（农药学专业论文）凝胶色谱法在农药残留分析中的应用.pdf

摘要 本论文系统研究了各种因素对凝胶色谱净化效率的影响；辅助设计了自动化凝胶色谱仪制 鍪“f 一弹，j 、型健的凝跤色谱分析桂，宠成7 瓣仪器各项主爱技术指标的溅定工捧；依据基懿研究 结巢，使曩l 自酶翻的凝胶包潜仅，对不藏农药残整蔬菜群零进行净耗和分析。 以邻苯二二e f j 酸二取代酯系列化合物的保留体积和分r 撼的对数值建立模型，研究了不同分子 质量、不同结构和类型的农蕊在凝胶色谱中的保窜体积。研究发现，流动稠极性越强，对凝胶的 滚蒎能寿越赣，凝菠魏径越蠢、；袁药分子崔凝腔色灌柱中麴僳器薅积与分子缝稳畜关，禽蠢拜捩 结构或杂原予的化台物分子体积比同质量的不含这类结构的化合物的分予体积小，因此保蹬体积 大；分子中含带电基团时，化合物与凝胶之间存在一定的相豆作用，也使萁保留体积增加。根据 嚣娄杂质和农药在凝胶色谱棱中的保留体积，以分子量相对较大、保留体敬小的菊酯类他食物( 氟 羧鬣蔫醮) 俸为标记铯台稳，锈究了不薅热游条俘下对演瓣类窝色素癸夫分子杂爱豹净纯效果。 研究发现，黼胶色谱法对油脂类杂质的挣化效果好于对色索类杂质的净化效果；不同流动相体系 中，色谱条件的改变对杂质的净化效果影响不同。比较三种不同规格色谱柱在净化效果、柱容量 及撵作条 牛等方露的差别，制器了一静小型离效的凝腔色港分柝柱。以上瓣究为采用凝黢色谱法 进行祥晶净纯提供一定豹理论和数据支持。 结合使用半自动化凝胶色谱仪的经验，分析现有商品化凝胶色谱仪的特点，辅助设计了自动 化凝胶色谱仪，完成了取样体积精密度、分析过程稳定性等主要技术指标的测试。根据研究缩果， 缝臻鑫研稍鹁舞动纯凝胶龟港仪簿l 枣型凝黢分辑柱壹接对不嚣表葵残蟹菠菜榉奉遴 i 净像：对杂 质含量高韵榉品，结合固相萃取技术，建立凝胶色谱一嗣棚萃取在线联羽净化方法。研究结果表 明，该仪器自够满足农药残留分析样品制备的要求，净化效果好，分析成本低( 省时、省力、省 溶剃) 。 关键词：凝胶色谱法，凝胶叙谱仪，净化，农药残留分析 a b s t r a c t g e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ( g p c ) i so n eo ft h eu s e f u ls a m p l ec l e a n u pm e t h o d si np e s t i c i d e r e s i d u ea n a l y s i sb e c a u s eo fi t sa u t o m a t i o na n dc o n v e n i e n c e i nt h ep a s t ，t h eu s eo ft h i sm e t h o di so n l y e x p e d e n t i a la sw e l la st i m ea n ds o l v e n tc o n s u m i n g i nt h i sp a p e r , f o rt h ef i r s tt i m e ，t h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n tc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sw h i c ha f f e c t t h ec l e a n u pe f f i c i e n c yw e r er e s e a r c h e d ，i n c l u d i n gs p e e do fm o b i l ep h a s e ，t h ea m d u n to fl o a d e ds a m p l e ( c o r no i l ) ，e t e ，i nd i f f e r e n tc o n d i t i o n si ns o l v e n ta ，ba n dc ，w ef o u n dt h a ts o l v e n taa n dba l eb e t t e r t h a nci nc l e a n i n g 叩o n ，t h ea m o u n to fs a m p l el o a d i n go nt h ec o l u m ni st h em a i nf a c t o rw h i c ha f f e c t e d t h eo i lc l e a n u pe 妇丘c i e n c y w ea l s or e s e a r c h e dt h ef a c t o r ss u c ha st h em o l e c u l a rw e i g h ta n ds i z e t h e e l e m e n tc o m p o n e n to ft h ec o m p o u n dw h i c hi n f l u e n c et h er e t e n t i o nt i m e ( r e t e n t i o nv o l u m e ) o fp e s t i c i d e m o l e c u l ei ns o l v e n taa n dc ，b a s e do nt h er e s e a r c h ，w ef o u n dt h r e er e g u l a d t i e sw h i c ha f f e c t e d m o l e c u l a rr e t e n t i o nv o l u m e ，t h ef i r s to n ei st h em o r ep o l a r i t yo fs o l v e n t 。t h es m a l l e rs i z eo ft h eg p c h o l e sa n dt h el a t e ro ft h em o l e c u l a rr e t e n t i o nt i m e ；t h es e c o n do n ei si f 也e r ea r er i n g so rp o l a r i t ya m m s i nm o l e c u l a r , t h em o l e c u l a rs i z ei ss m a l l e rt h a no t h e r sw h i c hh a st h es a m em o l e c u l a rw e i g h t ；t h et h i r d o n ei st h ep o l a r i t ya t o m so rp h e n y li nt h ec o m p o u n dm a yo c c u rt h ei n t e r a c t i o no ft h ec o m p o u n da n d g p c ，t h e nt h em o l e c u l a rw i l le l u t ef r o mt h ec o l u m nl a t e l y w ea l s oc o m p a r e dt h r e eg p ca n a l y t i c a l c o l u n m si nt h ec l e a n - u pe 伍c i e n c ya n do p e r a t i o nc u n d i t i o n s b a s e do nt h ee x p e d e 1 g eo fu s i n gg p ca n dt h er e s e a r c ho ft h ec o m m e r c i a lm a c h i n e s w ed e s i g n e d a n dd e v e l o p e dan e wg p ca u t o m a c h i n ea n das m a l lg p ce l c a n u pc o l u m n ，m e a s u r e dt h em a i n t e c h n i c a lp a r a m e t e r s b a s e do nt h er e s u l t so ft h e o r e t i c a lr e s e a r c h w em a i n l yu s e dg p cf o rs a m p i e c l e a n u oa n da n a l y s e dm u l 昏r e s i d u ep e s t i c i d e w 色a l s or e s e a r c h e dt h eo n l i n eg p c s p ec l e a n u p m e t h o dt oc l c a nu ps o m ec o m p l e t e ds a m p l e f r o mt h er e s u l t s w ec a ns e et h a tg p ci sav e r ye f f e c t i v e m e t h o da n du s i n gt h i sa u t o - r o a c h i n et oc l e a nu ps a m p i ec a ns a v eal o to ft i m ea n ds o l v e n t a n dm e e ta l l r e q u i r e m e n to f p r e p a r a t i o nf o rp e s t i c i d er e s i d u ea n a l y s i ss a m p l e k e yw o r d s ：g e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ( g p c ) ，g p ca u t om a c h i n e ，s a m p l ec l e a n u p ， p e s t i c i d er e s i d u ea n a l y s i s 符号及缩写 一一 英文缩写英文全称 中文名褥 一一一一 g p c g e l p e r m e a l i o nc h r o m a t o g r a p h y 凝胶渗透色谱( 凝胶色谱) s p es o l i d - p h a s ee x t r a c t i o n g cg a sc h r o m a t o g r a p h y 固相萃取 气相色谱仪 p u l s e df 1 a m ep h o t o m e t r l cd e t e c t o r 脉冲火焰光度检测器 g c m s g c h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y 气相色谱一质谱联用仪 s i ss e l e c t e di o ns t o r a g e o c o r g a n o e h l o r l a e m c n - m e t h y lc a r b a m a t e 选择离子存储 有机磷农药 有机氯农药 氨基甲酸酯类农药 一h 一 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 詹嘲 时间：拟年g 月，、7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：詹硼 时间：2 0 年月，_ 7 目 ， 导师签名：彦t 时间： 2 对年月9 1 3 中因班业大学硕士学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 随着社会的进步和发展，人民生活水平不断提高，同时对生活质量的要求也在不断提高。俗 话说“民以食为天”，可见食品安全问题是关系人类健康和国际民生的重大问题，因此一直受到 各国政府和公众的普遍关注。我国在基本解决了食品数量安全的基础上，对食品质量安全的重视 程度日益增强。影响食品质量安全的主要污染因素可分为生物性污染因素和化学性污染因素两大 类，农药、兽药、重金属等是化学性污染物中问题较突出、危害较严重的一大类有毒有害物质。 农药是现代农业生产中不可缺少的一大类重要生产物资，使用农药可以有效控制危害农业生 产的各种病虫草害，因此，它在保证作物产量和质量方面具有非常重要的作用。但是，由于农药 自身性质的不足和人为不合理使用等因素，导致了农药残留问题的产生。农药残留不仅影响了农 产品的质量，对人民群众的身体健康存在一定的危害：而且已经成为影响我国农业和食品工业在 国际市场竞争力的关键因素。 开发快速、可靠、灵敏的农药残留分析方法是保证食品安全的重要手段。样品前处理技术则 是农药残留分析过程中的关键。传统的样品前处理方法费时，费力，耗费大量溶荆且容易污染环 境，近年来开发的样品前处理技术如：固相萃取( s p e ) 、涸相微萃取( s p m e ) 、超临界流体萃取 ( s f e ) 、微波辅助萃取( m a e ) 、加速溶剂萃取( a s e ) 及凝胶渗透色谱( g p c ) 等则具有高效、 快速、安全、重复性好、易于微型化和自动化等优点，成为样品前处理技术研究的热点和方向。 凝胶色谱法是新型的样品前处理方法之一， 收率好，自动化程度高、分析柱可以重复使用， 1 1 凝胶色谱技术 1 1 1 凝胶色谱法的原理及发展过程 对大分子杂质净化效率高，对待分析化合物的回 广泛适用于各类样品的前处理。 凝胶色谱是一种新型的液相色谱，基于体积排阻效应原理，根据化合物分子大小不同而达到 分离净化的目的，是色谱法中晟新的分离技术之一。 凝胶色谱作为一种分离技术是早出现在1 9 5 9 年，p o r a t h 和f l o d i n 用交联的缩聚葡糖制成凝胶， 成功分离了水溶液中不同分子量的化合物。随后凝胶色谱技术在生物化学研究领域中迅速推广应 f | j ，成为生物化学研究中一种常用的分离手段。1 9 6 4 年m o o r e 用苯乙烯和二乙烯苯在不同条件下 制成了一系列不同孔径的凝胶，这类凝胶可以在有机溶剂体系中使用，因此扩大了凝胶色谱的使 用范围，使这种技术广泛应用于高分子科学领域，是一种快速有效的测定分子量和分子量分布的方 法p 。6 0 年代末，凝胶渗透色谱技术开始用于农药残留分析并初步实现了自动化。随后，这项 技术受到广泛重视并在各个研究领域都取得了较好的研究结果，成为一个非常活跃的研究领域。 无论住凝胶的制备，仪器的技术性能、应用研究上都取得了很大的进展，应用范围也涉及到生物 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 化学、高分子化学、有机和无机化学等众多领域。 1 1 2 凝胶的种类及应用 凝胶是凝胶色谱的核心，是对组分进行分离的基础。已经研制和使用过的凝胶很多，制备工 艺、使用技术和条件也各有不同。根据凝胶材料的来源可以分为有机凝胶和无机凝胶，根据制备 方法可以分为均匀、半均匀和非均匀三种；根据凝胶使用的强度性质分为软胶、半硬胶和硬胶三 类；根据使用的溶剂范围可以分为亲水性、亲油性和两性凝胶。亲水性凝胶主要用于生物化学研 究中对蛋白质、酶等进行分离和分析，亲油性凝胶应用于合成的高分子材料和有机体系中化合物 的分离和分析。选择和使用不同性能不同孔径的凝胶决定了分离净化的效果，通常可根据样品基 质类型和待分离组分的分子大小决定所选择的凝胶的种类。下表列举了部分凝胶产品的性质。 表1 1部分凝胶的种类和性质 1 1 3 凝胶色谱仪 凝胶色谱分析柱性能稳定并且在固定的淋洗系统中可以重复使用，使凝胶色谱技术具有实现 自动化的基本条件。凝胶色谱仪主要由输液系统( 包括溶剂贮存器、脱气装置、输液泵、进样器 等) 、色谱柱、检测器、信号记录仪、控制系统等部分组成。1 9 6 5 年w a t e r s 公司的g p c2 0 0 型凝 胶色谱仪问世，随后陆续出现各种类型的自动化凝胶色谱仪，但这些仪器主要用于分子量和分子 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 茸分布的测量。在相同色谱条件下，农药和杂质的洗脱体积能够保持相对的恒定，使得凝胶色谱 净化技术( 尤其是自动化凝胶色谱技术) 在农药残留分析中的应用日趋广泛。 1 。2 凝胶色谱技术在农药残留分析中的应用 农产品和食品中农药残留分析属于痕量分析分析方法通常包括两部分：样品前处理方法和 检测方法。不同种类农药的性质差别较大且残留水平较低，不同样品基质中干扰物质也大不相同。 吲此，农药多残留分析方法均比较复杂且具有一定难度。根据样品基质的特点和待测农药的性质， 利用各种前处理技术和设备，在保证对目标分析物具有较好回收率的前提下，尽可能去除干扰分 析的各类杂质就是样品的前处理过程。由于凝胶色谱法具有非常多的优点，因此这种方法越来越 多的应用于农药残留样品前处理过程中。 1 2 1 发展及研究现状分析 1 9 6 7 年，r u z i c k a 等首先报道了凝胶色谱法用于蔬菜样本中有机磷农药的残留分析，并取得 了较好的净化和分析结果【卅。1 9 7 1 年，s m i l i n g 等将凝胶色谱作为一种快速净化技术，用于脂类 杂质与农药的分离，并使这种技术初步实现了自动化1 5 7 i 。随后凝胶色谱技术受到广泛重视，成为 农药残留分析中一种主要的净化手段并不断得到改进和发展。下表列举了凝胶色谱技术在农药残 留分析中的应用进展。 表1 2凝胶色谱技术在农药残留分析中的应用 3 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 综上分析，目前凝胶色谱法在农药残留分析中的研究和应用现状为： 填料使用方面：样本净化通常选择可在有机溶剂体系中使用的凝胶。曾研究和使用过的有交 联葡聚糖凝胶( s e p h a d e xl h - 2 0 ) 和交联聚苯乙烯凝胶( b i o b e a d ss - ) ( ) 两大类。交联聚苯乙烯凝 胶属于有机凝胶，是苯乙烯和二乙烯苯的共聚物。这类凝胶主要用于非极性有机溶剂体系，极性 溶剂如丙酮、甲醇等通常不能单独使用。其次由于农药分子较小，因此要求凝胶的孔径相对较 小，通常选择b i o ，b e a d s 系列凝胶品种，且实验证实这类凝胶的净化效果好。最常用的是b i o b e a d s s - x 3 ，主要在于其分子排阻上限较合适，同时b i o - b e a d ss - x 3 可以在一定压力下使用，更有利于 实现自动化，目前，b i o b e a d s s x 3 已经成为农药残留分析中主要使用的凝胶类型。从理论上讲 凝胶色谱相当于分子筛，因此对化合物没有吸附或其他作用。 凝胶色谱柱类型：普遍选用耐压玻璃柱作为凝胶色谱柱，但在柱子形状和规格的选择上存在 随机性，差别很大。通常，为了使凝胶色谱柱能够容纳一定量样品并达到分离杂质和农药的效果， 其内径和长度都有一定要求，内径一般在1 0 - 2 5c l t i ，柱内凝胶柱床的高度一般不低于2 0c 1 3 3 ， 但是，在实际使用时往往因选择了比较长而粗的柱子，填充了过多的凝胶填料，造成农药洗脱体 积过大，浪费了大量的溶剂和分析时间。近年来，小型的g p c 分析柱应用增多，p a t t e r s o n 等改 进了a o a cm e t h o d9 8 4 2 1 ，采用1 0a ni d 分析柱进行净化，对于大多数有机氯农药的回收体积 仅为1 4m l t ”j 。国内也有报导使用小型分析柱进行各类样品净化并取得较好净化和分析结果 5 7 1 1 5 8 1 。 凝胶色谱条件：文献报道在样品上样量、流动相极性、流速等条件上也都各不相同。一般要 求流动相对农药有良好的溶解性同时对凝胶有一定的溶胀能力，常用的b i o b e a d s s - x 3 凝胶多以 己酸乙酯- 环己烷或二氯甲烷拥：己烷等不同比例的混合溶剂作流动相。n a o t o f u r u s a w 等研究了以 ：氯甲烷环己烷( 1 ：1 ) 和乙酸乙酯一环己烷( 1 ：1 ) 为淋洗荆净化鸡蛋中有机氯农药，结果表明回 收率分别在7 2 - 9 0 和9 0 1 0 4 ，以乙酸乙酯环己烷( 1 ：1 ) 为淋洗剂效果好，并且可以减少卤代 烃的使用。o k i h a s h im 等人在两种类型分析柱上研究了乙酸乙酯环己烷( 1 ：1 ) 乙酸乙酯环己烷 ( 3 ：7 ) ；丙酮- 环己烷( 3 ：7 ) 三种流动相体系用于农药残留分析的效果，结果表明乙酸乙酯- 环己烷( 3 ：7 ) 和丙酮一环己烷( 3 ：7 ) 体系中净化效果较好1 2 6 1 。在流速选择上，研究表明流速在l 一6m l m i n 不影 响农药洗脱体积1 2 j ，因此，通常选择填料可以承受的最高流速5m i m i n 。 净化效果：样品基质不同，检测农药的种类、数量不同，采用凝胶色谱法净化的效果也不同。 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 某些干扰较少的样品在凝胶色谱净化之后，可以采用选择性检测器或质谱检测器直接检测。如： 检测某些蔬菜样品中有机磷农药残留，由于样品中色素含量较少，经凝胶色谱净化后大部分油脂 和色素被去除，通常可以在一步净化后直接用气相色谱法和选择性检测器如f p d 、n p d 等直接检 测。a n t o n i o 等人用凝胶色谱法分离净化了蔬菜和水果样本中有机磷、有机氯和菊酯等8 0 多种农 药取得较好的结果。目前，凝胶色谱法可对多种农药残留样本( 如有机磷、有机氯、氢基甲酸酯、 菊酯等) 尤其是含脂类杂质较多的样本进行净化。 1 2 2 凝胶色谱分析方法的建立 凝胶色谱按照溶质分子大小进行分离，与化合物极性关系不火，没有吸附和解吸附作用，囡 此建立凝胶色谱净化方法相对于其他净化方法( 如固相萃取技术) 比较简单。仪器方面，可以使 婀自动化仪器也可以自建半自动凝胶色谱仪。 样品经提取浓缩后以一定的体积上样( 通常上样体积小于5m 1 ) 样品最通常较小( 一般小 f 。1 0g ) 。在一定的压力下，流动相以恒定的流速流过色谱柱和检测器。根据待测农药中分子较 大的农药确定多残留组分的保留体积，确定所要收集组分的起始点( 确定适合的起始点对保证农 药的回收率非常重要 。收集起始点确定后可以对实际样品进行净化，大分子杂质通常先于农药 分子流出，因此，凝胶色谱法可用于不同类型农药残留样本的净化，效果好，农药的回收率较高。 1 3 凝胶色谱法与其他净化方法联用技术 基质比较复杂或者含有杂质较多的样本( 如含有大量的油脂，色素，生物碱等) 经过凝胶 色谱净化虽然可以除去大部分大分子杂质，但是，与农药分子大小相近的杂质却无法去除，对剩 余的这一部分杂质需要使用其它净化技术进一步净化，以防止杂质污染进样口或柱头，或者杂质 0 ，据分析系统中的活性点，导致色谱分离能力降低、干扰严重，仪器灵敏度降低，或产生基质增 强效应等。 凝胶色谱法和吸附色谱法或其他净化技术联用，可以达到彻底净化样本杂质的目的。其中， 同相萃取技术是常用的样品净化技术之一，根据分析物和杂质在固定相上吸附和解吸附的行为不 同分离目标物与杂质，实现对样品的净化。目前，以这两种净化方法联用为主，其联用形式主要 育离线联用和在线联用两种。 较为常用的是离线凝胶色谱固相萃取联用技术。样品经凝胶色谱净化，收集所需组分并浓 缩，再根据化合物和剩余杂质的类型和性质，采用固相萃取技术，使用不同性质的固相萃取吸附 剂进步净化。u e n o e 等采用g p c 和f l o r i s i l 联用净化技术，分析了多种蔬菜和水果中多种农药 残留p 1 j ；f u r u s a w a n 等采用该方法分析了鸡蛋中有机氯农药残留；u e n o - e 等人采用g p c 与活性 碳色谱及f l o r i s i l 联用，建立了农药多残留分析方法并实际检测了2 0 3 个农产品中的农药残留咿j ； p a n t i r u - m 等人研究了各类固相萃取柱 s i l i c ag e l ，g r a p h i t i s o dc a r b b l a c k ( e n v i - c a i _ b ) ，p o l a r 5 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 m o d i f i e dp o l y m e r i cs o r b e n t s ( o a s i sm a x ) 与g p c 联用，分析了蔬菜、水果和谷物中1 5 种氨基甲 酸酯和1 5 种酸性农药残留p q 。可见，目前离线g p c - s p e 技术在农药残留分析前处理中应用和研 究较多。 在线联用技术可以实现凝胶色谱技术和其他净化方法自动连接。样品首先经过凝胶色谱净 化之后或是自动进行浓缩，或不浓缩直接自动切换到下一个净化系统继续净化，最后浓缩检测。 目前，已经研制并商品化的p o w e r p m p s p e g p d 就实现了凝胶色谱与固相萃取技术的在线联 用，这套系统可用于从水、食品、环境样品及生物样品中提取并分离多氯联苯和二恶英等有害污 染物。 1 4 农药残留分析用凝胶色谱仪的研制及改进 1 9 7 2 年，s t a l l i n g 和t i n d l e 首先发明了自动凝胶色谱仪并用于分离净化油脂和有机磷等农药 2 1 o 此后，这种凝胶色谱仪j “泛用于各种农药残留样本的净化。1 9 8 2 年h o p p e r 等报道了用改进 的凝胶色谱系统从含脂类杂质的食品中快速分离有机磷农药的方法 6 1 。目前，自动化凝胶色谱技 术已经作为最有效的环境样品、食品、废弃污染物和其他样晶的净化方法。 农药残留分析用凝胶色谱仪是中等压力液相色谱仪，用泵使溶剂在较低的压力下以恒定的流 速通过凝胶色谱柱，收集所需洗脱溶剂。这类仪器主要由输液泵、凝胶分析柱、进样装置、收集 装置、检测器等构成可分为半自动和全自动凝胶色谱仪两类。近年来开发的自动化仪器都由这 几部分构成，并在此基础上逐步进行改进。仪器操作简单、稳定性好、定位准确、增强软件控制 和处理功能；分析柱小型化、高效化：分析时间短且节省分析成本。 j 4 1 半自动凝胶色谱仪 这种仪器在进样、收集和检测上需要手动完成，流动相通过输液泵或者在氮气等惰性气体的 压力下以恒定的流速流过色谱柱。上样时，使用注射器将样品注入六通阀，再由流动相推到凝胶 色谱柱上。以一定体积分段收集多组流出组分，用相应的检测方法检测，根据杂质和农药的流出 曲线确定要收集的体积。凝胶的用量可以根据样品中杂质和农药组分之间的分离程度确定。目前 这类仪器有k l - s x - 3 型，凝胶柱为2 0 0 m m 1 0 m m ( i d ) ：d e d i c a t e d s a m p l e c l e a n u p s y s t e m ( d s c s ) m o d e l1 8 l , - m l s ( l a b s e r v i c e a n a l 州c a ) ，凝胶柱为4 5 0 r a m 1 0 m m ( i d ) 这些半自动凝胶色谱仪 采用手动进样的方法，使用较大体积的注射嚣( 1 0 m 1 ) 将样品注入六通阀，操作相对困难，同时 操作人员直接接触有机溶剂，对健康存在定危害。j a m e s 等改进了进样的方法，用泵代替了注 射器实现了进样过程自动化，不仅减少了有机溶剂对操作人员的危害，而且避免了手动进样产生 的误差。目前，由于这种仪器组装简便，使用效果较好，成本低，并且可以人为控制多种色谱条 件，因此仍然普遍使用。 6 1 4 2 全自动凝胶色谱仪 这种仪器实现了包括进样、检测和组分收集等全过程自动化。利用泵将样品吸入定量环，通 过不同阀门之间的切换改变流动相的路径，在流动相的推动下，样品上到凝胶色谱柱上，流出组 分通过紫外检钡i 器检测确定流出体积，由自动的组分收集器按照设置的程序自动收集所需组分。 这种仪器有g p ca u t o p r e p1 0 0 2 ，配备大的凝胶分析柱( 6 0e m x 2 5c m ) ，进样体积为5m l ，流 速为5m i j m l n ，分析一个样品大约需要4 0 0m l 溶剂，耗时1 小时。j o h nr p a u e r s o n 改进了凝胶 柱的规格，用1 0m m 内径的凝胶分析柱替代了传统的分析柱，节省溶剂和分析时间。随后开发的 全自动凝胶色谱仪都注意使用小型高效的凝胶色谱分析柱，并减小上样体积。如w a t e r e n v i o g e l t m ，用于环境样品的净化，可以节省5 0 的溶剂和时间，进样体积仅为2 m l ：j 2 公司研 制的a c c u p r e p t m 全自动样品净化系统配合高效快速的e x p r e s s t m 柱( 3 0 0 x 1 0 m m ) 可以处理含有 5 0 0m g 的脂肪样品。另外，有些凝胶色谱仪上还配备其他辅助的装置，如：g p c 系统6 0 1 g p c a u t o v a ps y s t e m ( f r o ma n a l y t i c a lb i o - c h e m i s t r yl a b o r a t o r i e s ) 。包括在线的溶剂浓缩装置， 样品净化后自动收集并浓缩。 1 5 现代农药残留分析检测技术 农药残留分析检测的农药种类很多。随着分析仪器的发展和分析水平的提高，农药残留分析 从只检测一种或几种农药，发展到对不同品种上百种农药同时分析，即农药多残留分析。 农药残留分析中常用的检测方法为气相色谱法和高效液相色谱法。当检测的农药种类较多且 塾质复杂、干扰严重时，容易造成待测组分之间分离度不高，或者背景干扰增强，因此。定性和 定虽分析的难度较大。多维气相色谱技术、气相色谱一质谱联用技术等可以较好的解决多残留分 析中准确定性定量的问题。 多雉色谱系统包括多种方式：常用的有多柱系统和多检测器系统两种形式。 色，质联用技术是一种具有很强定性分析能力的检测技术，他结合了色谱法和质谱通用性检 测器的优势以及准确的结构鉴定能力，是一种高分辨力、高灵敏度和准确度的检测技术；配合标 准谱库进行检索，更增强了定性分析的准确性。g c - m s 的分析技术又分为全扫描检测技术、选 择离子检测技术、多级质谱检测技术。目前农药多残留分析最常用的是选择离子检测技术( s i m ) ， 选择离子检测增强了质谱的选择性和抗干扰能力，提高了检测的灵敏度。多级质谱的优势在于能 提供足够的化台物结构信息，特征母离子和子离子的一一对应性使之排除干扰能力增强，用于定 性分析准确可靠；因此，特别适用于背景干扰严重、定性匿难、被测化合物含量很低的样品，是 权威检测机关进行仲裁分析的有效手段。 g c - m s 具有强大的定性、定量检测优势，已经成为农药残留分析中一种最有效、最重要的 检测技术。 7 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 1 6 第一章小结 综上所述，凝胶色谱法( g p c ) 是一种适合于各类样品净化的前处理技术，尤其对含高油脂 样品的净化更为有效。众多研究结果显示，农药残留分析中，采用凝胶色谱法进行样品净化，不 仅净化效果好，并且实验结果能够满足农药残留分析的要求。自动化的凝胶色谱仪解决了样品前 处理过程主要依靠人工操作来完成的问题，可批量处理多个样品，节省人力、物力、财力。 然而。以往有关g p c 与农药残留分析的研究报道，多为应用g p c 净化基质共萃物，对g p c 净化作用以及各种影响因素缺少系统研究；对不同类型的农药以及农药残留分析中的各种农产品 共摹杂质在g p c 上的色谱行为也未见报道。因此在农药残留样品净化中存在盲目性。 本课题将系统研究各种色谱条件对凝胶色谱净化效果的影响，为g p c 在农药残留分析中的 应用提供依据。研制自动化小型化凝胶色谱仪，提高样品前处理自动化程度，使之省时，省力 减少溶剂消耗，减轻对环境的污染。直接使用研制的凝胶色谱仪进行蔬菜样本净化，并对多种残 留农药进行分析。 本论文是国家“十五”科技攻关重大专项子课题中“自动化凝胶色谱仪的研制和开发”的基 础研究部分，另外包括仪器的辅助设计及调试：小型凝胶分析柱的研制；主要技术指标测试等相 关一r 作。 8 中国农业大学硕士学位论文 第二章实验设计 第二章实验设计 2 1 研究目标 系统研究各种色谱条件对凝胶色谱净化效果的影响：研究不同类型、不同分子量、不同结构 的农药分子在不同溶剂体系中保留体积的差别；讨论影响化合物在凝胶色谱中色谱行为的因素； 设计农药残留样品净化用的自动化凝胶色谱仪和小型高效的凝胶分析柱；选择适合的凝胶色谱体 系( 流动相，色谱柱类型，操作条件等) 净化蔬菜样品，对其中的残留农药进行分析。 2 2 研究意义 通过本文较为系统和全面的研究，初步总结山影响凝胶色谱净化效率的各种因素，解决以往 盎使用该方法进行样品净化时盲目摸索实验条件的弊端；研制自动化凝胶色谱仪和小型高效的凝 胶色谱分析柱样品进行净化，提高农药残留分析样品前处理的自动化程度，节省分析时间和分析 成本。 2 。3 研究内容及实验方案 2 3 1 影响凝胶色谱净化效果的影响因素研究 研究不同分子量、不同类型、不同结构的农药分子在凝胶色谱体系上的流出体积讨论农药 分了二住凝胶色谱体系中的色谱行为及其影响因素。 研究各种色谱条件：流动相、流动相流速、样品量等对凝胶色谱净化效果的影响 比较各种规格凝胶分析柱的净化效果、柱容量及使用条件的差别，制备适用于自动化设备的 小型凝胶分析柱。 选择常见的蔬菜样品，研究样品中各类杂质在凝胶色谱柱中的流出范围，比较色素类杂质在 不同流动相体系中的净化效果。 仪器设备：组装半自动凝胶色谱仪进行研究( 输液泵，凝胶色谱柱，紫外检测器，六通阀) 凝胶种类b i o b e a d ss - x 3 溶剂体系：a ，b ，c 三种溶剂，极性依次增强，用作凝胶色谱流动相 分析柱规格：2 5 0 m m 2 5 m m ( i d ) 、5 0 0 m m 1 0 m m ( i d ) 、2 5 0 m m 1 5 r a m ( i d ) 9 中国农业大学硕士学位论文 第二章实验设计 篇爿离i i 薯叠i i i i 嵩篇i 葺簟i i i i 篁赫赫i | 瞄黼葺i 嗣i i ? 1 1 1 一 代表缝杂袋：玉米浦 农蕊晶秘：见第三奄 2 3 2 仪器研制部分 辅助设计自动化凝胶色谱仪，制备小型商效的凝胶分析 主，测试主露的仪器性能指标 2 3 3j 篷用研究部分 摄据农药帮絷痿在凝羧分辑控审兹绦整体强，绫及凝菠色谱俸系辩杂葳( 溜蘧、色素落) 的 净化效泉，判断样晶中杂质干扰情况，采用凝胶色谱法净化蔬菜样品，并对其中的残留农药进行 癸薮。 样品净化方法： 对r 杂质含鬣较少的样晶，若娥留农药的分子相对较小、保留体积较大，采用凝胶色谱法可 敬塞除撵鑫孛太罄分大分予杂质，纛法挣纯的小分子焱矮哥鞋拳l 用选择瞧捡溅按零接除干扰，建 守简便脊效的农药多残留榉本净化和分析方法。 对予杂质古鬣较高的样品( 如菠菜，油菜，韭菜等) ，若残留的农药组分程凝胶色谱柱中傈 翻体积小且分布较宽( 如包括菊酸、有机磷、有机氯和氨基甲酸酯等多种农药) ，仅采用凝胶色 淆法举辘骞鼓去豫予撬杂壤，嚣踅瓣要缚台鞣辐萃敷技术进一步净诧。壤摆上述清浼，骄究在线 的g p c - - s p e 联用净化方法，建立种前处理净化过程自动化稷度较高、效果好的样品净化方法。 1 0 2 4 实验方案流程图 制各小型化高效的凝胶分析柱 l仪器调试，主要技术指标测定 选择适合的体系和操作条件，使用自动凝胶色谱仪， 净化各类蔬菜样品并进行农药残留分析 ，-r 中国农业大学硕士学位论文第三章研究影响凝胶色谱净化效果的影响因素 第三章研究影响凝胶色谱净化效果的影响因素 本章通过研究不同分子量、不同类型、不同结构的农药分子在凝胶色谱体系中的保留体积， 尝试从理论上解释影响农药分子凝胶色谱行为的各种因素。以分子较大的农药为标记物( m a k e r ) ， 比较不同色谱条件下凝胶色谱法对农产品中主要干扰杂质的净化效果。本章研究结果可以对采用 凝胶色谱法进行农药残留样品狰化给予一定的指导和数据支持。 3 1 实验仪器及试剂 3 1 1 农药标准品 17 种农药标准品，见实验方法3 2 2 ，中国检验检疫科学研究院提供 3 1 2 试剂及材料 分析纯：乙酸乙酯，环己烷，二氯甲烷，丙酮，无水硫酸钠 色谱纯：环已烷 混合溶液：a 、b 、c 、用作凝胶色谱流动相，极性依次增强 凝胶色谱填料：b i o b e a d ss - x 3 供试样品 玉米油；蔬菜样品( 菠菜、胡萝h 、西红柿、尖椒、圆白菜、茄子) 3 1 3 实验仪器 旋转蒸发仪：e y e l a n 一1 0 0 0 氮吹仪：h g c 1 2 常用玻璃仪器 半自动凝胶色谱仪：六遥阀、分析柱2 5 0 r a m x 2 5 m m ( i d ) 、输液泵、紫外检测器( 2 5 4 n m ) 、 n 2 0 0 0 色谱工作站 中国农业大学硕士学位论文 第兰章研究影响凝胶色谱净化效果的影响因索 紫外可见分光光度计( t 6 新世纪) v a r i a ng c3 8 0 0 s a t u r n2 0 0 0 气相色谱，质谱联用仪 3 2 实验方法 3 2 1 不同流动相体系中凝胶溶涨系数的测定及孔径变化的研究 称取2 0 0 0g 凝胶于1 0 0m l 量桶中，在三种流动相体系中充分浸泡过夜，浸泡过程中反复 混合使之溶胀均匀，测最凝胶填料部分的体积，计算凝胶在不同流动相中的溶胀系数。 实验过程中采用湿法装柱法装填凝胶分析柱。凝胶分析柱装填好后，用流动相在低流速下充 分平衡，平衡过程中，需要测量并监控流动相流量的稳定性，避免因为流速不稳定造成化合物保 留时间( 保留体积) 偏移，影响分析结果的准确性。以氟胺氰菊酯作为参照化合物，每两小时进 样分析至参照化合物保留体积不变，则整个系统充分平衡，可以进行后续的实验。 根据不同溶剂中凝胶的溶胀系数，选择两种极性差别较大的溶剂体系，研究标准化合物( 邻 苯二甲酸二取代酯系列化合物) 的保留体积的变化，并推断凝胶孔径变化的趋势。 3 2 ，2 农药分子在凝胶色谱柱中保留体积的研究 ( 1 ) 选择1 7 种不同种类农药其分子量范围在1 4 1 5 0 5 之间，配成浓度为1 0r n g ，k g 的混 合标准溶液，用半自动凝胶色谱仪，2 5 0 r a m x 2 5 r a m 的分析柱研究农药在三种流动相体系中的保 留体积和流出顺序。流动相以2m l m i n 速度淋洗，根据紫外吸收图谱判断农药分子的大致保留 体积范嗣( 5 0 - - 1 0 0m l ) 。再次进样，从第5 0m l 开始，每2m l 收集一次，用g c 4 m s s i s 法 检测每个收集瓶中的农药种类，以农药的保留体积和蜂面积作图。确定每种流动相中各个农药的 保留体积和流出顺序。 ( 2 ) 在两种极性差别较大的流动相体系中( a 和c ) ，建立邻苯二甲酸二取代酯系列化台物 的保留体积和分子量对数之间的线性关系，根据此线性方程，以农药的分子量计算其保留体积 v s ( 忽略农药分子体积等自身因素的影响) ，比较实际保留体积v x 与v s 之间的差别，研究农药 分子结构、体积等因素对他们在凝胶色谱上保留体积和流出顺序的影响。 3 2 3 不同色谱条件对油脂和农药的分离效果研究 通过对不同杂质和农药在凝胶分析柱中保留体积的分析，发现在所研究的备类杂质中，油脂 类杂质比其他类型杂质的保留体积小，而在各种农药中，以分子量相对较大的菊酯类农药最先流 出色谱柱( 其中，氟胺氰菊酯在所研究农药分子中最早流出) ，所以选择氟胺氰菊酯为参考化台 物，以玉米油代表油脂类杂质，利用半自动凝胶色谱仪，在每种流动相体系中，研究样品量和流 1 3 动相流速两个主要色谱条件对净化效率的影响，再比较三种流动相体系对油脂类杂质的净化效 奎。 分别配制氟胺氰菊酯标准溶液( 1 0 m g k g ) ，纯玉米油( 杂质) 溶液( 0 2 5 9 m l 、0 5 9 m l 、 0 1g m l ) 。 ( 1 ) 样品量对净化效果影响的研究：在恒定的流动相流速下，分别进样氟胺氰菊酯和各浓 度玉米油溶液2m l ，确定氟胺氰菊酯在每种流动相中的保留体积。对玉米油色谱峰进行积分， 确定其峰面积( a ) ，再以氟胺氰菊酯的起始流出时间作为积分终点，重新对玉米油色谱峰积分， 得到玉米油色谱峰的峰面积( a ) ，用公式3 1 计算该色谱条件下玉米油的净化效率侮个相同色谱 条件f 平行分析3 次) 。 玉米油净化率= 导1 0 0 ( 公式3 1 ) a ( 2 ) 流动相流速对净化效果影响的研究：本研究所选择的凝胶填料允许使用的流动相流速 范隔在1 5m i m i n 之间，使用2 5 0 r a m x 2 5 m m 分析柱，分别选择2m l l m i n ( 慢速) ，3m l m i n ( 中速) 。5m 1 j m i n ( 晟大流速) 的流动相流速，采用上述方法，在样品量相同的条件下，研究 流动相流速对净化效果的影响。 ( 3 ) 不同流动相体