（免疫学专业论文）小鼠胸腺发育相关新基因——ih1功能的初步研究.pdf

中文摘要 小鼠胸腺发育相关新基因矾1 功能的初步研究 硕士生： 导师：何维教授 李春满 崔莲仙教授 胸腺是机体重要的中枢免疫器官，是t 淋巴细胞发育成熟的主要场所。t 祖细 胞从骨髓或胚胎期的胚肝进入胸腺，增殖分化，经历阳性选择和阴性选择，最终有 5 左右成为成熟的t 淋巴细胞并输出到外周淋巴器官发挥免疫应答功能。在机体衰 老过程中，胸腺比其它器官番现出更明显的增龄性退化。为了从基因水平探讨胸腺退 化对胸腺细胞发育的影响，冲誊翮曾采用差异显示反转录( d d r t p e r ) 技术对1 月龄 和1 0 月龄小鼠胸腺m r n a 差异表达情况进行分析，并利用其中一段在1 月龄小鼠胸 腺高表达的e s t 成功地克隆了一条新基因一m - 1 。 f 1 h 1 基因全长1 0 0 1 b p ，编码2 4 3 个氨基酸，g e n b a n k 登录号为a f 5 0 3 9 4 2 。本 文府其功能进行了初步研究。第一，我们构建了m 1 基因的原核表达载体并在大肠 杆菌b l 2 i 中得到表达；第二，利用e y f p 荧光表达载体对珊- 1 编码产物在真核细胞 内的定位进行分析，表明m 1 蛋白分布在胞浆；第三，多组织膜n o r t h e r n 杂交显示， i h l 基因在1 月龄小鼠的睾丸、脑、胸腺、肾、脾、t l , 脏、肌肉和肝脏中均有较高 表达：在1 0 月龄小鼠睾丸、脑、肌肉中仍有较高表达，但在胸腺、肾、脾、心脏中 表达量降低。进一步分析i h - 1 基因在不同发育阶段小鼠胸腺中的表达情况显示，在 5 7 月龄问i h 1 基因表达明显下降；第四，利用本室的氧化损伤模型鼠分析发现i h - 1 基因在氧化损伤小鼠胸腺中的表达也明显降低；第五，我们构建了用于酵母双杂交的 1 月龄小鼠胸腺p g a d c d n a 文库，并以 1 基因编码框全长为“诱饵? 对文库进行 了筛选，结果筛选出两个可能与m 1 蛋白相互作用的蛋白：g 蛋白b 链和甘油醛- 3 磷酸脱氯酶；最后，我们利用m e r c u r y r m p a t h w a y 检测系统，选择了一些带有可能相 中囱协和医科大学硕士学位论文摘蒙 关的顺式激活元件的质粒，与矾1 共表达后检测报告基因的活性。实验结果发现， 一；杼有卜i fkb 和c - m y c 顺式激活元件的报告基因被激活。 综合上述实验结果，我们推测i h - 1 可能属于细胞信号转导分子，参与了胸腺中 双阳性( d p ) 细胞n f k b 和c m y c 的激活。而n f kb 的活化与p r e t c r 的表达紧 密相连，共同促使d p 细胞免于凋亡的命运。在胸腺增龄性退化和氧化损伤过程中， 由于主要是造成d p 细胞急剧减少，因而出现表达谱差异。因此，m 1 基因功能上与 胸腺内t 细胞发育分化密切相关。其表达在增龄时明显下调，表明老化时的确存在t 细胞发育障碍。 本文为m 1 基因的功能研究奠定了基础，其结果为阐明增龄性胸腺萎缩和t 细 ， 胞发育机制提供了新资料。- - 。7 ： 谥j ； 一习f 4 ；i 2 篾姻它恧 。一 中国协和医科大学硕士学位论文 a b s t r a e t t h ep r i m a r ys t u d yo fi h - 1 - - an o v e lg e n ep o s s i b l ya s s o c i a t e dw i t ht h e d e v e l o p m e n t o fm u r i n e t h y m u s m s c a n d i d a t e ：l ic h u n m a n s u p e r v i s o r ：p r o f h e w e ip r o f c u il i a n x i a n t h et h y m u si st h ec e n t r a ll y m p h o i do r g a ni nw h i c ht h ei m m u n es t e mc e l l s ，c o m i n g f r o mt h eb o n em a r r o wo rt h ef e t a l l i v e r ，p r o l i f e r a t e a n dd i f f e r e n t i a t ei n t om a t u r e t l y m p h o c y t e s a si n d i v i d u a l sa g e ，t h em a j o re f f e c to f a g i n g c a nb es e e no nt h et h y m u s i tv a r i e dn o to n l yt h et h y m u s s i z e ，b u ta l s oi t sa r c h i t e c t u r e t h i sd r a m a t i cl o s so f t h y m u s s t r u c t u r ea n df u n c t i o ni sc a l l e d t h y m u s i n v o l u t i o n i no r d e rt o e x p l o r et h ep o s s i b l e m e c h a n i s m so f t h y m u si n v o l u t i o n ，o u rr e s e a r c hg r o u po n c ec o m p a r e dt h ed i f f e r e n c eo f g e n ee x p r e s s i o nb e t w e e nt h y m ii no n ea n dt e nm o n t h o l db a l b cm i c eu s i n gd d r t p c r a n do b t a i n e ds o m ed i f f e r e n t i a ld i s p l a y e de s t s u s i n go n eo ft h e s ee s t st h a te x p r e s s e d h i g h l yi n o n em o n t ho l dm i c e ，w ei s o l a t e daf u l l l e n g t he d n ab ys m a r t - r a c ea n d p c r ，a n dn a m e d1 i - i 一1 t h i sc d n ai s1 0 0 1 b pl o n g ，w h o s e7 3 2 b po p e nr e a d i n gf r a m e e n c o d e sap r o t e i no f 2 4 3a m i n oa c i d sw i t had e d u c e dm o l e c u l a r w e i g h to f 2 8 k d a ( g e n b a n k a c c e s s i o nn u m b e r ：a f 5 0 3 9 4 2 ) t h ea m i n oa c i d s e q u e n c e w a s q u e r i e d i n t o p u b l i c d a t a b a s et op r e d i c tt h e p o s s i b l ef u n c t i o n s h o w e v e r ，w e f a i l e dt of i n dt h ep u t a t i v ed o m a i n s i nt h i sg e n e t h eo n l yc l u ec a m ef r o mi t sm o t i fo f t y r o s i n ek i n a s ep h o s p h o r y l a t i o ns i t e s u g g e s t i n gt h a ti tm i g h t t a k ee f f e c to n s i g n a lt r a n s d u c t i o n i no r d e rt os t u d yt h en e w g e n e sf u n c t i o n ，w em a d ep r e s e n ts t u d i e sa sf o l l o w s ： f i r s t l y , t h e e d n aw a s a m p l i f i e db yp c ra n dc l o n e d i n t o p e t 一4 2 a v e c t o r sf u r p r o k u 3 , o t i ce x p r e s s i o n s s e c o n d l y w ec o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n tv e c t o r su s i n gp e y f pi n o r d e rt oo b s e r v et h ec o d i n gp r o d u c t s l o c a t i o ni ne u k a r y o t i cc e l l s w ef o u n dt h a tt h eg e n e p r o d u c t sw e r el o c a t e di nc y t o p l a s m a t h i r d l y , t h er e s u l to f n o r t h e r nb l o ta n a l y s i ss h o w e d 3 主璺堡塑蜃型盔竺堡主堂垡丝塞 塑萋 t h a ts u c hg e n ew a se x p r e s s e di nb r a i n ，t e s t i s ，l i v e r , s p l e e n ，h e a r t ，m u s c l e ，k i d n e y a n d t h y m u sa ta l m o s tt h es a m el e v e li no n em o n t h o l dm o u s ew h i l eh i g h l ye x p r e s s e do n l yi n t e s t i s ，b r a i na n dm u s c l ei nt e nm o n t ho l dm o u s e w ea l s of o u n dt h a ti t se x p r e s s i o ni n t h y m u sr e d u c e ds h a r p l yf r o mf i v e m o n t ht os e v e n - m o n t h - o l dm o u s e a n di nt h y m u so f o x i d a t i v es t r e s sm o d e lm o u s e ，t h eg e n e se x p r e s s i o nd e c r e a s e dt o o f o u r t h l y , i no r d e rt o f i n dt h ep o t e n t i a lp r o t e i n ( s ) i n t e r a c t i n gw i t hi - i - 1 ，w ec o n s t r u c t e dap g a d c d n al i b r a r y u s i n gt h y m u so fo n e - m o n t h - o l dm o u s ea n db ym e a r l so fm a t c h m a k e rt w o h y b r i d s y s t e m3s c r e e n e dt h ep g a d c d n al i b r a r yt od e t e c tt h ep r o t e i ni n t e r a c t e dw i t h i h 一1 a n d f i n a l l yf o u n dt w op r o t e i n s o n ep r o t e i n w a sg p r o t e i n 1 3c h a i na n dt h eo t h e rw a s g l y c e r o l d e h y d e - 3 一p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ( g a p d h ) t h ei m p o r t a n c e o fg p r o t e i n bc h a i ni s d e m o n s t r a t e db yi t sc r i t i c a lr o l e si nm a n ye s s e n t i a lb i o l o g i c a lf u n c t i o n sr a n g i n gf r o ms i g n a l t r a n s u d a t i o n ，t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o nt oa p o p t o s i s t h eg a p d h , a w e l l s t u d i e dg l y c o l y t i c e n z y m et h a tp l a y sak e yr o l e i n e n e r g ym e t a b o l i s m ，i sn o wk n o w nt o c o n t r i b u t et oa n u m b e ro fd i v e r s ec e l l u l a rf u n c d o n s i n c l u d i n g n u c l e a rr n ae x p o r t ，d n ar e p a i r , c y t o s k e l e t a lo r g a n i z a t i o n a n dp h o s p h o t r a n s f e r a s e a c t i v i t y f i n a l l y , w ep r o c e s s e d t h e m e r c u r y t mp a t h w a ya s s a ya n df o u n dt h a t i h - 1c a l lu pr e g u l a t et h er e p o r t e ra c t i v i t yo f n f k b a n d c m y c i n c o n c l u s i o n ，i tt o o kh i n tt h a t t h e1 i - 1 - 1 g e n em a yp l a y a ni m p o r t a n tr o l ei nt h e d e v e l o p m e n t o fc d 4 + c d 8 + d o u b l e p o s i t i v e ( d p ) t h y m o c y t e s ，b e c a u s e i m m a t u r ed p t h y m o c y t e sd e p e n d o nb o t hn f kba n d c - m y cf o rt h e i r s u r v i a l s i n c en f kbi s u p r e g u l a t e do n l yi nt h ed ps t a g e ，i tm a ye x p l a i n t h er e a s o n w h y i h 1g e n e e x p r e s s i o n w a s h a r s h l yr e d u c e d w h e n t h y m u si n v o l u t e s ：t h et h y m o c y t e s w e r eb l o c k e do nd n s t a g ea n dt h e t h y m u sl a c ko f d pt h y m o c y t e s o u rr e s e a r c hw o r kp a v e do nt h ew a yt oe l i c i tt h ef u n c t i o no f 珊一1 g e n ea n dm a y c o n t r i b u t et o g i v eb e t t e ru n d e r s t a n d i n go f t h em e c h a n i s mo ft h et h y n m si n v o l u t i o na n d t c e l ld e v e l o p m e n t 4 主里鲤墨型型型型堕l - 墓塑堕亟 a a a m p b s a b p c d n a c i e b d e p c e s t i p t g d a l b m o p s o d p c r r a c e r n a s d s s s c 英文缩略语 a m i n oa c i d a m p i c i l l i n b o v i n es e r u ma l b u m i n b a s e p a i r c o m p l e m e n t a r y d n a c u r i e e | t h i d i u mb r o m i d e d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e e x p r e s s e ds e q u e n c et a g i s o p r o p y l t h i o b d g a l a c t o s i d e d a l t o n l u r i ab r o t hm e d i u m 3 - n m o r p h o l i n o l p r o p a n e s u l f o n i c a c i d o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n r a p i da m p l i f i c a t i o n o f e d n ae n d s 鼬b o n u d e a s e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s o d i u mc h l o r i d e & s o d i u mc i t r a t eb u f f e r x g a l 5 - b r o m o - 4 c h l o r o - 3 - i n d o l y l d g a l a c t o s i d e k a n k a n a m y c i n 氨基酸 氨苄青霉索 牛血清白蛋白 碱基对 互补脱氧核糖核酸 居里 溴化乙啶 焦碳酸二乙酯 表达序列标签 异丙基硫代b d - 半乳 糖苷 道尔顿 l b 培养基 3 n 吗啉代丙磺酸 光密度 聚合酶链反应 c d n a 末端快速扩增 核糖核酸 十二烷基磺酸钠 氯化钠柠檬酸钠缓冲 液 5 溴4 氯3 - 吲哚- d 一半 乳糖苷 卡那霉素 d m s o h i s a d e t r p l e u d i m e t h y l s u l f o x i d e h i s t i d i n e a d e n i n e t r y p t o p h a n l e u c i n e 6 二甲基亚砜 组氨酸 腺嘌呤 色氨酸 亮氨酸 生堡垫塑匡登盔堂亟圭望些迨塞 煎查 刖吾 胸腺是机体重要的中枢免疫器官，是t 淋巴细胞发育和分化的主要场所。骨髓 或胚胎肝脏产生的t 祖细胞经血流到达胸腺后，在胸腺内历经了增殖和分化过程，最 终发育成为成熟t 细胞，继而分布到外周免疫器官1 1 3 l 。但在机体衰老过程中，胸腺 比其他器官表现出更明显的增龄性退化和萎缩。新生儿时的胸腺，其重量约2 0 克， 至青春期达3 0 4 0 克；以后其重量开始减少，6 0 岁时仅约1 克。研究表明，真正的 胸腺组织( 不包括血管、纤维组织和脂肪等) 在出生后即开始减少l4 1 。胸腺的退化使 外周t 淋巴细胞的构成发生重大变化，纯真t 细胞数量减少，t 细胞亚群组成发生变 化，其功能也明显降低。这些是造成老年人机体免疫力下降的主要原因1 5 , 6 1 。现在认 为，骨髓中的t 祖细胞终生都在进入胸腺，其数量不因胸腺的退化而减少。但t 细 胞在胸腺内的发育出现障碍。 最早期由骨髓进入胸腺的t 祖细胞既不表达c d 4 也不表达c d 8 分子，一般称其 为双阴性( d n ) 细胞，它们分布在胸腺外皮质区及被膜下区。在胸腺细胞进一步向 皮质深层迁移过程中，细胞表面同时表达c d 4 和c d 8 分子，称为双阳性( d p ) 细胞。 最后，髓质成熟的t 细胞只表达c d 4 或c d 8 分子，成为单阳性( s p ) 细胞而迁出胸 腺。退化的胸腺内c d 4 。c d 8 。d n 细胞数量无明显改变，而c d 4 + c d 8 + d p 细胞数量明 显减少，提示胸腺退化使未成熟的d n 细胞发育障碍1 7 9 l 。晚近研究表明，在d n 细 胞向d p 细胞发育阶段，前t 细胞发生t c r b 链基因重排，只有能产生有功能活性的 d 链的细胞才能继续发育。它们与t c r 链以二硫键相连接并与c d 3 分子组成前t c r ( p r e - t c r ) 。t 细胞特异的非受体酪氨酸激酶p 5 6 “是d n 细胞重要的信号转导分子。 小鼠缺陷p 5 6 “会使d p 细胞减少并完全缺少成熟的s p 细胞。在t c rb 链基因敲除鼠 和r g 缺陷鼠，过表达活性p 5 6 “可以使胸腺细胞成熟至c d 4 + c d 8 + d p 细胞阶段。此外， 】【一7 或i l - 7 受体基因敲除鼠表现出c d 4 4 c d 2 5 一d n 细胞堆积，不能进一步发育，这提 示老龄小鼠胸腺细胞的发育障碍与i l 一7 分泌或i l - 7 受体表达下降有关“”1 。 人们长期以来一直关注神经内分泌系统与胸腺在个体发生及出生后的相互作用 7 主垦垫塑星i 盔堂塑圭望墼堡塞 煎壹 影响。垂体、松果体、自律神经系统、甲状腺、肾上腺和性腺均对胸腺的完整性和功 能产生重要影响。胸腺的发育依赖于垂体和甲状腺，而性腺和肾上腺则具有促进胸腺 退化的作用。高水平的肾上腺或性腺来源的皮质激素会诱导胸腺皮质未成熟的d p 细 胞凋亡，而生长激素和催乳素则通过胸腺上皮细胞促进胸腺的发育”“。 胸腺细胞在发育过程中，不断与周围环境进行信息交换，发生一系列基因的有效 表达与关闭。为了从基因水平探讨胸腺退化的原因及对胸腺细胞发育的影响，我们课 题组曾采用差异显示反转录( d d r t - p c r ) 技术对1 月龄和1 0 月龄小鼠胸腺m r n a 表达情况进行分析，结果发现一些基因在1 月龄小鼠胸腺中高表达，而另一些基因在 1 0 月龄小鼠胸腺中高表达，并利用其中一段在1 月龄小鼠胸腺高表达的e s t 成功地 克隆了一条新基因i h - 1 1 ”】。 本研究在上述工作的基础上，进一步探讨i h 1 基因与胸腺退化的功能联系。 本文首先通过n o r t h e r n 杂交技术对m 1 基因进行了广泛的表达谱分析，验证了 i h 1 基因确实在退化的胸腺中表达下降；其次，利用酵母双杂交技术筛选1 月龄小 鼠胸腺c d n a 文库，得到两个可能与m 1 基因编码产物相互作用的蛋白；最后，我 们检测了m 1 可能参与的细胞内信号转导途径，并获得了初步结果。综合各项实验 结果，我们分析了m 1 基因在退化胸腺中表达降低的可能原因，并且探讨了其在胸 腺细胞发育中可能发挥的作用。 中国协和医科大学硕士学位论文塑塑塑查堕 材料和方法 一实验材料 1 实验动物 不同年龄的b a l b c 小鼠购自医科院药检所动物中心。氧化损伤模型鼠 ( b a l b c ) 由本室段炼同学提供。 2 菌株 1 ) 大肠杆菌 e c o l id h 5a ，基因型为：f - 审8 0 d l a c z a m l 5r e c a le n d a l g y r a 9 6 t h i 一1 b s d r l 7 ( r k m k + 、s u p e 4 4r e 认1d e o r a ( 1 a c z y a - a r g f ) u 1 6 9 ，用于质粒的扩增与转化。 e c o l ib l 一2 1 ( d e 3 ) ，基因型为：h s d sg a l ( c l t s 8 5 7 i n d ls a r n 7n i n 5l a c u v 5 - t 7 ) ， 用于重组蛋白质的表达。 2 ) 酵母菌株 a h l 0 9 ，基因型为：m a t c i t r p l 9 0 1 l e u 2 31 1 2u r a 3 5 2h i s 3 2 0 0g a l 4 ag a l 8 0 al y s 2 ：g a l lm - g a l lt t 一h i s 3g a l 2 1 s _ g a l 2t t - a d e 2u r a 3 ：m e l l 。一m e l l ，。一l a c zm e l l ，用于酵母双杂交实验。 y 1 8 7 ，基因型为：m a t nu r a 3 5 2 h i s 3 2 0 0a d e 2 1 0 l r p l - 9 0 1l e u 2 31 1 2 9 a 1 4 a m e t g a l 8 0a u r a 3 ：g a l lu a s g a l lt a t a _ 1 a c z m e l l ，用于酵母双杂交实验。 大肠杆菌菌株由本实验室提供，酵母菌株购自c l o n t e c hl a b o r a t o r i e si n c 。 3 质粒载体 p g e m - t e a s y ：用于p c r 产物的克隆；p e t 4 2 a ( + ) ：用于原核细胞中基因表达； p e y f p n i ：用于基因在真核细胞中的荧光定位；p g b k - t 7 ：含g a l 4d n a 结合结构 域编码序列，用于酵母双杂交实验，p g a d - t 7 r e c ：含g a l 4 转录激活结构域编码序 列，用于酵母双杂交实验。 其中，p g b k - t 7 和p g a d t 7 r e c 购自c l o n t e c h l a b o r a t o r i e si n c ，p g e m - t e a s y 购f ip r o m e g a 公司。其它由本室提供。 序砷1 船蜒册优6 图1 p g e m - t e a s y 结构及多克隆位点示意图 a 跆i 圈2 p e y f p - n i 结构及多克隆位点示意图 b c c 幅者祭 咖 。 ，“耵娼的娼鸵甜加5卯侣盯引 中田协和医科大学硕士学位论文材料和方法 i 删h 删娜詈_ 碉：黼回 ，吵蠡i l l 藏蠡 i 毒。 图4p c d n a 3 i v 5 h i s 结构及多克隆位点示意图 中国协和医科大学硕士学位论文材料和方法 c m y ce p i t o p et a g 1 垦竺坠唑坐塑! -m m _ 。_ 而而雨而鬲硒蔷而而画商瓦蕊丽鬲丽丽疏c 6 mt t t ：b 蓝己竺竺竺兰1 4 脚7 印帅 g t a a t a c 6 a c t c a c t a t a g g 6 c g i 6 c c 6 c c t c 缈丽丽溉蕊丽丽衍蕊丽丽丽赢 f r a l f f j | r , w r ，3端42黼篙黼骂笋号笋湖“飘雾蕊x 。 - m a l 。 币丽丽焉零丽丽而丽石i 帚畹c g c g c t t g c a g c c m g c l m t c c 6 6 g c g 从t t t c 丌a t g 椰 4 7 6 a t t t i t a t t a t t a a a t a a g t t a t a a a a a a a a t a a g t g t t a c a a a l t t t a a a 6 t g a c t c t t a g g t i t i - a a a a c g a a a a ! ! 竺：! ! 苎! 竺：竺h 打h r 嘲嚣镶搿搿黯一 图5p g b k t 7 结构及多克隆位点示意图 - h a p j t o p e t a g 嘲i 图6 p g a d t t r c c 结构示意图 主里塑塑垦塾盔堂塑主堂垡堡塞 笪婪塑杰鲨 4 引物 引物由上海生工生物工程公司和北京赛百盛公司合成，并经过p a g e 纯化( 引物 编号为公司合成编号) 。 1 ) i h - i p c r 扩增用引物 k 2 1 0 8 9 ( 5 端) ：5 - c a cg a j r6 a ca g at t ac g gc g ag 一3 k 2 1 0 9 0 ( 3 端) ：5 - t c ca a ac c ct c ta g ca t ag c ca c 一3 2 ) i h 一1 原核表达用引物( 连接于p e t 4 2 a ( + ) ) k 2 4 0 0 2 ( 5 端) ：5 - g g at c ca t ga c ag a tt a cg g cg a gg a a - 3 k 2 4 0 0 3 ( 3 端) ；5 一c t cg a gt c ca a ac c ct c ta g ca t ag c c 一3 3 ) i h 一1 真核荧光定位用引物( 连接于“f p ) k 2 4 0 0 0 ( 5 端) ；5 - c t cg a ga c ga t ga c ag a tt a cg g cg a - 3 k 2 4 0 0 l ( 3 端) ：5 - g g at c ct c ca a ac c ct c ta g ca t ag c c - 3 4 ) i h i 真核表达用引物( 连接于p c d n a 3 i v 5 一h i s ) k 4 3 7 9 2 ( 5 端) ：5 - g 从t c ca c ga t gg c ag a tt a cg g cg a gg a ac a ac 一3 k 4 3 7 9 3 ( 3 端) ：5 一c t cg a gg t ct g ag g ag t ca c tc c ct g g - 3 5 ) i h 一1 酵母双杂用引物( 连接于p g b k - t 7 ) 0 5 1 5 4 ( 5 端) ：5 一c a ta t ga c ag a tt a cg g cg a gg a ac a ac - 3 0 5 1 5 5 ( 3 端) ：5 - g g at c ct c ag t ct g ag g ag t ca c tc c c - 3 5 试剂盒 p g e m te a s yv e c t o rs y s t e m 与随机引物标记试剂盒购自p r o m e g a 公司；酵母双 杂交系统试剂盒m a t c h m a k e rl i b r a r yc o n s t r u c t i o n s c r e e n i n gk i t 和m e r c u r y 7 m p a t h w a y 检测试剂盒购自c l o n t e c h 公司；m r n a 提取试剂盒o l i g o t e xm r n a m i c r o k i t 购自q i a g e n 公司；d n a 片段纯化试剂盒购自博大公司。 6 放射性同位素 【n 一”p d c t p ( i o uc i ul ，比活性 3 0 0 0 c i ，m m 0 1 ) 购自北京亚辉生物工程公司。 7 ：| 三要化学试剂及材料 丙烯酰胺、n ，n 亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵和s d s 购自b i o r a d 公司；i p t g 、 x g a l 、d m s o 和琼脂糖购自p r o m e g a 公司；t r i s o l 试剂、转染试蠢t j ( l i p o f e c t a 分钟 中国协和医科大学硕士学位论文材料塑! ! 壁 e t d 2 0 0 0 ) 购自g i b c o 公司；d e p c 为s i g m a 公司产品；x - - g a l 和快速杂交液为 c l o n t e c h 公司产品i n o r t h e r n 杂交用尼龙膜为a m e r s h a m 公司产品；x 光片为美国k a d a 公司产品。9 6 孔培养板和1 0 0 m m 塑料瓶皿为c o s t a r 公司产品。其它各种试剂为进口 或国产分析纯试剂。 8 工具酶及d n a 分子量标准 所用各种限制性内切酶、t a qp l u s l d n a 聚合酶、d n t p 及分子量标准购自上海 生工生物工程公司。 9 培养基 l b 液体培养基：胰蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，氯化钠5 9 ，加水定容至1 l ， 高压灭菌。 l b 固体培养基：每升l b 液体培养基中加2 0 9 琼脂粉，高压灭菌。 y p d 培养基，s db a s e 培养基及各种d o ( d r o p o u t s o l u t i o n ) 购自c l o n t e c h 公司。 1 0 细胞株及细胞培养用品 c o s 一7 细胞由本室提供；s h s y - 5 y 细胞由本所生化室惠赠。 d m e m 高糖培养基为g i b c o 公司产品；胎牛血清为医科院天津血研所产品； 胰酶t r y p s i n 为s i g m a 公司产品；抗生素z e o c i n 为c l o n t e c h 公司产品。 1 1 主要仪器及设备 实验所用主要仪器有：冷冻高速离心机( b e e k m a n ) 、m i l l i qp l u s 超纯水系统 ( m i l l i p o r e ) 、电泳仪( 国产) 、p c r 仪、紫外观测仪、紫外交联仪、杂交炉及杂交管、 电转仪( b i o r a d ) 、超声破碎仪和同位素探测器等。 二实验方法 1 d n a 片段的克隆和鉴定 1 1 连接 反应体系如下： 1 0 t 4d n al i g a s eb u f f e rlul 目的d n a 片段1 0 0 3 0 0 n g p g e m - te a s y 载体2 0 5 0 n g t 4d n a1 i g a s e1u 1 1 4 里垃塑墨登查堂堡主堂丝堕塞 一一盟盟型立鲨一 去离子水 补足至1 0 u1 混匀后4 c 过夜。 1 2 转化 连接产物加入到2 0 0ulc a c l ：法制备的d h 5 感受态细菌悬液中，冰上放置3 0 分钟，4 2 。c 9 0 秒，冰上放置l 2 分钟，加入8 0 0 u1l b 液体培养基，3 7 c 轻摇4 5 分钟。将3 0 0ul 转化的细菌悬液涂布于含氨苄青霉素的平板上，3 7 c 平置3 0 分钟后， 3 7 倒置培养1 2 1 8 小时。 1 3 重组克隆的酶切鉴定 1 0 b u f f e r ( 根据所用的内切酶采用相应的b u f f e r ) 2 u1 质粒d n a 0 5 1pg 相应的内切酶 2 5u r n a 酶( 1 0 ug u 1 ) 1u l 去离子水补足至2 0 u l 2 质粒的提取和纯化 2 1 试剂 溶液i ： 5 0m 葡萄糖 2 5 it r i s c 1 ( p h8 0 ) l ome d t a ( p h8 0 ) 溶液i i ： 0 2 mn a o h ( 临用前用1 0 m o l l 储存液稀释) l s d s 溶液i i i 5m 乙酸钾6 0m l 冰乙酸 1 1 5m l 去离子水 2 8 5 m l 。 2 2 碱裂解法小量提取质粒 挑取单个菌落接种于含相应抗生素的3 m l 培养基中，3 7 振荡培养过夜。取 璺堡塑堕型盔堂堡圭堂垡丝壅 盟垫塑查堡 1 5 m l 菌液于1 5 m l 离心管中，在4 c 下1 0 ，0 0 0 x g 离心1 分钟。倒去上层培养液， 将沉淀悬浮于1 0 0 弘1 溶液i 中，振荡后加入2 0 0 ul 新配制的溶液i i ，上下颠倒5 次混匀，冰浴5 分钟。然后加入1 5 0 ul 溶液i ，上下颠倒振荡1 0 秒钟，混匀后冰浴 5 分钟。在室温下，1 0 ，0 0 0 x g 离心1 0 分钟。收集上清液至另一1 5 m l 离心管中。 用等体积的酚氯仿抽提，在4 c ，1 0 ，0 0 0 g 下离心2 分钟。上清加入两倍体积的 无水乙醇，振荡混匀，室温沉淀5 分钟，1 0 ，0 0 0 g 离心1 0 分钟。吸去上清液，倒 置于一千净滤纸上，待管壁上的液滴挥发后加入i m l 预冷的7 0 乙醇。在4 c 下洗 涤，室温晾干沉淀，溶于l o ul 去离子水中。 3 d n a 及蛋白序列的计算机分析 将所测到的c d n a 的序列在n c b i ( n a t i o n a l c e n t e rf o r b i o t e c h n 0 1 0 9 y i n f o r m a t i o n ) 的数据库中使用b l a s t 软件进行比较分析。e d n a 序列的翻译、酶切位 点分析使用d n a m a n 软件。 4 基因的原核表达 4 1 原核表达载体的构建 1 ) 根据m 1 基因序列设计引物，扩增其编码区的核苷酸序列，分别于5 端 和3 端引入b a m h l 和x h o l l 酶切位点。 2 )以全长i h ic d n a 为模板进行p c r ，反应体积为2 5 ui ，反应体系组成为： 1 0 b u f f e r2 5ul ，d n t p “。( 1 0 m m ) o 6 i ll ，引物终浓度为0 4 n l m ，质粒模板5 n g ， t a q p l u s d n a 聚合酶2 u 。p c r 反应条件为：9 4 c 预变性3 分钟；9 4 c3 0 秒、6 5 。c 4 5 秒、7 2 。c2 分钟，共3 0 个循环；7 2 。c 延伸1 0 分钟。 3 ) 将p c k 产物进行l 琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，回收，与p g e m te a s y 载体连接，转化大肠杆菌d h 5a 。3 7 c 倒置培养1 2 1 8 小时后，选择阳性克隆扩增 培养1 2 小时，小提质粒，用b a m h l 和x h o l l 双酶切截取p g e m te a s y 载体目的基 因片段，同时将p e t 4 2 载体同样双酶切后回收。取适量的酶切回收的目的d n a 与 p e t 4 2 载体1 0 0 n g 混合，使片断与载体摩尔比达到5 8 比l ，加入1u i t 4 连接酶以 及lu1 1 0 t 4 连接缓冲液，补加去离子水至反应体积为1 0ul ，1 6 “c 连接1 6 2 0 小 时。 4 2 b l 2 1 感受态细菌的制备 】6 ：生璺垫塑堕登盔堂塑圭竺垡堕塞 一塑塑塑! ! i l 用冰冷氯化钙溶液处理细菌能够使细菌进入“感受态”，而热休克则可以使细菌 的细胞膜张开，以便让d n a 进入细胞。 i ) 用划线法将大肠杆菌接种于基本培养基平r ml - ，于3 7 c t 倒置培养l 2 天。 2 ) 将单个菌落接种于装有1 0 m l l b 培养液的5 0 r a l 试管中，3 7 c2 5 0 转分， 振荡培养】0 】2 小时。 3 ) 向两个内装2 0 0 m l l b 培养液的1 l 三角瓶中各加入4 m ! 过夜培养细胞，于 3 7 。c 下振荡培养至光密度( o d 6 0 0 ) 值介于o 5 o 6 之间( 约需1 2 小时) 。 4 ) 将每份细菌培养物分别倒入一个预冷的无菌2 5 0 m l 离心瓶中，置于冰上保 持2 0 分钟后，于4 下4 0 ，0 0 0 x g 离心1 0 分钟，弃上清液a 5 ) 将每份沉淀轻缓地悬于1 0 0 m l 冰冷的m g c l 2 ( p h 7 2 ) 溶液中，按上述方法 再次离心。 6 ) 去上清，并将每一份沉淀轻缓地悬浮于1 0 m l 冰冷的含1 0 甘油的0 1 m c a c l 2 ( p h 72 ) 溶液中。 7 ) 每管2 0 0 l a 1 分装于5 0 个e p p e n d o r f 管中，7 0 。c 冷冻贮存备用。 4 3 感受态细菌b l 2 1 的转化 1 ) 将1 ul 质粒d n a 与5 0 u l b l 2 1 感受态细菌混合于1 5 m l e p e n d o r f 管中，冰 上放霞3 0 分钟。 2 ) 将e p p e