（农业昆虫与害虫防治专业论文）蝶蛹金小蜂毒液的生理功能及活性成分分离纯化的研究.pdf

浙江大学博士学位论文 中文摘要 中文摘要 本文在蝶蛹金小蜂毒液生理功能和生化特性的研究基础上，对蝶蛹金小蜂毒 液引起的寄主血细胞生理变化进行了进一步研究。同时，本文探索和设计了部分 及完全分离纯化具有抑制细胞延展和包囊的毒液活性组分的方法。实验结果概述 如下： 1 毒液对不同龄期菜粉蝶血细胞延展和包囊的影响 寄主免疫反应主要包括细胞和体液免疫，毒液在不同龄期寄主及血淋巴浆液 有无的处理条件下对寄主细胞延展影响不同。在o 5h ，毒液处理对细胞延展影 响差异显著，说明毒液、细胞免疫、体液免疫互作显著，作用有累加；但4h 差 异不显著，说明3 者无累加作用。这可能和细胞延展反应的特性有关。毒液、 不同龄期、血淋巴浆液3 因子共同作用不影响细胞包囊，这可能和包囊反应是 多因子的复杂作用有关。 2 毒液对细胞凋亡、死亡，存活的影响 应用细胞早期凋亡在细胞膜上的变化，即细胞膜上磷脂酰丝氨酸p s ) 的外 翻作为检测指标，对蝶蛹金小蜂的毒液是否影响不同龄期的寄主血细胞凋亡、死 亡、存活进行了检测。结果表明毒液处理后非寄生期的高龄幼虫、预蛹的血细胞 的凋亡、死亡、存活变化无规律。高龄幼虫血细胞有时凋亡率下降，但是不提高 存活率；死亡率有时上升或者不变，与对照差异不显著。预蛹血细胞有时凋亡率 不变或者下降、有时存活率上升或不变，对死亡率不影响。毒液处理的化蛹1 2h 、 2 4h 蛹的血细胞凋亡率下降与对照差异显著；存活率上升与对照差异显著。这 说明毒液显著抑制了细胞的早期凋亡，提高了细胞的存活率，这可能有利于寄生 蜂的发育。 3 毒液对细胞颗粒度和大小的影响 流式细胞仪可以分析细胞大小和颗粒度，对毒液处理的不同龄期的菜粉蝶血 细胞的大小和颗粒度进行研究发现，毒液处理的高龄幼虫，预蛹血细胞1h ，细 胞颗粒度增大，与对照差异显著；大小变化不大与对照差异不显著。化蛹1 2h 毒 浙江大学博士学位论文 中文捅要 液处理0 5h 后血细胞颗粒度减少和对照差异显著；大小变化不大和对照差异不 显著。化蛹1 2h 蛹毒液处理1h 及化蛹2 4h 蛹毒液处理4h 的蛹血细胞变 大，与对照差异显著；颗粒度变化不大与对照差异不显著。这些变化和细胞凋亡 时细胞大小和颗粒度的变化不同，间接说明不同龄期的菜粉蝶血细胞可能没有凋 亡或者凋亡率下降。 4 毒液蛋白部分纯化物对菜粉蝶蛹血细胞延展、包囊的影响 寄生蜂在产卵的同时也向寄主注射毒液，毒液抑制了寄主的免疫反应，因此 得以成功寄生，卵发育为成蜂。毒液是重要的寄主免疫反应压迫因子。蝶蛹金小 蜂的毒液抑制细胞的延展和包囊。但是毒液蛋白种类丰富，对毒液中究竟是哪个 组份有活性尚未研究。本文设计了几种方法部分纯化毒液蛋白，以便找到有活性 的蛋白。实验结果表明，部分纯化法可以显著提高毒液的活性。对部分纯化物进 行非变性电泳，发现了分子量为9 8k d a 蛋白；同时进行的变性电泳，发现了分 子量为2 4k d a 的蛋白。此蛋白很有可能是毒液的活性因子。 5 毒液纯化及分离物对菜粉蝶蛹血细胞延展和包囊的影响 没有共生病毒的膜翅目寄生蜂的毒液在调节寄主的免疫压迫反应和寄主调 控中有重要作用。目前对这些寄生蜂的毒液活性组分了解不多，特别是涉及到寄 主细胞免疫功能的组分。报道了菜粉蝶p i e r i sr a p a e 内寄生蜂蝶蛹金小蜂 p t e r o m a i u sp u p a r u m 毒液组分中分子量为2 4 1k d a 的v n 1 1 的分离和特性。 v n 1 1 通过硫酸铵沉淀和阴离子色谱纯化分离得到。用s d s p a d e 检测了 v n 1 1 的纯度。v n 1 1 与粗提毒液一样，在离体条件下可以显著抑制寄主血细胞 的延展和包囊。这表明v n 1 l 是粗提毒液中一个实际压迫寄主免疫功能的组分。 关键词：蝶蛹金小蜂；菜粉蝶；毒液；血细胞；延展；包囊；纯化；细胞凋亡； 细胞颗粒度；细胞大小。 浙江大学博士学位论文 a b s t r a c t t h e p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n sa n dt h ep u r i f i c a t i o no fa c t i v e c o m p o n e n t so fv e n o m f r o mp t e r o m a l u s p u p a r u m ( h y m e n o p t e r a ：p t e r o m a l i d a e ) a b s t r a c t t h ep h y s i o l o g i c a l c h a n g e so fh o s th e m o c y t e si n d u c e db yt h ev e n o mo f p t e r o m a l u sp u p a r u mw e r eb es t u d i e df u r t h e ro nt h eb a s i so ft h e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n sa n db i o c h e m i s t r yc h a r a c t e r so fv e n o mf r o mp t e r o m a l u sp u p a r u m w e d e s i g nt h em e t h o d so fp a r t i a l l ya n dc o m p l e t e l yi s o l a t i o no ft h ef a c t o r so fi n h i b i t i n g t h es p r e a d i n ga n de n c a p s u l a t i o nc a p a b i l i t yo fc e l l s t h er e s u l t sw e r es u m m a r i z e da s f o l l o w s ： 1e f f e c t so fv e n o mo nt h es p r e a d i n ga n de n c a p s u l a t i o nc a p a b i l i t yo fh e m o c y t e s f r o mt h ed i f f e r e n ti n s t a r sp i e r i sr a p a e t h ei m m u n er e s p o n s eo fh o s t si n c l u d e dc e l l u l a ra n dh u m o r a li m m u n i t y t h e v e n o mi n f l u e n c e d t h es p r e a d i n go fc e l l so fh o s t s d i f f e r e n t l y w i t ht r e a t m e n ta f d i f f e r e n ti n s t a r sa n dn oh u m o r a lo rn o t t h ed i f f e r e n c ew a s ：s i g n i f i c a n ta t0 5h i t s u g g e s t e dt h a tt h ei n t e r a c t i o ne f f e c t so fv e n o m ，c e l l u l a ra n dh u m o r a li m m u n i t yw e r e s i g n i f i c a n t t h e yh a da c c u m u l a t i o ne f f e c t i nc o n t r a s t ，t h e yw e r en os i g n i f i c a n ta t4h t h ep h e n o m e n ai n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sn oa c c u m u l a t i o ne f f e c t i t c o u l db e a s s o c i a t e dw i t ht h ec h a r a c t e r i s t i c so fc e l l s p r e a d i n g t h r e ef a c t o r s ，v e n o m ，d i f f e r e n t i n s t a r so fh o s t sa n dh u m o r a lo fh o s t s ，h a dn oc o m b i n e de f f e c to nc e l le n c a p s u l a t i o n i t m i g h tb ea s s o c i a t e dw i t he n c a p s u l a t i o n ，c o m p l i c a t e da f f e c t e db ym u l t i f a c t o r s 2e f f e c t so fv e n o mo nt h ea p o p t o s i s ，m o r t a l i t ya n dv i a b i l i t yo fh e m o c y t e sf r o m c e l l st r a n s l o c a t et h em e m b r a n ep h o s p h a t i d y l s e r i n e ( p s ) f r o mt h ei n n e rf a c eo f t h ep l a s m am e m b r a n et ot h ec e l ls u r f a c ea f t e ri n i t i a t i n ge a r l ya p o p t o s i s p sw a st e s t e d w h e t h e rt h ea p o p t o s i s ，m o r t a l i t ya n dv i a b i l i t yo fh e m o c y t e sf r o md i f f e r e n ti n s t a r so f v l 】一 浙江大学博士学位论文 a b s t r a c t p i e r i sr a p a ew e r ea f f e c t e db yv e n o m t h er e s u l t ss h o w e dt h ev a r i a t i o n so ft h e a p o p t o s i s ，m o r t a l i t ya n dv i a b i l i t yo fh e m o c y t e sa f t e rt h et r e a t m e n to fv e n o mw e r e u n s t a b l ei nn o n - p a r a s i t i z e dh i g h e ri n s t a rl a r v a ea n dp r e p u p a t h el a t ei n s t a rl a r v a e a p o p t o s i sr a t er e d u c e ds o m e t i m e s ，b u tt h ev i a b i l i t yo fc e l l sc o u l dn o ti n c r e a s e t h e m o r t a l i t yo fc e l l si n c r e a s e do ru n c h a n g e d c o m p a r e dw i t hc o n t r o l s ，t h e r ew e r en o d i f f e r e n c eb e t w e e nc o n t r o lg r o u pa n dt r e a t m e n t t h ea p o p t o s i so fc e l l so fp r e p u p aw a s i n v a r i a n to rd e c r e a s e ds o m e t i m e s t h ev i a b i l i t yo fc e l l sf r o mp r e p u p ai n c r e a s e do r u n c h a n g e ds o m e t i m e t h e r ew a sn oe f f e c to nt h em o r t a l i t yo fc e l l s t h ea p o p t o s i sr a t e o fc e l l so fp u p ao f12ha n d2 4hd e c r e a s e da f t e rt h et r e a t m e n to fv e n o m t h e r ew e r e s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c eb e t w e e nc o n t r o la n dt r e a t m e n t t h ev i a b i l i t yo fc e l l si n c r e a s e d t h e r ew e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c eb e t w e e nc o n t r o la n dt r e a t m e n t i ti n d i c a t e dt h a t v e n o ms i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h ec e l la p o p t o s i s i tw a sf a v o ro fs u r v i v a lo fp a r a s i t o i d 3e f f e c t so fv 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n t h ev e n o mi n h i b i t e d t h eh o s ti m m u n er e a c t i o n t h ew a s p sp a r a s i t i z et h eh o s t ss u c c e s s f u l l y 。t h ee g g s d e v e l o pm a t u r a t i o n v e n o mi st h ei m p o r t a n tf a c t o ro fs u p p r e s s i n gt h eh o s ti m m u n e d e f e n s e t h ev e n o mf r o mp t e r o m a l u sp u p a r u mi n h i b i t e dt h ec e l l s p r e a d i n ga n d e n c a p s u l a t i o n t h ev e n o mi sa b u n d a n ti ns p e c i e sa n dq u a n t i t y h o w e v e r ，i tw a s k n o w nl i t t l et h a tw h i c hc o m p o n e n t sw e r ea c t i v e w ed e s i g n e daf e wm e t h o d st o p a r t i a l l yp u r i f yt h ev e n o mp r o t e i n ss oa st of i n dt h ea c t i v ec o m p o n e n t s t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ea c t i v i t yo fp a r t i a lp u r i f i c a t i o no fv e n o mi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y w e f o u n dt h a tt h ep r o t e i nw i t hm o l e c u l a rw e i g h to f 9 8k d a b yn a t i v e - p a g e m e a n w h i l e ， w ef o u n dt h ep r o t e i nw i t hm o l e c u l a rw e i g h to f 2 4k d a 嘶醢ls d s p a g e t h ep r o t e i n m a y b eap o t e n t i a la c t i v ef a c t o ro fv e n o m 5i s o l a t i o no fv e n o ma n de f f e c to f p u r i f i c a t i o n o nt h e s p r e a d i n ga n d e n c a p s u l a t i o nc a p a b i l i t yo fh e m o c y t e sf r o mp i e r i sr a p a e i nh y m e n o p t e r a np a r a s i o i t sd e v o i do fs y m b i o t i cv i r u s e s ，v e n o mp r o t e i n sa p p e a r t o p l a yam a j o rr o l e i nh o s ti m m u n es u p p r e s s i o na n dh o s tr e g u l a t i o n n o tm u c hi s k n o w na b o u tt h ea c t i v ec o m p o n e n t so fv e n o mp r o t e i n si nt h e s ep a r a s i t o i d s ，e s p e c i a l l y t h o s et h a th a v et h ef u n c t i o n si n v o l v e di nt h es u p p r e s s i o no fh o s tc e l l u l a ri m m u n i t y h e r e ，i tw a sr e p o r t e dt h a tt h ei s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fav e n o mp r o t e i nv n 11 w i t h2 4 1k d ai ns i z ef r o mp t e r o m a l u sp u p a m m ，ap u p a s p e c i f i ce n d o p a r a s i t o i do f p 聍i sr a p a e 。t h ev n 11v e n o mp r o t e i ni si s o l a t e dw i t ht h ec o m b i n a t i o no f a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o na n da n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，a n di t sp u r i t yi s v e r i f i e du s i n gs d s - p a g ea n a l y s i s l i k ec r u d ev e n o m ，t h ev n 。11v e n o mp r o t e i n s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t st h e s p r e a d i n gb e h a v i o r a n d e n c a p s u l a t i o na b i l i t yo fh o s t h e m o c y t e s nv i t r o i ti ss u g g e s t e dt h a tt h i sp r o t e i ni sa na c t u a lc o m p o n e n to f p p u p a r u mc r u d ev e n o ma sh o s tc e l l u l a r - i m m u n es u p p r e s s i v ef a c t o r 。 k 锶w o r d ：p t e r o m a l u sp u p a r u m , p i e r 话r a p a e ，v e n o m ，h e m o c y t e ；s p r e a d i n g , e n c a p s u l a t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，c e l la p o p t o s i s ，c e l lg r a n u l a r i t y , c e l ls i z e 1 x 。 浙江大学博士学位论义前智 前言 寄生蜂是一类重要的生防昆虫据v a l ld r i e s c h e 等( 1 9 9 6 ) 统计，在释放 8 6 0 种天敌防治2 7 4 1 种害虫的事例中，2 1 6 例成功事例中就涉及到3 9 3 种寄 生蜂。目前已经研究了解到寄生蜂具有一些活性物质如具有麻痹神经、抑制寄生 免疫、调控寄主生长发育的毒液、卵萼液、病毒p d v 、类病毒颗粒、畸形细胞 等等。使用寄生蜂个体防治各神害虫，防治效果不稳定受很多嚣素的影响，在大 疆使焦旃甚至会受环境鑫子等影响弱失去应有昀效果。现代生物技术的发展已经 甚益成熟静实用，把现代生物技术作为工具，将寄生蜂的各种活性物质直接开发 为各种杀虫裁，即不会污染环境也不用担心抗药性，还可以使人们消费到各种绿 色食品，提高人类的身体质量，减少癌症等恶性病的发病率。寄生蜂的寄生还有 增效作用，可以促进自然界害虫病原菌感染害虫( j o n e se ta 1 ，1 9 9 3 ；d a n ie ta 1 ， 2 0 0 3 ；b a c k a g ee la 1 ，2 0 0 4 ) 。寄生蜂的另一优点是寄生蜂各种活性物质作用温和， 不用担心伤害其他生物。在各种活性物质中毒液是最容易应用于实际的一种，因 为p d v 基因组以多个大小不一的d n a 片段组成，并整合予寄生蜂基因组中， 要发挥作用还要考虑到基因表达酶条件和效果，所以综合比较起来，毒液是比较 好控制的医素。 毒液的主要成分是蛋白质，还包括一些类病毒微粒( l a w r e n c e & a k i n ，1 9 9 0 ) 和有机化合物( f u k u s h i m ae ta 1 ，1 9 9 0 ；s k i n n e re ta 1 ，1 9 9 0 ；s h i m i z ue ta 1 ，1 9 9 3 ) ， 其中研究较多的是蛋白质。寄生蜂毒液主要由蛋白混合物组成( s t r a n de ta l 。， 1 9 9 4 ) 。l e l t t k 等( 1 9 8 9 ) 对2 l 属2 5 种膜翅譬昆虫毒液蛋白组成及免疫攫似 性进行比较发现，在蚁类、社会性蜂类如蜜蜂鲍毒液中普遍存在低分子量蛋白和 多肽，褥在所研究的6 种姬蜂毒液中均不合虼低分子量蛋白或小肤，除蜜蜂外， 低分子萋蛋自均不合甘露糖；姬蜂和蚁粪毒液蛋白以酸性蛋白为主，褥社会性蜂 类如蜜蜂毒液主要是中性蛋白和碱性蛋白；茧蜂毒液中的有些蛋白与高等膜翅目 昆虫毒液蛋白有免疫反应，说明两种毒液在组成甚至功能上存在一定的进化关 系。内寄生蜂和外寄生蜂毒液的功能有所不同。外寄生蜂的毒液主要作用于神经 细胞的触突，表现有麻痹作用；而有些种类也具扰乱寄主内分泌和营养代谢及阻 止生长发育的功能( g r o s s n i k l a u s b i i r g i n ，1 9 9 8 ) 。内寄生蜂毒液大多是非麻痹性 的，单独或与其它抑制寄主的免疫因子结合抑制寄主血细胞免疫、调控寄生生长 浙江大学博士学位论文前言 发育、抑制寄主生殖系统发育及调节寄主的内分泌等功能。大多数内寄生蜂毒液 蛋白不同于蝎子、蛇毒等毒液蛋白和小肽，毒液绝大部分是分子量较大的酸性蛋 白( l e l u ke ta 1 ，1 9 8 9 ) ，仅能抑制寄主免疫、调控寄主生长发育等，而无神经麻 痹作用( j o n e se ta 1 ，1 9 9 3 ；q u i c k e ，1 9 9 2 ；b a c k a g ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。但偶尔也有少数报 道毒液具有麻痹作( p a r a k i s o n & w e a v e r , 1 9 9 9 ) 。毒液的活性组分、功能、及分 子克隆这方面研究至今因为寄生蜂个体小而且材料难取。所以研究报道的不多也 不深入。 细胞免疫反应是寄主的重要保护机制，细胞的延展和包囊是一些最基本的指 标。目前对毒液活性组分中抑制寄主细胞延展和包囊的蛋白组分研究报道不多， 仅有z h a n g 等( 2 0 0 6 ) 对菜粉蝶幼虫的内寄生蜂毒液的研究，发现了一种钙连 蛋白c r t ，它可以显著的抑制菜粉蝶幼虫的血细胞包囊和延展。在黑腹果蝇中 l a b r o s s e 等( 2 0 0 5 ) 发现的可以抑制片状细胞延展和包囊的p 4 蛋白。有关毒液对 寄主凋亡的影响有l u o 和p a n g ( 2 0 0 6 ) 发现的茧蜂毒液和核形多角体病毒对寄 主血细胞的影响。对毒液的功能研究上，有离体和活体两个层次目前研究报道 比较多。有关低含量的毒液的分离方法方面的研究有：r i v e r 等( 2 0 0 5 ) 采用硫 酸铵沉淀外寄生蜂n a s o n i av i t r i p e n n i s 的毒液。硫酸铵的浓度依次为5 、1 5 、 2 5 、4 0 、6 5 、8 0 、9 0 、1 0 0 。结果表明8 0 是最佳的提取浓度， 抑制寄主发育和致寄主死亡率和毒液差异不显著和对照差异显著。用3 体积的 丙酮沉淀毒液蛋白，结果表明提取物和对照差异显著和毒液差异不显著。用分子 量截留范围分别是1 0k d a 、3 0k d a 、5 0 k d a 、7 5k d a ，1 0 0k d a 超滤装置处理。 结果和毒液差异不显著和对照差异显著。硫酸铵和超滤管处理的样品的电泳结果 表明1 0 0k d a 左右两种方法都有一条带很相似。l a b r o s s e 等( 2 0 0 5 ) 采用的低温 非变性凝胶的电洗脱法。p a r k i n s o n 和w e a v e r ( 1 9 9 9 ) 用加热法处理了内寄生蜂 p i a m p l ah y p o c h o n d r i a c a 的毒液，有效减少了杂蛋白。p a r k i n s o n 等( 2 0 0 0 ，2 0 0 1 ， 2 0 0 3 ，2 0 0 4 ) 和z h a n g 等( 2 0 0 4 ，2 0 0 6 ) 采用的反向液相色谱和质谱连用分离和 鉴别肽段的特性。 蝶蛹金小蜂p t e r o m a l u sp u p a r u m 是菜粉蝶p i e r i sr a p a e 和柑桔风蝶 p a p i l i ox u t h u s 的蛹期重要寄生蜂。蝶蛹金小蜂是一种内寄生蜂，无病毒颗粒。 它的生物学和生态学( 胡萃，1 9 8 6 ；胡萃，万兴生，1 9 8 8 ；胡萃和俞伯良，1 9 8 7 ) 及 浙江大学博士学位论文前育 其与寄主的生理关系已有详细的研究( c e i le t a l ，2 0 0 1 ；2 0 0 4 ；蔡峻等，2 0 0 0 ；2 0 0 1 ； 2 0 0 2 ；吕慧平等，2 0 0 0 ) 。现在所有研究表明，毒液是最重要的抑制寄主免疫反 应的因子。蔡峻( 2 0 0 0 ，2 0 0 1 ，2 0 0 4 ) 对蝶蛹金小蜂的毒液的生理功能进行了研究。 毒液影响了寄主的体液免疫，显著抑制了寄主血细胞的延展和包囊。变性电泳结 果表明毒液蛋白种类丰富。张忠( 2 0 0 5 ) 证明毒液蛋白活性不受有机溶剂、蛋白 酶k 、不同p h ( 5 8 ) 、n a c i 和4 0 。c 加热处理的影响。对超滤系统分子量截鳃 为5 0k d a ，1 0 0k d a 也进行了验证。双向电泳结果表赡毒液蛋白大部分都是酸 性蛋自。本实验研究了毒液对不同处理方式下寄圭血细胞的延展和包囊。设计了 7 糟部分纯化毒液蛋白昀方法，并对所得部分纯能物进行了生物活性的测定和毫 泳，在诧基础上对七种方法送行了比较，以便找到最佳的纯仡方法和可能的活性 组分。同时设计了色谱的方法，对所得部分纯亿物进行进一步的纯化，以便找到 毒液中抑制细胞延展和包囊的蛋白或者肽等因子，削备得到纯品。蔡峻( 2 0 0 4 ) 对 毒液处理后的菜粉蝶蛹血细胞进行了细胞骨架的研究，发现毒液并没有破坏细胞 骨架由此得到启发，对毒液是否引起细胞凋亡进行研究，同时对毒液处理后的 细胞的生物学特性细胞颗粒度和大小体积进行了研究。 本研究承蒙国家自然科学基金项目( 编号：3 0 1 7 0 6 2 6 ) ：内寄生蜂毒液生理 功能及重要基因克隆资助。 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：吴弱韵签字日期：力谚年月刁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝至三盘堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝鎏盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 关弱荣】 导师签名： 签字日期：歹彦年月2 7 日 签字日期：年月日 爹 汪大学诲士擎往论文致谢 致谢 在此媾士论文完成之际，我仅对所有关心、支持和帮助我的领导、老师、同 学和亲友表示最诚挚的谢意! 本论文是在叶恭银教授悉心指导下完成的，论文字字句旬无不凝聚着导师的 心血，课题制定及论文写作过程是导师辛苦耕耘的过程，也是我聆听导师教诲的 过程，“做学问，首先做人的思想使我终生受益。姚洪渭副教授在平时学习、 工作和生活上给予帮助颇多，在此表示感谢! 实验过程中，本所老师在实验方面提供诸多便利，感谢各位老师的真诚帮助! 同时，感谢浙江大学农业与生物技术学院研究生培养科各位老师在学习和生活上 的关心与照顾! 特别感谢我的硕士导师一贵州大学金道超教授在本入学习和工 作上给予了无私帮助，扁他表承诚挚的谢意! 浙江大学应用昆虫学研究所给我提供一个宽松、融洽、令入愉悦的生活和工 作环境，实验过程得到昆虫所及本实验室的多位同学大力支持和帮助，在此表示 深深感谢。特别感谢巩中军、朱家颖、石宇、卢新民、徐鹏、张倩倩、黄芳、杨 琼、慎小晶、王欢、田俊策、方琦、郭建阳、韩成香、高秀云，这些同学对本实 验提供了大力帮助，无论是实验材料的准备还是实验的进行，均有各位同学的大 力帮助。 本实验进行的过程中也得到了相关生物技术公司及人员的大力支持和帮助， 感谢伯乐、宝诚、联科生物公司。特别感谢伯乐公司沈志扬工程师对蛋白纯化实 验的帮助和建议，蔡工程师对蛋白纯化仪器及时的维护和修理；同时也特别感谢 杭州联科生物技术有限公司的潘中明经理对流式细胞术实验鹩帮助和建议。 感谢我的父母、姐姐、妹妹及姐夫、妹夫，他们的无私支持与帮助使我顺利 完成学业。特别感谢我的男友侯俊先生，无论是在学习还是在生活等各方面，他 均给了我最大程度的支持与帮助，使我可以安心、顺利完成学业。 最后，谨向参加论文评阅及答辩委员会的专家i 教授们致以崇高的敬意! 浙江大学博士学位论文第一章寄生蜂毒液的研究进展 第一章寄生蜂毒液的研究进展 寄生蜂毒液的主要成分是蛋白质，还包括一些类病毒微粒( l a w r e n c e & a k i n ， 1 9 9 0 ) 和有机化合物( f u k u s h i m ae ta 1 ，1 9 9 0 ；s k i n n e re ta 1 ，1 9 9 0 ；s h i m i z ue ta 1 ， 1 9 9 3 ) 。毒液在寄生蜂的寄生过程中发挥了多种作用，本章就寄生蜂毒液蛋白性 质与功能的国内外研究概况作一介绍。 1 毒液的生理功能 1 1 对寄主细胞免疫的影响 1 1 1 对寄主细胞骨架的影响 细胞骨架决定了细胞的形状。细胞骨架是由蛋白丝构成的网状结构，对细胞 的形状、存活、运动、免疫反应有重要作用。细胞骨架也是信号转导和膜结构变 化的场所。肌动蛋白是细胞骨架的重要组成成分，在一些信号刺激下可发生解聚 或者聚合。钙离子和g t p 酶等都是细胞骨架调控的因子。寄生蜂在寄生寄主时， 要攻破细胞的第一道防线就是细胞骨架。内、外寄生蜂在产卵时，都会先注射毒 液到寄主体内，毒液显然是用来破坏细胞的第一道防线，对细胞形状的影响是通 过抑制细胞的伪足正常延伸，使其不能实现正常贴壁粘附。茧蜂l e p t o p i l i n e h e t e r o t o m a 的毒液抑制了黑腹果蝇d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 片状细胞 ( 1 a m e l l o c y t e ) 的延展，被抑制的细胞变为双极化形状( b i p o l a rm o r p o l o g y ) ， 丧失粘性。片状细胞裂解后形成大量的l a m e l l o l y s i n 碎片( r i z k i & r i z l d ，1 9 9 2 ， 1 9 9 4 ) 索诺姬蜂c a m p o l e t i ss o n o r e n s 括的毒液和卵巢蛋白破坏了寄主浆血细胞 和颗粒血细胞的细胞骨架( w e b b & l u c k h a r t ，1 9 9 4 ) 。姬蜂p i m p l ah y p o c h o n d r i a c a ( h y m e n o p t e r a ：i c h n e u m o n i d a e ) 毒液影响了番茄夜蛾l a c a n o b i ao l e r a c e a 血细胞的 形状，1 6n g r t l 毒液就可以抑制浆血细胞的延展( r i c h a r d & p a r k i n s o n ，2 0 0 0 ) 。 m i c r o p l i t i sm e d i a t o r 和a p a n t e l e sk a r i y a i 的毒液影响了p s e u d a l e t i as e p a r a t e ( n o c t u i d a e ) 血细胞的形态( t a n a k a , 1 9 8 7 ) 。c o t e s i a g l o m e r a t a 的毒液不能抑制尸 s e p a r a t e 颗粒血细胞的丝状伪足的延伸( w a g o & t a n a k a , 1 9 8 9 ) 。但是当卵萼液 和毒液一起注射时，可以抑制伪足的延伸。蝶蛹金小蜂p t e r o m a l u sp u p a r u m 毒 液抑制菜粉蝶p i e r i sr a p a e 蛹血细胞的延展，对细胞f a c t i n 的染色研究表明毒 浙江大学博士学位论文第一章寄生蜂毒液的研究进展 液没有破坏细胞骨架，即使细胞不能延展( c a ie ta 1 ，2 0 0 4 ) 。茧蜂c o t e s i ar u b e c u l a 的毒液用反向液相色谱质谱分析后，克隆表达了2 个与细胞骨架有关的蛋白和 肽：v n l 5 及c r t v n l 5 是一个分子量为1 5 0 0k d a 的小肽，单独不抑制菜 粉蝶幼虫血细胞的延展，但可以和病毒颗粒一起抑制细胞的延展( z h a n ge ta 1 ， 2 0 0 4b ) 。c r t 是钙连蛋白，可以和血细胞竞争结合钙离子的位点因此抑制了 细胞的延展( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。l e p t o p i l i n ab o u l a r d i ( h y m e n o p t e r a ：f i g i t i d a e ) 的 毒液带有病毒颗粒，但是其毒液仍然显著了抑制dm e l a n o g a s t e r 片状细胞的延 展( l a b r o s s ee ta 1 ，2 0 0 5a ) 。c o t e s i a