s t e r nb l o t t i n g 四、统计学分析 所有数据用均数土标准差( x s ) 表示，采用完全随机设计资料单因素方差分 析进行显著性检验，若p 0 0 5 ，再进行q 检验，比较任意两组间的差异有无统计学 意义。采用单因素直线回归分析，比较干预因素与测量因素有无相关性。所有分 析用s p s s l 3 0 软件进行。 厶七甲 暑日7 卜 l 、在肺气肿形成o 天和3 个月时，e 组、n 组的氧化型纤维比例高于对照 组( p o 0 5 ) 。在肺气肿形成6 个月时，n 组的氧化型纤维比例高于对照组( p 0 0 5 ) 。在肺气肿形 成1 2 个月时，e 组、n 组的氧化型纤维比例低于对照组( p 0 0 5 ) 。 2 、年龄与氧化型纤维比例的相关分析结果显示正相关( p 0 0 5 ) 。 3 、在肺气肿形成0 天和3 个月时，e 组、n 组的m t o r 蛋白高于对照组( p o 0 5 ) 。在肺气肿形成6 个月时，n 组的m t o r 蛋白高于对照组( p o 0 5 ) 。在肺气肿形成1 2 个月时， e 组、n 组的m t o r 低于对照组( p 0 0 5 ) 。 结论 1 、肺气肿大鼠膈肌氧化型纤维比例随疾病进展先增加后下降，说明膈肌出现 代偿和失代偿过程。 2 、随着年龄的增加，膈肌氧化型纤维比例逐渐升高。 3 、肺气肿早期调节骨骼肌增生的信号蛋白m t o r 蛋白表达高于对照组，肺 气肿晚期m t o r 蛋白表达低于对照组。 关键词 肺气肿膈肌肌纤维m t o r 2 英文论著摘要 t h e d i a p h r a g m a t i cf u n c t i o no f r a t si nt h ec o u r s eo f e m p h y s e m a - p u r p o s e t h ep a s s i v es m o k i n gw a su s e dt od u p l i c a t er a te m p h y s e m am o d e l t od e t e c tt h e d i a p h r a g mf i b e rt y p e si nt h ew h o l ec o u r s eo fe m p h y s e m aw i t he n z y m eh i s t o c h e m i s t r y t h em t o rp r o t e i nw a sd e t e c t e db yw e s t e mb l o t t i n gt e c h n i q u e s ，w h i c hi no r d e rt o e x p l o r et h em e c h a n i s mo fd i a p h r a g m a t i cd y s f u n c t i o ni nt h em o l e c u l a rb i o l o g i c a ll e v e l e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l sa n dm e t h o d s o n eh u n d r e da n dt w e n t yh e a l t h ys e v e n - w e e k o l dm a l ew i s t a rr a t sw e r es e l e c t e d f o rs t u d y , w e i g h t i n g2 5 0 2 8 0 9 ，w h i c hc a m ef r o mt h ee x p e r i m e n t a la n i m a lc e n t e ro f c h i n am e d i c a lu n i v e r s i t y t h e yw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o3g r o u p s ：c o n t r o lg r o u p ( c ) ，e m p h y s e m aa n ds m o k i n gg r o u p ( e ) a n de m p h y s e m aa n ds m o k i n gc e s s a t i o ng r o u p ( o nt h ev e r yd a yo fe m p h y 7 s e m af o r m a t i o n , a n da f t e r3m o n t h s ，6m o n t h sa n d12 m o n t h s ，w ew i l lr a n d o m l yc h o o s e10r a t sf o re x p e r i m e n t t h er a t sw e r ep u ti n t ot h e h o m e m a d es m o k i n gc a p s u l e ( v o l u m e0 2 5 m j ) ，e x p o s u r e t o10h u a n g g u o s h u c i g a r e t t e s ，1h o u re a c hd a y , 5d a y s w e e k ，c o n t i n u e dt o7 5d a y s t h em a i ne x p e r i m e n t a l m e t h o d si n c l u d i n gl u n gp a t h o l o g yw i t hh es t a i n i n g ，d e t e c t i o no fd i a p h r a g mm u s c l e f i b e r 、) l ，i ms u c c i n i ca c i dd e h y d r o g e n a s em e t h o da n dm t o rp r o t e i nd e t e c t i o nw i t l l w e s t e r nb l o t t i n g s p s s l 3 0s o f t w a r ew a su s e df o ra l ld a t aa n a l y s i s i fp o 0 5 ， s t a t i s t i c si so fs i g n i f i c a n c e r e s u l t s 1 i n3m o n t h so fp u l m o n a r ye m p h y s e m a , a n do nt h ed a yo fe m p h y s e m a , o x i d i z e d f i b e r si neg r o u pa n dn g r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti ncg r o u p ( p 0 0 5 ) i n6m o n t h so fe m p h y s e m a , o x i d i z e df i b e r so fn g r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n t h a to fcg r o u p ( p 0 0 5 ) i ne m p h y s e m ao f12 m o n t h s ，eg r o u p ，ng r o u pt h ep r o p o r t i o no fo x i d i z e df i b e r sw e r eh i g h e rt h a nt h e 3 c o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ) 2 t h ea g ea n dt h ep r o p o r t i o no fo x i d i z e df i b e rc o r r e l a t i o na n a l y s i ss h o w e da p o s i t i v ec o r r e l a t i o n ( p o 0 5 ) 3 h l3m o n t h so fp u l m o n a r ye m p h y s e m a , a n do nt h ed a yo fe m p h y s e m a , m t o r p r o t e i ni neg r o u pa n dng r o u p w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti nc g r o u p ( p 0 0 5 ) i n6m o n t h so fe m p h y s e m a , m t o rp r o t e i no fn g r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n t h a to fcg r o u p ( p 0 0 5 ) i ne m p h y s e m ao f12m o n t h s ，m t o rp r o t e i n o fe g r o u pa n dng r o u pw e r eh i g h e rt h a n t h ec o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n s 1 t h er a t i oo fo x i d i z e df i b e r si nt h ee m p h y s e m ar a td i a p h r a g mw i t hd i s e a s e p r o g r e s s i o n f i r s ti n c r e a s e da n dt h e n d e c r e a s e d ，i n d i c a t i n gc o m p e n s a t i o n a n d d e c o m p e n s a t i o no c c u r r e d 2 i n c r e a s i n gw i t ha g e ，t h ep r o p o r t i o no f o x i d i z e df i b e r sg r a d u a l l yi n c r e a s e d 3 a te a r l ys t a g eo fe m p h y s e m a , s i g n a l i n gp r o t e i nm t o rp r o t e i ni ne m p h ，7 s e m a g r o u pw e r eh i g h e rt h a nt h a ti nc o n t r o lg r o u p k e yw o r d s e m p h y s e m ad i a p h r a g mm u s c l ef i b e rm t o r 4 英文缩略语 5 论文 肺气肿大鼠全病程中膈肌功能的研究 刖菁 肺气肿是支气管和肺部疾病常见的并发症，患病人数多，病死率高。呼吸困 难是肺气肿最常见的症状，虽然它的病理生理机制是复杂的，但是它与呼吸肌无 力有关【l l 。随着肺气肿的加重，患者会出现呼吸衰竭，肺源性心脏病等等，其中 呼吸衰竭是主要的死亡原因，它主要是与呼吸肌无力产生的高碳酸血症有关闭。 因为膈肌是主要的呼吸肌，膈肌收缩所产生的通气量占静息通气量的6 0 8 0 【3 】， 因此目前关于呼吸肌无力的研究主要集中在膈肌。近年来研究发现营养好的肺气 肿患者膈肌收缩力量和吸气功能并未明显降低 4 1 ，说明这类患者的膈肌结构和功 能可能发生某些代偿性改变，使之可以适应肺功能改变的需要。一些研究发现轻 中度肺气肿患者【蹦】膈肌纤维中i 型纤维( 氧化型纤维) 比例增加，i i 型纤维( 酵 解型纤维) 比例下降，膈肌向更具有氧化性的i 型纤维转化，这是膈肌对过度通 气做出有益的适应性改变。 骨骼肌萎缩是慢性阻塞性肺疾病一个重要的并发症【7 】，有关慢性阻塞性肺疾 病患者骨骼肌萎缩的发生机制尚未完全明确。一般来说，肌肉萎缩是蛋白质的合 成代谢和分解代谢不平衡引起的【8 - 9 1 。有研究发现泛素蛋白酶途径可能是膈肌萎缩 的重要机制i l o l 。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白( m a m m a l i a nt a r g e to f r a p a m y c i n ，r o t o r ) 是调节蛋白翻译的起始，是控制肌肉生长的重要信号分子【1 1 。2 】。m t o r 通过 p 1 3 k al ( t ，m t o r 和p 1 3 k a k t t s c12 m t o r 两条通路促进骨骼肌肥大。 本研究应用被动吸烟1 3 1 复制大鼠肺气肿模型，采用酶组织化学【1 4 】、免疫印迹 技术等不同的检测方法，检测肺气肿大鼠全病程中的膈肌纤维类型和m t o r 蛋白的 变化，探讨肺气肿全病程中膈肌功能异常的分子生物学机制。 材料及方法 一、被动吸烟复制大鼠肺气肿模型 6 ( 一) 实验动物和分组 选取7 周健康雄性w i s t a r 大鼠1 2 0 只，体重2 5 0 - - - 2 8 0 9 ，由中国医科大学实 验动物中心提供，清洁度i 级，常规饲料自由饮水，温度2 2 - 土1 ，湿度5 0 左右， 明日音周期为1 2 h 。 大鼠随机分成3 组，分别为对照组( n ：4 0 ) 、肺气肿吸烟组( n = 4 0 ) 、肺气肿戒烟 组( n = 4 0 ) ，分别在肺气肿形成0 天、3 月、6 月、1 2 月取材，见表1 。 表l ，分组 ( 二) 被动吸烟复制大鼠肺气肿模型 烟熏舱为密闭的有机玻璃舱，体积为0 2 5m 3 ( 2 5 0 l ) ，一侧壁有2 c m 通气孔， 按照4 0 0 只m 3 的密度放置大鼠，舱内同时点燃焦油含量1 3 m g 支香烟三支，每天持 续被动吸烟一小时，持续7 5 天，每次舱内吸烟时，通过医用氧气的输入维持舱内的 氧浓度在2 0 士1 左右，制作肺气肿大鼠模型u 引。 ( 三) 主要试剂和仪器 黄果树牌香烟( 含焦油量1 3 m g ) 测氧仪r s 5 1 0 0 型 医用氧气 贵州卷烟厂 上海雷磁新径仪器有限公司 自制密闭的有机玻璃舱( 1 x 0 5 0 5 m 3 ) 二、标本采集 ( 一) 方法 动物称重，1 0 水合氯醛按0 3 m l 1 0 0 9 腹腔注射麻醉动物，固定于解剖台， 剪去胸腹部毛发，迅速开胸腹腔。摘取右侧膈肌肋间部，沿垂直肌纤维方向取 2 - 3 r a m 宽肌条，用组织包埋剂包埋，放入液氮中速冻，连续1 0 9 m 厚冰冻切片 ( - 2 0 1 2 ) ，用于琥珀酸脱氢酶染色；摘取左侧膈肌肋间部放入液氮速冻后置于7 0 7 冰箱中保存，用于免疫印迹法；取右上肺置于1 0 福尔马林中固定2 4 小时以上， 常规梯度酒精脱水，二甲苯透明后，浸蜡包埋，制成蜡块，连续切4 1 t m 厚切片用 于h e 染色。 ( 二) 所需仪器和设备 电子天平b p 3 1 0 s 德国s a r t o r i u s 公司 组织包埋剂美国s a k u r a 公司 冰冻切片机c m1 9 0 0德国l e i c a 公司 切片机r m 2 0 2 5德国l e i c a 公司 8 0 。c 低温冰箱美国t h e r m o f o r m a 公司 三、肺组织病理：h e 染色 二甲苯i5 分 二甲苯5 分 1 0 0 酒精5 分 9 5 酒精1 分 8 5 酒精1 分 蒸馏水2 分 苏木素 3 5 分 流水 1 0 分 7 5 盐酸酒精1 2 分 流水3 0 秒 伊红1 分 9 5 酒精i 3 0 s 9 5 酒精i i 3 0 s 1 0 0 酒精i 1 2 m i n 1 0 0 酒精i i 1 - 2 m i n 二甲苯i 5 1 0 分 二甲苯i i 5 1 0 分 中性树胶封片 8 四、膈肌纤维检测：琥珀酸脱氢酶染色 ( 一) 实验方法【1 4 】 1 、冰冻切片室温风干。 2 、放入含琥珀酸钠和硝基四唑兰( n i t r o b l u et e t r a z o l i u m ，n b t ) 的孵育液中， 室温孵育3 0 分钟，直至颜色不再加深。 3 、去离子水洗3 次。 4 、3 0 ，6 0 ，9 0 丙酮溶液依次洗玻片( 除去切片中的非结合性n b t ) 。 5 、去离子水洗3 次。 6 、中性树胶封片。 在光学显微镜下观察膈肌纤维，染色深的为氧化型纤维( i + i ia 型纤维) ； 染色浅的为酵解型纤维( i ib 型纤维) 。 ( 二) 主要试剂和设备 l 、试剂 琥珀酸二钠盐$ 2 3 7 8 n b t ( n 6 8 7 6 ) 2 、配制溶液 美国s i g m a 公司 美国s i g m a 公司 ( 1 ) 磷酸盐缓冲液( 2 0 0 m m ，p h7 6 ) 2 0 0 m m n a h 2 p 0 4 12 m l 2 0 0 m mn a 2 h p 0 48 m l ( 2 ) 琥珀酸钠溶液( 2 0 0 m m ) 现用现配 琥珀酸钠5 4 9 去离子水 1 0 0 m l ( 3 ) n b t 孵育液 n b t 5 m g 琥珀酸钠溶液 5 m l 磷酸盐缓冲液 5 m l 3 、设备 光学显微镜日本o l y m p u s 公司 9 ( 三) 肌纤维的计数 每张片子随机取5 个视野( 4 0 0 x ) ，分别计数各视野内氧化型和酵 解型纤维数目，计算各型纤维占总纤维数目的百分数，最后取平均数 为每张片子的测定值。 五、m t o r 蛋白检测：w e s t e r nb l o t t i n g 方法 ( 一) w e s t e r nb l o t t i n g 方法 l 、步骤 ( 1 ) 组织中总蛋白的提取 组织块称重1 0 0 毫克，利用液氮、研钵粉碎组织块。加4 0 0p l 单去污剂裂解 液裂( 含蛋白酶抑制剂) 于匀浆器中，进行匀浆，然后置于冰3 0m i n 后，即可用 移液器将裂解液移至1 5 m l 离心管中，然后在4 。c 下1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，取上清 分装于0 5 m l 离心管中并置于一2 0 保存。进行b r a d f o r d 比色法测定蛋白质浓度。 ( 2 ) 配胶 将玻璃板洗净，最后用d d h 2 0 冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净 的纸巾晾干。先配制分离胶( 7 ) ，顺序：d d h 2 0 ， 1 5 m t r i s h c l ( p h 6 8 ) ， 3 0 a c r b i s ，1 0 s d s ，t e m e d ，1 0 a p s 。加1 - 2 r a m 水层，静置3 0 6 0 m i n 。 配制缩胶均( 5 ) ，顺序：d d h 2 0 ，1 5 m t r i s h c l ( p h 8 8 ) ，3 0 a c r p o i s ，1 0 s d s ， 除去水层，再加入t e m e d 和1 0 a p s ，插入梳子，注意勿产生气泡，静置6 0 9 0 m i n 。 待胶完全凝固后，将凝胶按要求安放在电泳槽中。电泳缓冲液加入两板胶之间， 轻轻水平拔掉梳子，等待加样，拨出梳子后用d d h 2 0 冲洗胶孔两遍以去除残胶。 若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较 薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。 ( 3 ) 电泳 样品处理：在收集的蛋白样品中加入5 x s d s p a g e 蛋白上样缓冲液；1 0 0 。c 金属浴加热3 5 分钟，以充分变性蛋白。样品含2 0 5 0 u g 的蛋白总量，样品两侧 的泳道用等体积的1 x l o a d i n gb u f f e r 上样，m a r k e r 也用1 x l o a d i n gb u f f e r 调整至与样 品等体积。 恒压：浓缩胶8 0 v ，分离胶1 2 0 1 3 0 v ；恒流：1 5 2 0 m a 胶。在目 1 0 的蛋白泳动至距胶下缘l c m 以上结束。 ( 4 ) 转膜 p v d f 膜的准备：电泳结束前2 0 分钟左右戴上手套，裁好p v d f 膜，在甲 醇中浸泡2 - 5 m i n ，然后转入转移液中。将滤纸、海绵挚也浸入转移液中。起胶： 留下分离胶，除去浓缩胶，将胶卸下，保留3 0 1 0 0 k d 或分子量范围更广些的胶 ( 以便以后做其他感兴趣的蛋白) ，左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下。三明 治装置：按阴极海绵滤纸凝胶p v d f 膜滤纸海绵阳极的顺序铺好胶和膜，安 放好三明治的转运槽。注意：每层之间用滴管将其中的气泡全部赶出，决不允许 气泡存在。注意膜、滤纸、胶的大小相当，尤其滤纸不能过大( 尤其是干转，以 防止短路) ；黑色的转运板对阴极，白色转运板对阳极，见图1 。转膜：湿转： 电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1 , 0 0 0 m l 电转液。将电泳槽置于冰盒中。11 0 v 恒压，转膜1 小时。 w h i t e ( + )b l a c k ( 一) 图l ，三明治示意图 ( 5 ) 封闭及杂交 封闭：将膜从电转槽中取出，去离子水与p b s t 或t b s t 稍加漂洗，浸没 于封闭液中室温缓慢摇荡2 小时。必要时可先用丽春红染色( 2 乙酸，0 5 丽春 红的水溶液) 观察蛋白条带，再用去离子水和t b s t 将丽春红洗脱后封闭，如用 蛋白m a r k e r 则可省略此步。结合一抗：t b s t 稍微清洗一下，每张3 x 9 c m 2 膜约 需2 m l 一抗稀释液，根据说明书1 ：1 0 0 0 稀释一抗，一抗封闭袋中尽量无气泡，4 c 摇晃孵育过夜。洗涤：一抗孵育结束后，用p b s t 或t b s t 浸洗膜三次，每次 5 1 0 r n i n 。结合二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择h r p 或a p 标记的抗体，按相应比例稀释1 ：5 0 0 0 ，室温轻摇2 小时。洗涤：二抗孵 育结束后，用p b s t 或t b s t 漂洗膜后再浸洗三次，每次5 1 0 m i n 。 ( 6 ) 发光鉴定：辣根过氧化物酶h r p e c l 发光法 将a 、b 发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干， 反贴法覆于a 、b 混合液滴上，置于e c l 成像系统中，根据软件说明操作，保存 图像。 2 、结果判定 利用b a n dl e a d e r 3 0 分析软件以电泳条带的光密度值作为条带的强度指标， 以内参照i b - a c t i n 表达条带的强度为标准。 ( 二) 主要试剂和仪器 1 、试剂 w e s t e r nb l o t 检测试剂盒 裂解液 蛋白酶抑制剂 牛血清白蛋白( b s a ) 甘油 p 一巯基乙醇 溴酚蓝 s d s ( l 5 7 5 0 ) t r i s 甘氨酸 丙烯酰胺 n - n 双丙烯酰胺 甲醇 t w e e n - 2 0 ( t b 0 5 6 0 ) g 2 5 0 考马斯亮蓝溶液 r 2 5 0 考马斯亮蓝溶液 丽春红 冰醋酸 加强型e c l 检测试剂盒 完达山牌脱脂奶粉 南京凯基生物试剂有限公司 华特生生物技术有限公司 华特生生物技术有限公司 美国b i o s h a r p 公司 沈阳化工厂 北京索莱宝公司 美国a m r e s c o 公司 美国s i g m a 公司 美国a n g u s 公司 美国f i d t t r e s c o 公司 美国a m r e s c o 公司 美国a l l r e s c o 公司 惠中化工厂 b i o b a s i c 公司 美国b i o s h a r p 公司 美国b i o s h a r p 公司 美国a i l l t e s c o 公司 天津化工厂 南京凯基生物试剂有限公司 黑龙江完达山乳业股份有限公司 1 2 一抗m t o r美国b i o c h e m i c a l s 公司 彩虹m a r k e r美国s a n t a 公司 内参1 3 - a c t i ns c 4 7 7 7 8 美国s a n t a 公司 2 、配制溶液 ( 1 ) g 2 5 0 考马斯亮蓝溶液 考马斯亮蓝g 2 5 0 ： 2 0 0 m g 9 5 乙醇： 5 0 m l 8 5 磷酸： 1 0 0 m l 蒸馏水至 1 0 0 0 m l 配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用选筮 过滤，4 c 保存。 ( 2 ) b s a 标准液：0 5 m e g m l 牛血清白蛋白( b s a ) b s a 0 5 m g d d h 2 0 l m l ( 3 ) 考马斯亮蓝r 2 5 0 染色液2 0 0 m l 考马斯亮蓝r 2 5 0 ：2 0 0 m g m e o h 甲醇： 9 0 m l 冰醋酸： 2 0 m l 蒸馏水至 2 0 0 m l ( 4 ) 考马斯亮蓝脱色液5 0 0 m l 甲醇 5 0 n l l 冰醋酸 5 0 m l d d h 2 0 至 5 0 0 m l 过滤 ( 5 ) 5 x s d s 加样缓冲液 1m o l lt r i s h c l ( p h 6 8 ) 0 6 m l 10 s d s 2 0 m l 1 溴酚蓝l m l 5 0 甘油 2 5 m l 加去离子水定容至1 0 m l ，混匀后，分装于1 5 m l 离心管中，4 c 保存。 1 3 ( 6 ) 3 0 a c r b i s 丙烯酰胺 2 9 9 n - n 双丙烯酰胺 1g 溶于6 0 m l 的d d h 2 0 中，加热至3 7 。c 溶解，补水至总体积1 0 0 m l ，p h 7 0 ， 过滤后在棕色瓶中4 。c 保存。 ( 7 ) 1 0 s d s s d s 1 0 9 d d h 2 0 9 0 m l 5 0 。c 水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可 使用。 ( 8 ) 1 0 过硫酸胺( a p s ) 过硫酸胺0 1 9 d d h 2 0 1 0 m l 溶解后，4 。c 保存，保存时间为1 周。 ( 9 ) 电泳液缓冲液( 1 0 x ) 嘶s 3 0 3 9 g l y c i n e 14 4 9 s d s 1 0 9 加d d h 2 0 定容至1 0 0 0 m l 。 ( 1 0 ) 转移缓冲液( 1 0 x ) t r i s 5 8 9 g l y c i n e 2 9 9 s d s 3 7 9 甲醇 2 0 0 0 m l 加d d h 2 0 定容至1 0 0 0 m l ，甲醇现用现加，终浓度为2 0 。分子量大的蛋白 需加s d s 。 ( 1 1 ) t b s 缓冲液( 1 0 x ) t r i s 2 0 m m n a c l ( 1 3 7 m m ) 2 4 2 9 8 0 9 1 4 i w e e n - 2 0l0 m l 加d d h 2 0 定容至1 0 0 0 m l ，t w e e n 2 0 现用现加。 ( 1 2 ) 1 0 x 丽春红染液 丽春红s 2 9 三氯乙酸 3 0 9 磺基水杨酸 3 0 9 蒸馏水至1 0 0 m l 使用时将其稀释1 0 倍。 ( 1 3 ) 封闭液( 含5 脱脂奶粉的t b s t 缓冲液) 脱脂奶粉 5 9 1x t b s t1 0 0 m l 3 、仪器和设备 恒温金属浴h b 1 0 0 高速离心机 - 2 0 低温冰箱 恒温水浴摇床 e c l 成像系统 六、统计学分析 杭州博日科技有限公司 德国e p p e n d o r f 公司 海尔集团 e n v i r o g e n i e 美国g e n ec o m p a n yl i m i t e d 所有数据用均数土标准差( x s ) 表示，采用完全随机设计资料单因素方差分 析进行显著性检验，若p o 0 5 ) ，6 月和1 2 月 实验组和对照组比较有差异( p 0 0 5 ) ，见表2 。 表2 ，各组大鼠体重( g ) ，以x ：t ：s 表示 注：奉表示与对照组大鼠的体重比较，p 0 0 5 。 三、膈肌纤维类型表达 ( 一) 膈肌纤维类型分布 氧化型纤维( ia + i i b ) 呈深染，酶颗粒多，酵解型纤维( i i a ) 呈淡染色， 酶颗粒少( 见图3 ) 。在肺气肿形成0 天和3 个月时，e 组、n 组的氧化型纤维比 例高于对照组( p o 0 5 ) 。在肺气肿形成6 个月时，n 组的氧化型纤维比例高于 1 6 对照组( p 0 0 5 ) 。 在肺气胂形成1 2 个月时，e 组、n 组的氧化型纤维比例低于对照组( p o 0 5 ) ， 分别见表3 ，图4 。 对照组( 4 0 0 x )肺气肿吸烟组( 4 0 0 ) 肺气肿戒烟组( 4 0 0 x ) 图3 ，s d h 染色 表3 ，膈肌纤维类型分布( ) ，以x = k s 表示 注： 与对照组比较，p 0 0 5 。 1 7 图4 ，3 组氧化型纤维比例 ( 二) 吸烟与戒烟对膈肌纤维类型的影响 对肺气肿吸烟组与肺气肿戒烟组的亚组分析，显示二者之问无显著差异， p = 0 6 6 3 ，见图5 。 图5 ，年龄与氧化型纤维比例 四、m t o r 蛋白的表达 在肺气肿形成0 天和3 个月时，e 组、n 组的m t o r 蛋白高于对照组( p o 0 5 ) 。 在肺气肿形成6 个月时，n 组的m t o r 蛋白高于对照组( p 0 0 5 ) 。在肺气肿形成1 2 个月时，e 组、n 组 1 8 的m t o r 低于对照组( p 0 0 5 ) ( 见图6 ，图7 ，表4 ) 。 cne - p r 一- t m t o r2 8 9 k 一- _ o 争a c t i n 4 3 k 图6 ，c 组，n 组，e 组在3 月表达 表4 ，三组m t o r 蛋白i $ - a c t i n 光密度值 图7 ，三组r o t o r 蛋白争a c t i n 光密度值的柱状图 讨论 肺气肿是呼吸系统常见病，患病率和死亡率很高。病理表现为终末细支气管 远端( 包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡) 气腔增大，并伴有腔壁破 坏性改变的一种病理状态。主要包括阻塞性肺气肿、老年性肺气肿、代偿性肺气 肿及灶性肺气肿等。阻寒性肺气肿最为常见，它是由于慢性支气管炎或其它原因 1 9 逐渐引起的细支气管狭窄，终末细支气管远端气腔过度充气，气腔壁膨胀、破裂 而产生的肺脏充气过度和肺容积增大的阻塞。呼吸困难是肺气肿突出的临床表现， 与肺通气功能下降、残气量增加和气道阻力增加有关，最近的研究发现呼吸困难 与呼吸肌无力有关【l 】。呼吸肌包括膈肌、肋间肌、腹肌以及辅助呼吸肌。根据功 能，呼吸肌分为吸气肌和呼气肌。吸气肌有膈肌、肋问外肌等，呼气肌为肋间内 肌、腹直肌等。膈肌属于骨骼肌 1 5 1 ，根据收缩特征和代谢特征分为三类，即：i 型：慢速氧化型肌纤维，含有丰富的毛细血管、肌红蛋白、线粒体，有利于有氧 代谢，有较高的耐疲劳性；i ia 型：快速氧化型肌纤维，含线粒体较多，也有一定 的耐疲劳能力；i i b 型：含毛细血管、肌红蛋白、线粒体较少，耐疲劳能力较差。 很多研究发现重度肺气肿患者【1 6 。9 1 的膈肌中慢收缩、耐疲劳的i 型纤维比例 升高，而快收缩、易疲劳的i i 型纤维比例下降，也有少数的研究轻中度肺气肿患 者1 5 叫膈肌纤维也有同样的改变，这种膈肌向更具有氧化性的i 型纤维转化，被认 为是膈肌对负荷过重做出的有益的适应性改变。本实验得出随着肺气肿疾病的进 展，膈肌氧化型纤维比例呈先升高后下降的趋势，说明膈肌是耐疲劳的，但是随 着疾病的进展膈肌仍会进入失代偿期。 众所周知，吸烟是肺气肿的一个主要病因之一。香烟能释放4 7 0 0 种以上化学 物质，不仅导致呼吸系统疾病，而且会对骨骼肌造成一定的损害。n a k a t a n i 等人【2 0 。2 1 】 研究发现吸烟者的比目鱼肌中i 型纤维比例下降，i 型纤维和i i a 型纤维的横截面 积下降。m a r i am o n t e sd eo c a , 等人【2 2 】发现吸烟的非c o p d 患者的骨骼肌有同样的 改变。本研究与上面的研究结果相反，分析可能的原因为膈肌是一种特殊的骨骼 肌，与外周骨骼肌相比更加耐受疲劳。 o t t e n h e i j mc a 等人研究发现【1 0 2 3 1 早期肺气肿患者的膈肌通过泛素蛋白酶体 系统发生蛋白降解，肌球蛋白含量下降。而此时患者并没有出现呼吸困难和高碳 酸血症等膈肌功能异常的表现，说明膈肌可能同时存在蛋白合成的增加。哺乳动 物雷帕霉素靶蛋白( m a m m a l i a nt a r g e to f r a p a m y c i n ，r o t o r ) 是一种丝苏氨酸蛋白 激酶，它在翻译调控中占有重要的地位【2 4 】，调节蛋白翻译的起始，是控制肌肉生 长的重要信号分子【2 5 之6 1 。m t o r 通过p 1 3 k a k t m t o r 和p 1 3 刚a k t 1 s c l 2 m t o r 两条通路促进骨骼肌肥大，同时a m p k t s c 2 使骨骼肌萎缩，m t o r 在骨骼肌的 2 0 信号传导当中发挥着重要作用【2 7 。3 。以前关于m t o r 的研究仅仅针对c o p d 某一 个阶段，而没有对全病程进行观察，本实验发现肺气肿早期膈肌的m t o r 蛋白表 达增加，随着病情进展膈肌m t o r 蛋白逐渐下降。而且以往的实验并未证实m t o r 信号通路的变化是否与肌纤维类型的转换有关，本研究发现m t o r 蛋白的变化与 氧化型纤维类型的变化方向是一致的，说明m t o r 信号通路的变化可能存在肌纤 维类型的特异性改变，但是本实验中氧化型纤维比例增加为相对增高，而m t o r 蛋白水平的增加为绝对增加，二者是否存在特异性变化，需要进一步的实验证实。 结论 肺气肿大鼠膈肌氧化型纤维比例和调节骨骼肌增生的信号蛋白m t o r 蛋白随 疾病进展先增加后下降，说明膈肌出现代偿和失代偿过程。随年龄的增加，氧化 型纤维比例逐渐升高。 2 1 本研究创新性的自我评价 首次观察肺气肿大鼠全病程中膈肌功能演变过程，包括膈肌纤维类型变化和 蛋白合成的变化规律，在肺气肿疾病不同阶段评价膈肌功能的变化规律。系统的 研究膈肌纤维类型转换和膈肌增生的信号之间的关系，说明膈肌在肺气肿病程中 先经历功能代偿然后将进入失代偿。 参考文献 l m a n n i n gh l s c h w a r t z s t e r nr m p a t h o p h y s i o l o g yo fd y s p n e a ne n g ljm e d 1 9 9 5 ；3 3 3 ： 1 5 4 7 1 5 5 3 2 b e g i n 只g r a s s i n oa i n s p i r a t o r ym u s c l ed y s f u n c t i o na n dc h r o n i ch y p e r c a p n i ai n c h r o n i c o b s t r u c t i v ep u l m o n a r yd i s e a s e a mr e vr e s p i rd i s 1 9 9 1 ；1 4 3 ：9 0 5 9 1 2 3c e l l ib t h ed i a p h r a g ma n dr e s p i r a t o r ym u s c l e s c h e s ts u r gc l i nna m 19 9 8 ；8 ：2 0 7 - 2 2 4 4s i m i l o w i s k it ，y a ns ，g a u t h i e r 只e ta 1 c o n t r a c t i l ep r o p e r t i e so ft h eh u m n a nd i a p h r a g md u r i n g c h r o n i ch y p e r i n f l a t i o n ne n g ljm e d 1 9 9 1 ：3 2 5 ：9 1 7 - 9 2 3 5 o t t e n h e i j mc a ，h e u n k sl m a ，h a f m a n st ，e ta 1 t i t i na n dd i a p h r a g md y s f u n c t i o ni nc h r o n i c o b s t r u c t i v ep u l m o n a r yd i s e a s e a mjr e s p i rc r i tc a r em e d 2 0 0 6 ；17 3 ：5 2 7 - 5 3 4 6d o u c e tm ，d e b i g a r e 凡j o a n i s s ed re ta 1 a d a p t a t i o no ft h ed i a p h r a g ma n dt h ev a s t u sl a t e r a l i s i nm i l d - t o - m o d e r a t ec o p d e a rr e s p i rj 2 0 0 4 ；2 4 ：9 71 - 9 7 9 7 a g u s t ia1 3 in o g u e r aa ，s a u l e d aj ，甜a 1 s y s t e m i ce f f e c t so fc h r o n i co b s t r u c t i v ep u l m o n a r y d i s e a s e e a rr e s p i rj 2 0 0 3 ；21 ：3 4 7 - 3 6 0 。 8 d e b i g a r e m a r q u i sk c o t ec h ，e ta 1 c a t a b o l i c a n a b o l i cb a l a n c ea n dm u s c l ew a s t i n gi n p a t i e n t sw i t hc o p d c h e s t 2 0 0 3 ；1 2 4 ：8 3 - - 8 9 9r o b e r tw ，j a c k m a ns c ，k a n d a r i a n t h em o l e c u l a rb a s i so fs k e l e t a lm u s c l