（农业昆虫与害虫防治专业论文）菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒（CvBV）EP1+like基因家族序列分析及EP1+like+1基因表达研究.pdf

浙江人学顾l ：学位论义摘要 摘要 多分d n a 病毒( p o i y d n a v i m s ，p d v ) 是一类与寄生蜂有专性互惠共生关系的 特殊昆虫病毒，其基因的表达对抑制寄主免疫反应、保证寄生蜂卵发育有重要作 用。e 尸基因家族是茧蜂科昆虫所拥有的p d v ( 茧蜂病毒b r a c o v i m s ，b v ) 的一 个重要基因家族，具有重要的生理作用。本研究测定了菜蛾盘绒茧蜂病毒c 6 f e s 砌 w s 幻凰b r a c o v i m s ( c v b v ) e p jz 而如基因家族7 个基因的c d n a 全序列，并进行 了序列分析。在此基础上；将e 尸一j ，f 妇，( 剧吧j ) 基因与原核表达载体p e t - 2 8 a 和p e t - 3 0 a 连接，从而构建、筛选了高效表达重组载体p e t 2 8 e p l 1 ，并在大肠 杆菌中表达了e p l 1 融合蛋白。采用传统割胶回收的方法回收纯化表达蛋白，并 将纯化后的蛋白免疫新西兰大耳兔；制备了抗e p l 1 多克隆抗体；以此多克隆抗 体为基础研究了e p ，基因在被寄生后寄主小菜蛾尸，“纪砌x 咖s f p 加幼虫体内的 蛋白含量变化；最后利用荧光定量p c r 分析了e p 工j 基因在寄主小菜蛾体内的转 录动态。 本研究的主要结果如下： ( 1 ) 应用c d n a 末端快速扩增技术( r a c e ) 的方法获得了口j ，f 妇基因 家族7 个基因的c d n a 序列全长，相关推导蛋白氨基酸序列的翻译后加工和信号 肽的预测分别采用网上搜索工具e x p a s y 和s i g n a l p 软件，发现c v b v 编码的e p 1 l i k e 蛋白中虽然不存在保守功能域但n 端都具有一个信号肽编码序列和众多的理 论蛋白质修饰和功能位点。在利用b l a s t p 搜索获得同源蛋白后构建了以氨基酸 序列为基础的进化树，由此发现c v b v 编码的该基因家族成员之间关系并不密切， 同时整个p d v 编码的该基因家族成员之间可以划分成4 个类群，其中e p l 1 和 e p l 2 ，e p l 3 和e p l 4 分别处于同一类群，但它们位于不同分支上。另外，e p l 5 和c c b ve a r l y e x p r e s s e d 蛋白处于同一类群；e p l 一7 与部分g i b v 和c c b v 蛋白处 于同一类群。 ( 2 ) 将p c r 扩增得到e 儿j 基因o i 疆( 9 2 1 b p ) 克隆到表达载体p e t - 2 8 a 和p e t - 3 0 a 中，构建并筛选了高效表达重组载体p e t 2 8 e p l 1 ，在i p t g 进行诱 导的情况下，正确表达了分子量为3 4 8 k d a 的重组融合蛋白。在大量表达e p l 1 蛋白的基础上，通过传统割胶回收、电透析的方法纯化表达蛋白并免疫新西兰大 耳兔，制备了抗e p l l 蛋白的多克隆抗体( 效价1 ：1 2 8 ，0 0 0 ) ，同时用w e s t 锄b 1 0 t 检测了抗体的特异性。 ( 3 ) 以制备的抗e p l 1 多克隆抗体为一抗，间接e u s a 法检测小菜蛾幼虫 浙江人学坝i ：学位论文 摘要 体内e p l 一1 蛋白含量变化。结果表明在被寄生的小菜蛾幼虫血浆和血细胞内 e p l 1 蛋白的含量都随时间的延长而增加，在寄生后第6 天达到峰值。 ( 4 ) 利用荧光定量p c r 分析了c v b ve 扎j 基因在寄主小菜蛾体内的转录 动态，发现在被寄生6 天内的小菜蛾幼虫体内都可以检测到e 儿j 基因的转录， 但是在寄生后寄主体内e 儿一j 基因的转录出现了2 次转录高峰( 2dp p 和5dp p ) ； 具体至寄生后寄主的脑、血淋巴和中肠时又发现其转录模式各不相同：在寄生后 2 h 就能检测到该基因在寄主脑组织内的转录，转录高峰出现在1 2hp p ，此后转 录水平迅速降低；在寄生后6 h 就能检测到该基因在寄主中肠中的转录，转录高峰 出现在1 2hp p ，此后转录水平逐渐减低；在寄生后1 2 h 就能检测到该基因在寄 主血淋巴中的转录，同时转录水平在寄生后的6 d 内持续上升。所以e p ，基因 在小菜蛾幼虫血淋巴内的转录水平是随着寄生后时间的延长而提高，这与e p l 1 蛋白的含量变化动态相一致。 关键词：菜蛾盘绒茧蜂病毒( c v b v ) ，凹j ，f 妇基因家族，序列分析，凹三一| 7 基 因，克隆，原核表达，多克隆抗体，蛋白含量变化，转录动态 i l i 浙江人学顺i ：学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t p o l y d n a v i m s ( p d v ) i sak i n do fs p e c i a li n s e c tv i r u s e sw h i c hs h a r e sas y m b i o t i c a i l dm u t u a l i s t i cr e l a t i o n s h i pw i t hs o m eh y m e n o p e r a l le n d o p a r a l s i t i o d s t h ee x p r e s s i o n o fm ep d vg e n e si nm eh o s ti sv e d ，i m p o r t a n tf o rd i s r u p t i n gh o s ti m m u n i t ) ra n d p r o t e c t i n gt l l ed e v e l o p i n go fe n d o p a r a s i t i o d s e g g s 上 pg e n ef 吼i l y ；w l l i c hh a sv e r y i m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a ln m c t i o n s ，i so n eo ft h em o s ti m p o l l a n tg e n ef 抽i l i e so f b r a c o v i m s e s i nm i st l l e s i s ，w es e q u e n c e da l l da i l a l y s e d7g e n e so ft l l ee 尸一，f 妇g e n e f 锄i l yo fc d f e s 砌1 ，p s f 口凰b r a c o v i r u s ( c v b v ) ，o n eo fw h i c h ，凹- ，z f 拓jg e n e ( e 彪n w a st h e nc l o n e di n t op e t - 2 8 aa n dp e t - 3 0 ap r o k a r ) ，o t i ce x p r e s s i v ev e c t o r s ，a 1 1 dt h e c o n s t r u c t e dr e c o m b i n a mp l a s m i d s p e t 2 8 - e p l 一1w e r e 仃觚s f o m e di m ot h eh o s t b a c t e r i ae 以b l 21 t h ee x p r e s s i v ep r o d u c ti n d u c e db yi p t gw a si d e n t i f i e db y s d s 一陬g ea n dw e s t e mb l o ta i l a l y s i s n ep r o d u c e dp r o t e i n 、惴p 嘶f i e da n dt h e n 蜥e c t e di n t on e wz e a l a n dr a b b i tt oi n d u c ei n u n u n es e r u m ( p o l y c l o 叫a n t i b o d y ) ， w h i c hw e r eu s e dt oa n a l y s em ee x p r e s s i o nd y n a m i c so ft h ee p 一1l i k ep r o t e i n si nm e h o s t f i 盯【h e m o r e ，t h e 上；儿- ， g e n et r a n s c r i p t i o nd y n 锄i c si n t l l eh o s t 尸z “纪，肠 训d s 纪，肠l a r v a ew a sa n a l y s e db yq 啪t i t a t i v er e 2 l l - t i m ep c r m a i nr e s u l t sa r e s u m m a r i z e da sf 0 l l o w e d ： ( 1 ) t h e 如l lc d n as e q u e n c e so f7 点尸- ，f 妇g e n e so fc v b vw e r eo b t a i n e du s i n g r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ( r a c e ) a n dm e i rs i g n a lp 印t i d e s ，m o d i f i c a t i o n a 1 1 d 凡c t i o n a ls i t e sw e r ep r e d i c t e du s i n ge x p a s yt o o la n ds i g i l a i ps o 胁a r e t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ei sn oc o n s e r v e dd o m a i nb u to n es i 盟a lp e p t i d ei ne a c h 上尸j f 池g e n e jt h e r ea r eal o to fm o d i f i c a t i o na i l df h c t i o n a ls i t e si n 点尸- j 舭pg e n e 细 i l i l y f o rp h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，ad i s 仞n c et r e ew a sg e n e r a t e du s i n gp a u p 宰4 0 丘o mt h e a l i g m e n to ft h eh o m o l o g o u sp r o t e i ns e q u e n c e sr e t r i e v e db yb l a s t pa n a l y s i su s i n g c v b ve p la sq u e r y t h er e s u l ts h o w e dm a tt h e r ei sn oe v i d e n tc l o s eh o m o l o g i c a l r e l a t i o n s h i p sa m o n gt h e 凹- j ，池g e n e s ，w h i c hc a nb ea t t r i b u t e dt o4d i 虢r e n tc l a d e s ： ( 1 ) e p l 一1a n de p l - 2 ，( 2 ) e p l 一3a n de p l - 4 ，( 3 ) e p l - 5a n dc c b ve a r l y e x p r e s s e d p r o t e i n ，a n d ( 4 ) e p l - 7a n ds o m eg i b va n dc c b vs e q u e n c e s ( 2 ) t h eo r f o ft h ec v b ve 儿一，g e n e 、v a s 绷p l i f i e d b yp c r ；i t ss i z ei s9 21b p i v 浙江大学硕l ：学位论义a b s t f a c t t l l eg e n ew a sc l o n e di n t op e t - 2 8 a 雒dp e t 3 0 ap r o k a 巧o t i ce x p r e s s i v ev e c t o r s ，a i l d t l l ec o n s t m c t e dr e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t 2 8 一e p l - 1w a u ss e l e 鼬e d 觚d 订眦s f 0 肌e di n t o t h eh o s tb a c t e r i ae c o nb l 2ld e 3 t h ee x p r e s s i v ep r o d u c ti r l d u c e db yi p t gw a s i d e n t i f i e db ys d s - p a g ea i l dw e s t e mb l o t 觚a l y s i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm e r e c o m b i n a l l tv e c t o rp e t 2 8 - e p l lp r o d u c e da3 4 8 k d ai n c l u s i o nb o d yp r o t e i n ，w h i c h w a sp u r i n e da n dt h e ni n j e c t e di n t on e wz e a l a i l dra _ b b i tt 0i n d u c ei m m u n es e n m 】 ( p o l y c l o n a la 1 1 t i b o d y ) e l i s aa n a l y s i ss h o w e dt h a tm e t i t e rf o r 1 ep o l y c l o n a la n t i b o d y w a s1 ：12 8 ，0 0 0 w e s t e mb l o t 趴a l y s i ss h o w e dt l l a tt h e 锄t i b o d yc o u l dr e a c ts p e c i f i c a l l y w i t ht h ee p l lp r o t e i n ( 3 ) t h ee x p r e s s i o nd y n 锄i c so fc v b ve p l - 1p r o t e i ni i lh o s t 尸玩纪砌砂肠j 胞肋 l a r v a ew e r ea n a l y z e du s i n gt h ee p l - 1p o l y c l o n a l 觚t i b o d y n er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e e x p r e s s i o ni n c r e a s e sg r a d u a l l ya r e rp a r 嬲i t i z a t i o n e x p r e s s i o nc 觚b ed e t e c t e di n p l a s m a1d a yp o s t - p a r a s i t i z a t i o n ( p p ) a n di nh e m o c y t e s3d a y sp p e x p r e s s i o np e a k a p p e a r e da t6dp p b o t hi np l a s m aa n dh e m o c y t e s ( 4 ) t h et r a n s c r i p t i o nd y n 锄i c so fc v b ve 儿一jg e n ei nh o s t 尸，“纪肋砂z o s 胞砌 l a a ew e r ea n a l y z e du s i n gq u a n t i t a t i v er e a l t i m ep c r n l er e s u l t ss h o w e dt l l a te 儿一j g e n et r a n s c r i p t sc a l lb ed e t e c t e di nt i l eh o s tl a r v 嬲e a r l y 弱2 hp p a n dc o m i n u e dt o b ed e t e c t a b l ef b r6d a y sp p t h e r ea r e 似ot r a n s c r i p t i o np ea ：k si nm eh o s t ( 2d p p a n d 5dp p ) b u tt h ep a n e m so ft r a j l s c r i p t i o nd y n 锄i c sa r ed i 疵r e n ti nd i 虢r e n tt i s s u e s i n b r a i n ，t r a n s c r i p t i o nw a sd e t e c t e da t2 hp p 锄dm ep e a k 印p e a r e da t12 hp p i nm i d g u t ， t r a n s c r i p t i o nw a sd e t e c t e da t6 hp p a n dm ep e a k 印p e a r e da t2 4 hp p i nh e m o l y m p h ， t r a n s c r i p t i o nw a sd e t e c t e da t12 hp p a n dt 1 1 ep e d ka p p e a r e da t6d a y sp p t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h et r a n s c r i p t i o ni n c r e a s e sg r a d u a l l ya r e rp a r a s i t i z a t i o n t h et 眦s c r i p t i o n d y n a m i c so fj 凹一，g e n ec o r r e s p o n d st ot h ee x p r e s s i o nd y n a m i c so fe p l - 1p r o t e i n k e yw o r d s ：c v b v ；e i p ，池g e n ef - a m i l y ；s e q u e n c ea n a l y s i s ；e 兕- jg e n e ；c l o n e ； p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；p o l y c l o n a la n t i b o d y ；c h a i l g eo fp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n ； t r a n s c r i p t i o nd y n 锄i c s v 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：嘉? i ? 妈链签字同期：3 加霹歹月，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解浙江大学有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江大学可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 善l 鹕缸 签字同期：2 开5 年占月，同 翮繇黟压 签字日期：2 蚰了年6 月日 浙江大学硕i ：学位论文 致谢 致谢 本论文是在导师陈学新教授的悉心指导下完成的陈老师不但是治学上的严师，也是生 活上的益友。在两年研究生生活中，陈老师不仅对我的实验提供了大量的指导，还经常关心 我的学习和生活两年来，导师严谨的治学态度、渊博的学识和敏锐的学术思想深深地影响 着我，激励我不断进取，他对事业的执着追求精神永远是我学习的榜样本实验从始至终的 每一个环节，都凝聚着陈老师大量的心血和汗水值此论文完成之际，谨向陈老师表达我最 诚挚的谢意和最崇高的敬意 在研究过程中，本所的何俊华教授以其渊博的学识，耐心、细致地为我答疑解感，在生 活上也给予了我亲切的关怀和无私的帮助，令我非常钦佩和感动；师姐时敏在实验上给予了 大量的指导和帮助，在论文写作方面也给予了极大的帮助；本所张传溪教授和沈志成教授惠 赠了部分实验用材料和试剂，确保了实验的顺利进行；农业与生物技术学院张宪银老师、生 物所吴建祥老师、陈正贤老师热忱地给予了实验仪器使用上的指导和帮助在此，向他们致 以最衷心的感谢! 两年来，我得到了实验室许多师兄师姐和同学在生活上的关怀和实验上的热情帮助。师 兄陈亚锋对实验给予了大量的指导；师兄孟祥锋、魏书军、徐鹏、刘经贤，师姐张红英、黄 芳、郭近，同学曹婷婷、朱兰兰，师弟姜鹏，师妹杨艳艳、王漫漫和留学生f a r r a h 也给予了 我大量生活上的帮助。在此，向他们表示我最衷心的感谢同时要感谢为本研究提供了大量 帮助的实习生姚远、侯守鹏、鲁专、王光耀、朱艺勇、陆筱莹等同学 在两年的硕士学习和研究期间，本所程家安教授、刘树生教授、施祖华教授、娄永根教 授、莫建初教授、祝增荣教授、唐启义教授、蒋明星教授和余虹副教授在论文的开题报告、 读书报告，预答辩以及学习和实验中给予了热心指导和帮助；马云老师在生活上给予了我很 多鼓励、指导和帮助；植保系芮开宁老师在我学习期间给予了热情帮助：植保系和研究生科 的许多老师也为我提供了研究的方便条件。在此，向他们表示我最真诚的谢意! 同时，要感谢室友尉吉乾、黄锦明和隋晓斐两年来给予我的热心照顾和关心。 本实验和论文得以顺利完成，离不开我的父母和家人对我始终如一的支持和鼓励。感谢 我的父母和亲友对我的理解和支持，他们始终如一的关心和爱护使我能安心学习，不断进取 在这里也一并向前面未提及的，多年来一直关心和帮助我的许多老师、同学和朋友表示感谢。 再次，向所有关心和帮助我的人表示深深的谢意! 刘鹏程 2 0 0 8 年5 月于华家池 浙江人学顾l ：学位论义引言 引言 小菜蛾尸z “胞妇砂f d s 饱肠l 属鳞翅目l e p i d o p t e r a 菜蛾科p l u t e l l i d a e ，主要危害 油菜、甘蓝、白菜、萝卜等十字花科蔬菜，近年来发生范围越来越大，频率越来 越高，一直是世界上最难对付的害虫之一，造成蔬菜产量损失巨大，作为世界性 的重要害虫，对它的防治已成为困扰世界上许多国家和地区的难题小菜蛾环境 适应能力很强，不仅对许多化学农药产生了很高的抗性，而且对生物制剂b t 和 对天敌较安全的阿维菌素也能产生抗性( 闰艳春等，1 9 9 7 ；黄建和吴文君，2 0 0 3 ) ， 至今缺乏有效的防治措施。因此，充分发挥天敌的控害作用在害虫的综合治理中 就显得更为重要。 寄生蜂是膜翅目昆虫中的重要类群，种类繁多，数量巨大，其成虫阶段营自 由生活，但幼虫期营寄生生活，一般在寄生生活结束时杀死寄主( a s k e w ，1 9 7 1 ) 。 因此，寄生蜂是农林牧业害虫的重要天敌，在害虫生物防治、害虫种群控制和维 持生态平衡上起着很重要的作用。 菜蛾盘绒茧蜂c d f p j 砌v p s 胁胁h a l i d a y 属膜翅目h y m e n o p t e r a 茧蜂科 b r a c o n i d a e ，是小菜蛾幼虫的容性内寄生蜂，田问分布广，其自然寄生率可达 2 0 6 0 ，有时甚至高达8 0 以上( 汪信庚等，1 9 9 8 ) ，被视为小菜蛾的优势 种天敌，在小菜蛾的综合治理中有着广阔的应用前景。因此研究菜蛾盘绒茧蜂和 小菜蛾之间的生理互作关系可以为小菜蛾的综合治理提供更多有价值的理论依据 和有指导意义的方法。 菜蛾盘绒茧蜂所含的寄生调控因子主要包括多分d n a 病毒( p o l y d n a v i m s ， p d v ) 、毒液( v e n o m ) 和畸形细胞( t e r a t o c y t e ) 。其中p d v 是一类与寄生蜂有专 性互惠共生关系的特殊昆虫病毒。在寄生过程中，寄生蜂将p d v 注入寄主体内来 扰乱其生理和免疫以保证寄生蜂后代的存活。 近年来，本实验室以菜蛾盘绒茧蜂和寄主小菜蛾作为寄生体系，对二者之间 的互作关系进行了系统的研究，包括毒液( 潘健和陈学新，2 0 0 3 ；潘健等，2 0 0 4 ； y up ，以，2 0 0 7 ) 、p d v ( 刘鹏程等，2 0 0 8 ；c h e ne f 口f ，2 0 0 7 ；s 1 1 ie f 以，2 0 0 8 ) 和畸 形细胞( 白素芬等，2 0 0 3 ) 等寄生因子的寄生辅助作用，获得了一定的进展。 对于p d v 编码的各个基因家族结构和功能的研究主要集中于姬蜂病毒( i v ) 的垆m o r 班陀p 和v f 以玎e x f h 基因家族和茧蜂病毒( b v ) 的p t p 基因家族( b l i s s a r d 浙江大学硕。i j 学位论文引言 p r 口，19 8 7 ；c u ia n dw 色b b ，19 9 6 ；d i b h 蛳p f 口，19 9 3 ；t h e i l m 锄a n ds u m m e r s ， 1 9 8 8 ；t u m b u l la n dw e b b ，2 0 0 2 ；c h e n 甜口f ，2 0 0 3 ；m a j v ap f 以，2 0 0 4 ) ，但对b v 中 的e 尸基因家族的研究仅限于获得集聚绒茧蜂病毒c 6 把s 砌馏他弘胁b r a c o v i m s ( c c b v ) 编码的e p 蛋白的编码序列和在寄主体内含量变化情况( h a r 、o da i l d b e c k a g e ，l9 9 4 ；h a r w o o dp f 口，19 9 8 ) 本研究利用c d n a 末端快速扩增技术( r a c e ) 的方法获得了菜蛾盘绒茧蜂 病毒c d f p s 妇v 嚣胁，如b r a c o v i r u s ( c v b v ) 的上p ，f 妇基因家族的7 个基因成员的 c d n a 全长，全面分析了该基因家族成员的基因结构和与其他p d v 编码的e p l 蛋白同源关系，并由原核表达产物制备了其中一个成员( e p - j ，如，基因) 的多 克隆抗体，在此基础上研究了e p 1 l i k e1 蛋白在寄主小菜蛾幼虫体内的含量变化 动态。同时，又以荧光定量p c r ( q u a n t i t a t i v er e a l - t i m ep c r ) 研究了e p j ，z 妇， 基因在寄生后不同寄主组织内的转录动态通过本研究使我们对c v b v 的e 儿基 因家族有了更深入的了解，为e 尸，池基因家族的进化特征以及具体的生理功能 提供了新的实验证据，并为利用c v b v 对小菜蛾的控害潜能得以更有效的发挥， 为提高小菜蛾生物防治水平提供理论依据，开拓了害虫防治的新途径。 2 浙江大学硕：卜学位论文 第一章文献综述 寄生蜂产卵寄生后，蜂卵首先会面临被寄主免疫防御杀死的威胁，一些膜翅 目茧蜂和姬蜂针对此，进化产生了相应的策略进行免疫抑制，如多分d n a 病毒 ( p o l y d n a v i m s ；p d v ) 的获得。p d v 是一类特殊的病毒，目前，仅在膜翅目茧 蜂科和姬蜂科寄生蜂中发现有这类共生体病毒p d v 。依据宿主类别，将多分d n a 病毒科划分为姬蜂病毒属i c h o v i m s ( i v ) 和茧蜂病毒属b r a c o v i m s ( b v ) ( s t o l t z p f 以，1 9 9 5 ) ，两类病毒不仅形态差异较大，而且从进化上分析也无相关性 ( m i t 6 e l d 1 9 9 7 ) 。 p d v 病毒粒子贮藏在寄生蜂雌蜂卵巢的萼腔内，寄生时将含有p d v 病毒粒 子的萼液随蜂卵一同注入寄主体内p d v 对寄主免疫反应抑制和幼蜂的存活是至 关重要的( s t e l l e re f 口f ，1 9 9 8 ) ，在缺乏p d v 时，蜂卵被包囊，并被寄主血细胞杀 死；但若有p d v 存在时，则后代得以存活( s t m d 觚dn o d a ，1 9 9 l ；a s g a r ie f 口f ， 1 9 9 7 ) 。目前已对5 0 多种寄生蜂的p d v 特性进行了较详细的描述，预计3 万多种 寄生蜂携带p d v ( w 曲b ，1 9 9 8 ) 。p d v 单独或协同其它寄生因子有效地抑制寄主 的免疫( l u c l ( 1 1 a na i l dw 曲b ，1 9 9 6 ) ，和调节寄主的生理，以确保寄生蜂的成功发 育( l a v i n ea 1 1 db e c k a g e ，1 9 9 5 ；w 曲b ，1 9 9 8 ) 。 p d v 病毒粒子具有与普通病毒相似的组成结构，如内部核酸，外包有衣壳， 一个或多个核衣壳外包裹有单层或双层的蛋白膜，有的p d v 病毒粒子具尾( b u r o n a j l db e c k a g e ，1 9 9 2 ) 。p d v 的基因组非常特殊，而且在不同寄生蜂一寄主体系中基 因表达方式、表达部位等都存在很大差异，有种的特异性，但亲源关系相近的种 类其p d v 的d n a 序列同源性也高，至少盘绒茧蜂属c d 纪s 妇中茧蜂所拥有的p d v 是单系发育，有证据表明，寄生蜂和p d v 的系统发育是共同进行的( i t f i e l dp f 以，2 0 0 0 ) 。 1 多分d n a 病毒( p d v ) 基本生物学特征 1 1p d v 的生活史 p d v 的生活周期涉及病毒的复制、传播和侵染三个部分。p d v 以原病毒 ( p r o v i r u s ) 的形式线性整合在寄生蜂基因组中，并通过生殖细胞垂直传播给后代， 这种传播符合孟德尔遗传定律。雄蜂也能通过交配将其所含病毒基因组交换给下 一代雌蜂( s t o l t z ，1 9 9 0 ；s t o l t zp ，口f ，1 9 8 6 ) 。p d v 在雌蜂输卵管萼，萼腺细胞核内 浙江大学硕l ：学位论文第一章文献综述 进行病毒复制( 蛹一成虫) ，萼腺细胞产生的病毒粒子以出芽( 姬蜂病毒) 或以细 胞裂解( 茧蜂病毒) 的方式释放到萼腔，并随雌蜂产卵时注入到寄主卵或幼虫中 ( s t o l t zp ，口f ，1 9 9 5 ；w 曲b ，1 9 9 8 ) 。在鳞翅目寄主中p d v 不复制，只进行基因的表 达( w 曲b ，1 9 9 8 ) 。概况起来，p d v 基因表达有三种类型，一种只在寄生蜂中表 达( c l a s si ) ，主要用来装配病毒粒子；一种只在寄生寄主中表达( c l 嬲si i ) ， 其基因表达产物发挥对寄主的生理调节作用；还有一种在寄生蜂和寄生寄主中都 表达( c l a a si n ) ( t h e i l m a l l l la n ds u m m e r s ，1 9 8 7 ) 。绝大多数情况下，p d v 在寄生 蜂和寄主分别表达不同的基因，如一个6 9 9 b p 互补d n a 编码的p 1 2 病毒结构蛋 白在p d v 病毒粒子开始复制才能检测到，但在非复制期的姬蜂和寄生的鳞翅目组 织中通过w e s t e mb l o t 则检测不出( d e n g 锄dw r e b b ，1 9 9 9 ) 。 1 2p d v 基因组 p d v 基因组通常由1 0 5 6 个分节、大小在2 4 0 k b 的环状、双链d n a 构成， 是一类唯一分节的d n a 基因组病毒，总基因组大小约为7 5 2 5 0k b 。然而因片 段嵌套，d n a 片段的共迁移，以及基因组片段中复杂序列的同源性，使得对基因 组大小的精确测定有一定难度。迄今为止，科学家已成功测定了c c b v 、索诺齿 唇姬蜂病毒( c 册妒d 彪廊舳胛d 您，2 5 捃i c l l i l o v i m s ，c s ) 、毁侧沟茧蜂病毒( 朋i c 加p ，f 凰 出m d m d ，b r a c o v i m s ，m d b v ) 、聊d s o 把，垤谢v “si c h n o v i m s ( h f i v ) 、乃口职o s e m 口 膦护口彪i c h n o v i m s ( t r i v ) 和g 慨职7 乃聊咖阳，2 口pi c h n o v i r u s ( g f i v ) 这6 个p d v 的全基因组序列( e s p a g n ee f 口f ，2 0 0 4 ；w 曲be ta 1 ，2 0 0 6 ；t a n a k ae f 口f ，2 0 0 7 ； l a p o i n t ep r 以，2 0 0 7 ) 。基因组被认为发生在受侵染的寄生蜂种类的每一个细胞， 但病毒复制仅限于雌蜂蛹后期和成蜂的卵巢萼腺细胞内( f l e m i n ga n ds u m m e r s ， 1 9 9 1 ；a l b r e c h t 口r 口，1 9 9 4 ) 。 p d v 病毒基因组片段至少有两种类型：嵌套型( s e 鲫e n tn e s t i n g ) 和单一型 ( u i l i q u e ) ，片段嵌套即一些小的d n a 片段嵌入到大的d n a 片段上( c u ia i l dw 曲b ， 1 9 9 7 a ；x ua n ds t o l t z ，1 9 9 3 ) ，这样在没有增加病毒序列复杂性的前提下，增加了 p d v 的片段数量，并且嵌套确实在整个基因组增强了嵌入序列的表现度 ( r e p r e s e n t a t i o n ) ，导致病毒基因的扩增，这与在寄生寄主扩增基因的表达量增加 相联系；相反，单一型片段从寄生蜂基因组中切除，产生单个的病毒片段( w r e b b 眦dc u i ，1 9 9 8 ) ，显然至少有一些p d v 基因组是由嵌入的d n a 片段构成的。s t o l t z 和w h i t f i e l d ( 1 9 9 2 ) 指出p d v 独特的基因组结构( o r g a i l i z a t i o n ) 是与它们独特 浙江人学硕i ：学位论义第一章文献综述 的病毒生活史，即在寄生蜂一寄主中分别发挥不同功能造成的。 2p d v 基本生理功能 2 1 免疫抑制 p d v 进入寄主后首先攻击寄主血细胞，改变血细胞的行为( l a v i n e 孤d b e c k a g e ，1 9 9 5 ；s 仃a n da n dp e c h ，1 9 9 5 ) ，使其变圆，失去展形的能力，细胞的粘附 性丧失，不能对蜂卵进行有效的包囊，这种作用可能是永久的，也可能是瞬时的 如毁侧沟茧蜂病毒( m d b v ) ，5 个大小为0 4 ，1 0 ，1 5 ，1 8 和3 1 k b 位于片段o 的病毒m i a s 在寄主大豆夜蛾a p “却，姗妇拥c z “如珊血细胞中表达，这是一类 与表皮生长因子( e p i d e n n a lg r o hf a c t o r ) 相类似的e g f l i k e 基序的基因家族。 代表m d b v 的第二类基因家族，与膜有关的由5 1 5 个氨基酸组成的g l c l 8 蛋白， 是由6 个串联排列重复，侧区是疏水的n 端和c 端区域组成的高糖基化的核心。 经免疫组织化学研究表明，g l c l 8 定位于寄主血细胞的表面，m d b v 使侵染后的 血细胞失去对外物的附着能力( t r u d e a ue fa z ，2 0 0 0 ) 毁侧沟茧蜂寄生后，寄主 血浆无论在体内还是体外条件下，均未影响血细胞在异物上的延展( s t 啪d 甜以， 1 9 9 9 ) ，这表明m d b v 基因产物是通过在寄主血细胞内表达来抑制寄主血细胞的 包囊反应。但对于索诺齿唇姬蜂c 口聊p d 跆出j o ”d 旭门s 括和微红绒茧蜂c d 陀s 砌 厂“6 e c “肠而言，是由病毒基因产物分泌到寄生寄主的血浆中而使其血细胞的功能 受到破坏( l ia n dw 曲b ，1 9 9 4 ；a s g a r i 甜以，1 9 9 7 ) 只有具有转录活性的m d b v 侵染后才会使颗粒血胞发生程序化死亡和使浆 血胞失去粘附能力( s t r a n d ，1 9 9 4 ；s t r a n da i l dp e c h ，1 9 9 5 b ) 。毁侧沟茧蜂的p d v 进 入大豆夜蛾后，攻击颗粒血细胞，使其开始凋亡，不能参与包囊。此时细胞表面 起泡、染色质收缩，细胞d n a 分成2 0 0 b p 左右的小片段( s 仃a l l da n dp e c h ，1 9 9 5 b ) ； 经p d v 侵染后寄主浆血胞粘附能力的下降，主要是抑制了寄主诱导浆血胞粘附能 力的一个有2 3 个氨基酸组成的多肽p s p l ( p l a s m a t o c ”es p r e a d i n gp e p t i d e ) 的表 达( s t r a i l de ，口，1 9 9 9 ) 。目前已分离并测序了5 个在寄主血细胞中表达的病毒转 录产物，进一步功能方面的研究会帮助我们理解它是如何破坏寄主血细胞的免疫 功能。 索诺齿唇姬蜂病毒( c s i v ) 的两个富含半胱氨酸基序基因家族的基因参与寄 主的免疫抑制，基因产物v h v l 1 和v h v l 4 都是糖基化和分泌型的蛋白，特异结 浙江大学硕。l ：学位论文第一章文献综述 合在寄主的免疫细胞上( l ia n dw 曲b ，1 9 9 4 ；s o l d e v i l ae f 以，1 9 9 7 ；c u i 甜口7 ，1 9 9 7 ) 单独以c s 侵染，可引起烟芽夜蛾胁，f d 珐括v i 旭s c p 瑚血细胞骨架的改变，但在 寄生2 4 h 前没有作用( l u c k h a n 孤dw 曲b ，1 9 9 6 ) ，表明在其发生作用前，必须在 寄主血淋巴中进行累积( s o l d e v i l ap f 口f ，1 9 9 7 ) 。在寄生后6 h 的烟芽夜蛾血淋巴 中可检测到v h v l 1 和v h v l 4 蛋白，2 4 h 后达到峰值，约5 0 n “l ，并几乎在整 个幼蜂发育期保持该水平( l ia i i dw e b b ，1 9 9 4 ；c u i 甜以，1 9 9 7 ；s o l d e v i l a 甜口f ， 1 9 9 7 ) 。v h v l 4 在适合性寄主的表达与v h v l 1 相类似。尽管，v h v l 4 的蛋白在 非适合性寄主中也能检测到，然而该蛋白滴度是逐渐下降的，到寄生后的第9 d 已检测不出。v h v l 4 蛋白能结合在除烟草天蛾施行幽c 口s 麟，口外所有供试的夜蛾 类寄主的血细胞上。c s i v 在所有的寄生寄主组织中都能检测到，1 2 种病毒m i 埘a s 经分离，分属两个基因家族，富含半胱氨酸基序基因家族和比p 基因家族( s u m m e r s 锄dd i b - h 蛳，1 9 9 5 ；w 曲ba n dl u c k h 矾，1 9 9 4 ) 在适合性寄主中表达量多且稳定， 而在半一和非适应性寄主则随时间发生变化，其蛋白表达量下降具体表现为， 在适合性寄主中蜂卵和幼蜂均不被包囊；在非适合性寄主中蜂卵被包囊；而在半 适合性寄主则蜂卵未被包囊，但幼蜂被包囊，并且只有自然寄生寄主的发育才受 到抑制( c u ip ，口7 ，2 0 0 0 ) 。 茧蜂病毒和姬蜂病毒都能降低寄主血淋巴的黑化( s t o l t za i l dc o o k ，1 9 8 3 ； b e c k a g e 甜以，1 9 8 7 ) 。c s 是抑制寄主酚氧化酶p o 活性的因子( s h e l b y 甜 以，2 0 0 0 ) 。因此，在非适合性寄主中p o 活性的恢复可能与病毒基因的表达量下 降有关。 含有p d v 病毒的寄生蜂寄生后，虽能造成寄主的免疫能力下降，但这种抑制 作用具有时间性。一种棉铃虫齿唇姬蜂c 口，印d 纪廊c 乃幻，娩口p 寄生后，3 0 m i n 即可 在寄主棉铃虫胁? f v p p 口口，m 秘朋血细胞检测到病毒d n a ( c c i v ) ，并持续6 d ； c c i v 的转录产物在寄生后l 一5 d 持续进行。c c i v 基因的表达，能使蜂卵或注入 的s e p h a d e xg 1 0 珠子免受寄主血细胞的包囊。但在寄生后第4 d ，寄主的免疫能 力恢复( y i n8 f 口7 ，2 0 0 3