（动物营养与饲料科学专业论文）饲料中氨基糖苷类药物检测技术研究.pdf

摘要 本论文通过两个试验，采用高效液相色谱( h i g ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a m ，h p l c ) 技术研究建立了饲料中卡那霉素a 和新霉素的检测方法。( 1 ) 采用h p l c 技术建立了饲料中 卡那霉素a 的检测方法。用0 1m o i l 的盐酸溶液提取饲料中的卡那霉素a ，提取液以2 0 0 0 0 r p m 的转速高速离心，上清液经复合阳离子( m i x e dm o d ec a t i o ne x c h a n g e r ，m c x ) 固相萃取 ( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 小柱净化，然后用5 氨水甲醇溶液洗脱。洗脱液采用氮气 吹干，用硼酸缓冲液溶解与邻苯二甲醛( d p h t h a l a d e h y d e ，o p a ) 衍生液在室温下反应1 0r a i n ， 在反相x t e r r a t mc 1 8 柱分离。流动相为醋酸铵缓冲液和乙腈( i ：l ，v v ) ，等度洗脱，检测器 选用荧光检测器，激发波长为2 3 0n m ，发射波长为3 8 9n m ，运行时间为2 0r a i n 。结果表明， 以0 1m o l l 盐酸溶液为提取液，经s p e 小柱净化，卡那霉素a 的分离效果较好，且没有其它 杂质峰干扰。饲料中添加1 0 - - 2 0 0m g k g - 那霉素a 的平均回收率为9 8 4 - - - 1 0 6 0 ，变异范围为 1 1 7 曲7 8 ，线性范围为0 1 - 1 0l a g m l ，卡那霉素a 在饲料中的检出限为5m 眺g ，定量限为 1 0m g t k g 。( 2 ) 利用h p l c 和s p e 技术建立了饲料中新霉素的检测方法。用0 1m o l l 的盐酸溶 液提取饲料中的新霉素，提取液经2 0 0 0 0r p m 离心后i t s p e j 、柱净化，用2 5 氨水甲醇溶液 洗脱，洗脱液用氮气吹干，然后用硼酸缓冲液溶解与9 芴基甲氧碳酰氯 ( 9 - f l u o r e n y l m e t h o x y c a r b o n y lc h l o r i d e ，f m o c c i ) 衍生剂在室温下反应1 5r a i n ，在反相 x t e h _ a 1 ”c 1 8 柱分离。流动相为水和乙腈，洗脱程序为梯度洗脱。检测器为荧光检测器，激 发波长为2 6 7n m ，发射波长为3 0 9n l n ，运行时间为3 0r a i n 。经过色谱条件的优化和前处理条 件的选择，饲料中新霉素的分离效果较好，灵敏度较高。饲料中添加8 0 和1 0 0m g ，k g 新霉素 的平均回收率为8 2 1 9 2 6 ，变异范围为5 2 4 , - - 9 2 1 。新霉素的线性范围为0 0 5 1 0p g m l ， 检出限为0 5m g k g ，定量限为lm g k g 。 关键词：卡那霉素a ，新霉素，高效液相色谱，柱前衍生，固相萃取，荧光，饲料，f m o c c 1 ， o b a i i a b s t r a c t t w oe x p e r i m e n t sw e r ec o n d u c t e dt oe s t a b l i s ht h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o d sf o r t h e k a n a m y c i naa n dn e o m y c i ni na n i m a lf e e d s ( 1 ) d e t e r m i n a t i o no fk a n a m y c i nab yh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dp e r f o r m a n c ec h r o m a t o g r a m ( h p l c ) s a m p l e sw i t hk a n a m y c i naw e r e e x t r a c t e dw i t h0 1m o l lh 3 ，d r o c h l o r i ca c i ds o l u t i o n t h e nt h ee x t r a c t e ds o l u t i o nw a sc e n t r i f u g e d a t2 0 ，0 0 0r p m t h ec l e a n - u pw a sa c h i e v e d 、v i t i lm i x e dm o d ec a t i o ne x c h a n g e r ( m c x ) s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) t h ep u r i f i e de x t r a c tw a sd e r i v a t i z e d 1 0r a i nw i t ho p as o l u t i o n ， s e p a r a t e do n ar e v e r s e d - p h a s ex t e r r a t mc 1 8c o l u m na n dt h ef l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nw a s p e r f o r m e da tt h ee x c i t a t i o na n de m i s s i o nw a v e l e n g t h so f2 3 0a n d3 8 9n m ，r e s p e c t i v e l y t h e m o b i l ep h a s ew a sa m m o n i u ma c e t a t es o l u t i o na n da n e t o n i t r i l e ( 1 ：l ，v v ) e x t r a c t e db y h y d r o c h l o r i ca c i ds o l u t i o na n dc l e a nu pw i t hm c xs p ec o t m n n ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r e w a sg o o ds e p a r a t i o no fk a n a m y c i nai na n i m a lf e e d sa n dn oi n t e r f e r e n c eo nt h ep e a l ( o f k a n a m y c i na t h i sm e t h o dp r o v i d e dt h ea v e r a g er e c o v e r i e s9 8 4 , - 1 0 6 似b ya d d i n g1 0 2 0 0 m 舭gk a n a m y c i na t oa n i m a lf e e d s t h el i n e a rr a n g ew a s0 1 1 0 0p , g m l t h el i m i t so f d e t e c t i o na n dq u a n t i f i c a t i o ni na n i m a lf e e d sw e r e5m 眺ga n d1 0m g k g ，r e s p e c t i v e l y ( 2 ) d e t e r m i n a t i o no fn e o m y c i nb yh p l c s a m p l e sw i t hn e o m y c i nw e r ee x t r a c t e dw i t h0 1m o l l h y d r o c h l o r i ca c i ds o l u t i o n ，t h e nt h ee x t r a c t e ds o l u t i o nw a sc e n t r i f u g e da t2 0 ，0 0 0r p m t h e c l e a n - u pw a sa c h i e v e dw i t hm c xs p ec o l u m n t h ep u r i f i e de x t r a c tw a sd e r i v a t i z e d1 5m i n w i t h9 - f l u o r e n y l m e t h o x y c a r b o n y lc h l o r i d e ( f m o c = c 1 ) s o l u t i o n ，s e p a r a t e do nar e v e r s e d p h a s e x t e r r a l mc 1 8c o l u m na n dt h ef l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nw a sp e r f o r m e da tt h ee x c i t a t i o na n d e m i s s i o nw a v e l e n g t h so f2 6 7a n d3 0 9n n l ，r e s p e c t i v e l y t h em o b i l ep h a s ew a sw a t e ra n d a c e t o n i t r i l ew i t hl i n e a rg r a d i e n tp r o g r a m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a sg o o ds e p a r a t i o na n d h j g l ls e n s i t i v ef o rn e o m y c i n t h el i n e a rr a n g ew a s0 0 5 1 0 g m l t h i sm e t h o dp r o v i d e dt h e a v e r a g er e c o v e r i e s8 2 1 - 9 2 6 b ya d d i n g8 0a n dl0 0m 眺gn e o m y c i nt oa n i m a lf e e d s t h e l i m i t so f d e t e c t i o na n dq u a n t i f i c a t i o nw e r e0 5m g k ga n dlm g k g ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：k a n a m y c i na ，n e o m y c i n ，h p l c ，s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，f l u o r e s c e n c e ，f e e d ， f m o c - c 1 ，c p a 缩写词表( a b b r e v i a t i o n s l 缩写英文名称 中文名称 c e c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 毛细管电泳 d n b c l 3 - 5 - d i n i t r o b e n z o y lc h l o r i d e3 - 5 二硝基苯甲酰氯 e l i s a e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附试验 f d n b 1 - f l u o r o - 2 ，4 - d i n i u o b c n z e n e1 - 氟一2 - 4 - - 硝基苯 f m o c - c i 9 - f l u o r e n y l m e t h o x y c a r b o n y ! c h l o r i d e9 - 芴基甲氧碳酰氯 h l b h y d r o p h i l i c - l i p o p h i l i cb a l a n c e复合阴离子柱 h p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a m 高效液相色谱 i a i m m u n ea l g o r i t h m 免疫算法 m c x m i x e d m o d e c a t i o n e x c h a n g e r 复合阳离子交换柱 o p a o - p h t h a l a d e h y d e 邻苯二甲醛 r i a r a d i o i m m u n o a s s a y 放射免疫测定 r s d r e l a t e ds t a n d a r dd e v i a t i o n相对标准偏差 s p e s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n 固相萃取 t n b s 2 - 4 - 6 - 埘n i t r o b e n z c n es u l f o n a t e 2 4 舌三硝基苯磺酸 v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 阎拟 时间： ) 口习年么月么日 f 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 巨j 灸时间： 刁年 9 5 ) ，卡那霉素b 和卡那霉素c ( 5 ) 卡那霉素的肾毒性远远大于安普霉素和新霉素，目前我国没有把卡那霉素列为饲料添 加剂( 季之华等，2 0 0 2 ) ，但卡那霉素作用范围与氨基糖苷类中新霉素和安普霉素的作用范 围较为相近，很多饲料生产企业为了逃避同类药物新霉素和安普霉素的检测，非法将卡那霉 素添加到饲料中，给动物和人的健康造成极大的威胁 卡那霉素主要是通过肾脏排泄，所以肾组织中的浓度较高。血浆中卡那霉素半衰期为2 弓 h 。人体肾组织中卡那霉素的浓度几乎是肌肉中的1 6 倍，在肌肉注射后卡那霉素在肾脏( 特 别是皮质部) 易于蓄积，肌肉组织的休药期一般小于5d ，但肾组织的休药期则要6 0 - 0 0d ( 李 俊锁等，2 0 0 2 ) 目前对卡那霉素的研究主要侧重于药物在组织中残留检测( s t e a d ，2 0 0 0 ) 国际上卡那霉素一般用微生物法检测，此方法费时、费力且准确度较低( 李俊锁等，2 0 0 2 ) 关于饲料中卡那霉素a 的检测目前还没有报道。 本研究拟从色谱条件优化、方法性能和样品前处理等几个方面，通过简化测定方法，建 立一种快速、简单、准确的方法检测饲料中卡那霉素a ，为饲料安全的监督管理提供科学的 方法 2 材料与方法 2 1 主要仪器 w a t e r s 高效液相色谱仪：w a t e r s6 0 0 控制器，w a t e r s t m6 0 0 泵，w a t e r s7 1 7p l u s 自动进 样器，w a t e r s2 4 7 5m u l t ix 荧光检测器，e p o w e r 软件数据系统；分析天平，感量o 1n a g ：固 相萃取减压净化系统( 美国a g i l e n t 公司) ；w a t e r so a s i s 。复合阳离子交换柱( m i x e dm o d e c a t i o ne x c h a n g e r ，m c x ) ( 1c c 和3c e ) s p e 小柱：离心机，转速可达2 0 0 0 0r p m ( t d l - 5 一a 长沙平凡仪器厂) ；k l s l 2 型氮吹仪一数显式电热恒温水浴( 北京康林科技有限责任公司) ： 9 中国农业大学硕士学位论文 试验一 微型涡旋震荡器( 广州仪科实验室技术有限公司) ：反相色谱分析柱x t e r i _ a ，r p l 8 4 6 2 5 0 m m ，5p m ( 美国w a t e r s 公司) ；c l s 保护柱，4 6x2 0 m m ，5 h m ( 美国w a t e r s 公司) 。 2 2 试剂与溶液 卡那霉素a 和巯基乙醇购自s i g m a 公司；乙腈，色谱纯( 美国f i s h e r 公司) ：醋酸、氨 水、无水甲醇、醋酸铵，盐酸等其它试剂均为分析纯试剂，购自北京化学试剂公司。 标准贮备液：准确称取o 0 5g 卡那霉素a 标准品置于5 0m l 容量瓶中，用超纯水溶解， 并稀释至刻度。摇匀，其浓度均为i 0m g m l ，可贮于4 c 冰箱中，三个月。 标准中间液：分别准确吸取标准贮备液1 0 0m l 置于1 0 0m l 容量瓶中，用水稀释、 定容，其浓度为1 0 0p g m l 。 标准工作液：取标准中间液1 0 0 、5 0 、2 5 、1 5 ，0 5 和o 1m l 分别于1 0 0m l 容量瓶 中，并用硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀。其浓度分别为1 0 0 、5 0 、2 , 5 、1 , 5 、0 , 5 和0 1p g m l 硼酸缓冲液：准确称取o 7 7g 硼酸置于1l 烧杯中，用超纯永溶解，转移到容量瓶中， 并稀释到刻度，用6m o l l 氢氧化钠溶液调p h 到9 5 ，过0 2 2 “m 水系滤膜。 盐酸溶液【c ( h c l ) = 0 1 0m o l l ：准确量取8 4n 止浓盐酸，用水稀释至1 0 0 0m l 。 5 氨水一甲醇溶液( 洗脱液) 量取2 0m l 无水甲酵于1 0 0m l 容量瓶中，加入5 , 0m l 氨水( ) 2 5 ) ，然后用无水甲醇定容至刻度。 醋酸铵缓冲( 液流动相a ) ：称取o 7 7g 醋酸铵置于ll 容量瓶中，加入8 0 0m l 超纯水。 再加入4 0m l 醋酸，用超纯水定容至刻度，抽滤后待用，且现配现用。 衍生液：准确称取0 0 5 3 6g 邻苯二甲醛( o p h t h a l a d e h y d e ，o p a ) 于1 0m l 棕色容量瓶 中，加入2m l 甲醇，在通风橱中加入4 0 皿巯基乙醇，用甲醇定容到刻度然后用0 2 2 岬l 有机膜过滤，将滤液收集到棕色瓶中，待用。 2 3 试验方法 2 3 1 样品的制备与提取 试验中所有的饲料均在中国农业大学农业部饲料工业中心的中试车间配制完成，未添加 任何抗生素等药物添加剂，混匀后的样品粉碎并过o 2 5m m 筛。 称取5g 配合饲料( 浓缩饲料称取3 9 ；预混和饲料称取1g ) 置于5 0 m l 带盖的离心管 中，加入i m l 贮备液，放置1h 。然后加入4 0m l0 1m o l l 盐酸溶液，盖好管盖，充分振 摇约2 0r a i n 。于离心机上以4 0 0 0r p m 的转速离心1 0r a i n ，上清液倒入1 0 0m l 容量瓶中， 残渣再分别用上述提取剂3 0m l 、3 0m l 重复提取两次，每次振摇l o 1 5m i n ，离心1 0r a i n 后合并上清液于1 0 0 m l 容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀、过滤，滤液待用。 2 3 2 净化 m c x 柱内磺酸基对亲水性基团具有强保留性。在低p h 下磺酸基吸附n h + 带有正电荷， 可以吸附带负电荷的物质，而当柱内环境改变，变成碱性时o h 与n i l + 中和。使系统不带有 l o 中国农业大学硕士学位论文试验一 电荷，而使被吸附的带负皂荷的物质与固相小拄( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 分离基于 m c x 柱的净化原理及卡那霉素本身带有负电荷的特点，本试验选用m c x 固相萃取小柱用 于饲料中卡那霉素的净化。吸取2 3 1 步骤中得到的样品提取滤液1 勉0m l 于1 5m l 的离 心管中，以2 0 0 0 0r p m 的转速离心1 0m i n 将净化用固相s p e 小柱固定于s p e 减压净化系 统上，依次用1 0m l 甲醇和i 0m l 水活化、平衡用移液器准确移取im l 离心后的样品 上清液加到s p e 小柱里，溶液流速是溶液在重力下自由通过s p e 小柱的速度，大约2d r o p s s 然后用1 0m l 提取液洗和1 0m l 无水甲醇淋洗液各淋洗一次最后用2 0m l 洗脱液将吸 附在固相萃取小柱上的目标检测物分离下来，洗脱速度是在重力下自由下落将洗脱液置于 氮欢仪上，吹于准确加入1 0m l 硼酸缓冲液，在超声波中超生5m i n ，在振荡器上振荡1 r a i n 使其充分溶解混匀，盖好，待用 2 3 3 色谱分离条件 色谱柱：反相c i s 柱，x t c r r a t m ，r p l l 4 6 x2 5 0 m i l l ，粒度5 岫的分析柱；2 0 4 6 l l u n d ，粒度5p , m 的c l s 保护柱；柱子温度为室温2 5 c 左右；流动相为醋酸铵缓冲液和乙腈， 等度洗脱流速：0 8m l m i n ；荧光检测，激发波长：2 3 0n 1 1 1 ；发射波长：3 8 9n i n ；进样量： 1 0 0g l ；运行时间2 0r a i n 2 3 4 衍生条件 衍生条俘包括衍生时间、衍生剂用量以及衍生剂的存放时间移取4 0 0 皿待测样品置 于液相上机小瓶中，加入2 0 0u l 衍生液，振荡混匀，盖上小盖，在室温下反应1 0m i n ，立 即上机检测o p a 衍生液需避光保存，现配现用 3 结果与讨论 3 1 卡那霉素a 的h p l c 方法建立 3 1 ih p i , c 色谱条件 3 1 l 1 波长的选择 氨基搪苷类药物是一类不具有发色基团的抗生素，卡那霉素是氨基糖苷类药物的一种， 因此它本身也不发光，必须经过衍生后的衍生物才能具有荧光吸收 y a n g 和t o m e l l i n i ( 2 0 0 1 ) 用0 0 5m m o l l 的c u ( l - t r p ) 2 和4m m o ，l 的硼酸钠缓冲液( p h 8 8 ) 作为柱后反应物，在激发波长2 8 0n m ，发射波长3 5 0i l n 条件下检测卡那霉素治疗药 h a a g s m a 等( 】9 9 5 ) 用柱后衍生法测定了猪、牛和鸡血浆中的奇霉素，其拄后用次氯酸钠氧 化再用o p a 衍生，激发波长3 4 0n n l ，发射波长4 6 0n m p o s y n i a k 等( 2 0 0 1 ) 用f m o c - c 1 作为 衍生剂，在激发波长2 6 0n n l ，发射波3 1 5n m 下检测了猪的肌肉、肝脏和肾脏中新霉素和庆大 霉素的含量s w c e n e y 和c o l e m a n ( 1 9 9 8 ) 也检测了饲料中安普霉素的含量，其检测波长为 激发波长2 3 01 1 1 1 1 ，发射波长3 8 9 衄，同时作者比较了此波长与常用波长激发波长3 4 0 舳， 发射波长4 5 0n m 的优缺点，结果表明检测饲料中氨基糖苷类药物，在2 3 0n m 和3 8 91 1 1 1 下比 传统波长下检测，杂质峰少，目标检测物的灵敏度高本试验对o p a 衍生后的卡那霉素标准 中罾农业大学硕士学位论文 试验一 溶液进行了全波长扫描图谱( 图2 1 ) ，结果发现在激发波长3 4 0 n m 和发射波长4 5 0 啪左右卡 那霉素a 确实有最大的吸收峰，结果与s w e e n e y 和c o l e m a n ( 1 9 9 8 ) 报道一致。但饲料中添加 有多种氨基酸如赖氮酸、蛋氨酸和肮氮酸等，它们与o p a 反应后在该波长下也有最大的吸收， 因此影响了试验的灵敏度。根据试验的饲料基质复杂性以及前人的报道，本试验采用激发波 长2 3 0n m 和发射波长3 8 9n m 进行检测。 图2 - 1 卡那霉素 荧光全扫描波长 f i g u r e2 - 1t h ei c a u $ p e c t r o f r a mo f k a n t m y c i na 3 1 1 2 流动相的选择 卡那霉素是一种极性较高的化合物，降低其极性是改善该化合物在分析柱上分配性能的 重要因素。降低极性有两种方法：衍生化和在流动相中加离子对目前，使用最广泛的离子 对试剂有戊基、庚基或己基磺酸盐然而用离子对分析色谱对氨基糖菅类抗生素进行分析也 需要衍生衍生会显著影响被分析化合物的极性和酸碱性及离子对的分离。在柱前衍生中通 常会观察到离子对对分离的影响。同时长时间使用离子对也会降低分析柱的柱效。使用c s 或c l s 分离柱，流动相一般由醋酸铵缓冲液和甲醇或乙腈组成。流动相中添加醋酸或醋酸盐， 解离的醋酸根与卡那霉素碱基中所带的正电荷形成离子对，对卡那霉素a 分离有很好的分配 作用( 图2 - 2 ) 根据文献报道，选用了乙腈- 2m m o l l 醋酸铵缓冲液甲酸( a ：5 9 5 0 2 ；b ： 9 5 5 0 2 ，v v v ) 和乙腈一醋酸铵缓冲液一醋酸( 4 0 6 0 2 ，v v v ) 两种流动相进行了比较( o e r t e l 等，2 0 0 4b ) 。结果发现后者的分离效果好，灵敏度高。 3 1 1 3 流动相放置时间对峰面积的影响 任何一种化合物的分离与流动相的选择都有很大的关系。不屈流动相所含的化合物不 同，稳定性也就不同。将配好的醋酸铵缓冲液装在溶液瓶中，室温下放置一周。结果发现， 放置一周的醋酸铵缓冲液做流动相与现配醋酸铵缓冲液做流动相相比，卡那霉素a 峰面积 降低5 3 。由此可以得出流动相放置时间会影响卡那霉素a 的检测灵敏度。 1 2 中国农业大学硕士学位论文 试验一 r i i t i m c ( m i n ) 图2 - 2 卡那霉素 的色谱分离图 f i 删m 2 - 2 t h ec h r o m a t o g r a mo f k a n i m y c | n 3 l 1 4 分析柱的选择 本试验分析柱为w a t e r s x t e r r a r p i l 4 6 2 5 0 i r d n ，5 陋i ：保护柱为w a t e r s s y m m e t r y 。4 6 x2 0m m ，5u m 同时与a t l a n t i sd c l 。4 6x1 5 0m m 分析柱做比较，结果发现卡那霉素在a t l a n d s d c l 84 6 1 5 0m m k 不保留，且不能完全分离( 图2 - 3 ) 3 1 2 提取条件的优化 3 1 2 1 提取液和洗脱液的选择 卡那霉素a 具有水溶性好的特点，因此提取液为水性溶液常用的氨基糖苷类药物提取 液有甲酸和高氯酸溶液，这两种酸溶液主要用于组织提取，特别是高氯酸溶液。本试验比较 了9 e , 4 的甲酸溶液和0 1m o l l 的盐酸溶液，结果发现0 1m o l l 的盐酸溶液可以将卡那霉素a 几乎l o o v 艉取出来，见表2 1 洗脱液的选择对回收率也有十分重要的影响根据m c x j , 柱 酸性条件下吸附，碱性条件下解离的特点，洗脱液选择5 氨水- 甲醇溶液如表2 - 2 所示，但 不同比例的氨水甲醇溶液混合对卡那霉素a 洗脱有不同的影响从结果可以发现5 氨水- 甲 醇溶液的洗脱效果最好 中国农业大学硕士学位论文试验一 m l 图2 - 3 卡那霉素a 用a t l a n t i sd c 柱分离的色谱图 f i g u r e 2 - 3t y p i c a lc h r o m n t o g r a mo f k a n a m y d n a w i t h a t l a n t i s d c t s e o l u m n 表2 - 1 不局溶液对卡那霉素 提取效果的影响 t a b l e 2 - 1 e 庙m 乜o f d i f f e r e n t e x c r a c t e ds o l u t i o n s o nk a n a m y c i n a i na n i m a l f e e d s 表2 - 2 不同洗脱液对卡那霉素 洗脱的影响 t a b l e 2 - 2 e f f i c i e n c yo f d i f f e r e n t c i n t e ds o l u t i o n s f o r k a n a m y c i n a 3 1 2 2 洗脱液用量对洗脱效果的影响 4 本试验研究了不同量的洗脱液对饲料中卡那霉素a 洗脱效果的影响结果发现用lm l 中胃农业大学硕士学位论文 试验一 1 i 量曼鲁! 曼鲁曼曼曼曼曼! 皇曼曼曼曼鲁 5 氨水甲醇溶液洗脱时，卡那霉素a 不能1 0 0 被洗脱下来，但用2m l 洗脱液时，卡那霉素 a 的回收率在9 8 4 因此本试验用2m l 的5 氨水- 甲醇溶液洗脱吸附在固相萃取小柱上的 卡那霉素a 3 1 3 祥品溶液的净化 饲料的基质复杂，尤其是预混合饲料和浓缩饲科，样品萃取后直接用于分析。容易造成 色谱柱的污染。缩短分析柱的使用寿命，同时也会由于柱压过高而影响仪器的正常使用，因 此上机前样品溶液的净化十分重要传统的液液萃取消耗大量的有机溶剂，萃取效率较低 而且不稳定，容易受饲料中的其它基质影响固相萃取技术是近年来发展起来的一种微量样 品处理技术，主要用于样品中微量或痕量目标化合物的分离、纯化和浓缩与液液萃取相比 可显著减少溶剂用量，简化预处理步骤并消除干扰本试验对o a s i s o m c x 和o a s i s 复合阴离 子( h y d r o p h i l i e l i p o p h i l i eb a l a n c e ，h l b ) s p e d 、柱进行了比较m c x 作用机理( 图2 - 4 ) ，其 作用基团为磺酸基h l b 填料是由新型的水浸润性聚合物吸附组成的，它是由亲脂的二乙烯 基苯和亲水的m 乙烯基毗略烷酮两种单体按比例聚合而成的，适合于含水样品中极性与非极 性有机化合物的同时分离从二者的试验结果发现，卡那霉素a 在h l b 上基本不保留，没有 被小柱上的填充基团吸附而是直接流出固相小柱( 图2 - 5 ) 根据卡那霉素a 的结构特点及理 化特性，本试验采用。嬲i s m c x 对样品进行净化。可以除去基质中大部分干扰物质尽管 在共同的萃取物中并不是所有的物质都能够被除去，但是在卡那霉素a 色谱蜂附近没有干扰 峰出现，因此不影响其定量分析的准确性。该小柱对卡那霉素a 的过柱回收率可达9 9 以上 ( 图2 - 6 ) 同时饲料样品提取后过该小柱的净化效果较好，可以将大部分饲料基质净化掉， 仅有小部分游离氨基酸等存留下来由于这些游离的氨基酸与卡那霉索a 的峰可以完全分 离，所以这些杂质并不影响卡那霉素a 的检测( 图2 7 ) 中国农业大学硕士学位论文试验一 1 6 m i x e d ( 碱性药物) 图2 - 4m c x 桂与碱性药物的作用机理 f i g u r e2 - 4 t h e m e c h a n i s mo f m c xc o l u m n 州 t i m e ( m i n ) 图2 5 标准溶液过h l b 小柱色谱图 f i g u r e 2 - 5 t h ec h r o m a t o g r a mo f k a n o m y c i n a s t a n d a r ds o l u t i o n t h r o u g h t h e h l bc o l u m n t i m e ( m i n ) 图2 - 6 卡那霉素 标准溶液直接检测图谱与过m c x 小柱净化检测图谱的比较 f i g u r e 7 - 6 t h ec h r o m a t o g r a mo f s t a n d a r ds o l u t i o n a n d t h es o l u t i o n t h r o u g h t h e m c xc u l u m u 中啻农业大学硕士学位论文 试验一 t i m ( m l n ) t i m e ( r a i n ) t i m c ( m i n ) 围2 - 7 饲料空白图谱爱饲料中卡那葛囊 色谱围 ( - ) 预混料空白图；( b ) 预混科2 0 0m r , n , g ：( c ) 标准溶液与配合饲料8 0m g k g 色谱图 f i 霉u ”2 - 7 t h e c h r o m a t o g r a mo f b l a n k f e e d a n dk a n a m y c i n a i n f e e d s ( i ) t h ee h r o m a t o g r a mo f b l a n ko f p r e m i x ；b ) p r e m i x2 0 0 m g k g ；t c ) s t a n d a r ds o l u t i o na n d 8 0 m g ，i g c o m p l e t ef e e d 1 7 2u-，jk 中国农业大学硕士学位论文 试验一 净化步骤及作用见表2 3 。结果表明，这个净化程序能很好的用于样品的前处理，并且 在目标峰附近没有干扰峰。 表2 - 3 固相萃取过程及作用 t a b l e2 - 3t h es t e p sa n dp u r p o s e so f s o l i dp h a s ee x t r a c t i o ni nf e e dc l e a n u p 3 1 4 衍生条件 3 1 4 1 衍生剂的选择 目前氨基糖苷类药物常用的衍生剂有o p a 和9 - 芴基甲氧碳酰氯 ( 9 一f l u o r e n y l m e t h o x y c a r b o n y lc h l o r i d e ，f m o c - c 1 ) 。它们与氨基糖苷类药物上的氨基结合， 形成一种能够发出荧光的物质卡那霉素a 经过o p a 衍生液衍生后有较强的荧光和紫外吸 收，经过f m o c - c 1 衍生液衍生后也具有较强的荧光吸收。然而f m o c - c 1 本身是一种荧光物 质( a i - a m o u d 等，2 0 0 2 ) ，卡那霉素a 经f m o c - c i 衍生后产生的吸收峰受至0 f m o c - c i 自身产 生的吸收峰的干扰( 图2 8 ) ，且用f m o c - c i 衍生还必须用甘氨酸进行终止，这就需要甘氮酸 的最佳用量及最佳浓度。因此，与o p a 相比又增加了试验的繁琐性。 3 1 4 2 衍生时间选择 图2 - 9 为用h p l c 分析所得卡那霉素a 的峰面积与衍生时间的曲线从图中我们可以 看出，随着衍生时间的增长，卡那霉素a 的吸光度增大，峰面积也就随之增大，衍生1 0m i n 时，峰面积达最大，超过1 0m i n 峰面积反而变小。 1 8 t7 t i m e ( r a i n ) 图2 - 8 f m o c c j - 一州 色谱图 f i g u r e2 - 8 t h ec h r n m a t o g r a mo f f m o c - c i k a n a m y c i n a 中国农业大学硕士学位论文试验一 3 3 姗 鬟姗 到o x 口 2 5 ) ，然后用无水甲醇定容至刻度 f m o c - c i 衍生液( 2 1 0 - 3t o o l l ) ：准确称取o 0 0 5 2gf m o c - c i 于1 0m l 容量瓶中， 加入1 0 m l 乙腈，待用 甘氨酸终止剂( 0 im o l l ) ：称取o 0 6 0 0g 甘氨酸，用8m l 超纯水溶解，待用 2 3 试验方法 2 3 1 样品的制备与提取 试验中所用的饲料均是在中国农业大学农业部饲料工业中心的中试车间配制完成，未添 加任何抗生素等药物添加剂，混匀后的样品粉碎并过o 2 5m m 筛。 称取5g 配合饲料( 浓缩饲料称取3g 预混合饲料称取lg ) 置于5 0m l 带盖的离心管中， 加入im l 储备液在离心管中加入4 0m l 样品提取液，盖好管盖，充分振摇约2 0m i n 于 离心机上以4 0 0 0r p m 的转速离一t m 0m i n ，上清液倒x 1 0 0m l 容量瓶中，残渣再分别用上述 提取剂3 0m l 、3 0m l 重复提取两次，每次振摇l 1 5m i n ，离, g , 1 0m i n 后合并上清液于1 0 0m l 容量瓶中，并稀释至刻度。摇匀，过滤，滤液待用 2 - 3 2 净化 本试验选用m c x 固相萃取小柱饲料对中新霉素进行净化吸取样品提取滤液1 5 也0 m l 于1 5m l 的离心管中，以2 0 0 0 0r p m 的转速离一6 1 0m i n 将净化用固相s p e 小柱固定于 s p e 减压净化系统上依次用1 0m l 甲醇和1 0m l 水活化和平衡用移液器准确移取lm l 中国农业大学硕士学位论文试验二 离心后的样品上清液加到s p e 小柱里，溶液流速是溶液在重力下自由通过s p e 小柱的速度， 大约2d r o p s s 。然后用1 0 m l 超纯水和1 0 m l 无水甲醇淋洗液各淋洗一次，最后用1 0 m l 洗 脱液将吸附在萃取小柱上的目标检测物分离下来，洗脱速度是在重力下自由下落。将洗脱液 置于氮吹仪上，吹干。准确加入1 0m l 硼酸缓冲液，在超声波中超声1m a n ，在振荡器上振 荡lm a n 使其充分溶解混匀，盖好，待用。 2 3 3 色谱分离条件 色谱柱：c 1 8 柱，x t e m “，r p i s 4 6 2 5 0m m ，粒度5r i m 的分析拄；2 0 4 6r n mi d ， 粒度5p m 的c l $ 保护柱；柱子温度为室温2 5 左右：流动相：超纯水和乙精梯度洗脱，表 2 - 9 。流速：1 0m l m i n ；荧光检测，激发波长：2 6 7n l n ；发射波长：3 0 9n f n ；迸样量：5 0 汕； 运行时间3 0 m a n 。 表2 - 9 新霉素洗脱程序 t a b l e2 - 9m o b i l ep h a s el i n e a rg r a d i e n tp r o g r a mf o rn e o m y c i n 3 结果与讨论 3 1 新霉素和安普霉素h p l c 方法的建立 3 1 1 新霉素的h p l c 条件 该药物极性较高且在荧光和紫外波段不发光，因此选择衍生和反相c - 8 柱进行分离。本 研究选用多数文献中报道的激发波长2 6 7n r n ，发射波长3 0 9i l m 作为试验的检测波长 ( p o s y n i a k 等，2 0 0 1 ) 。衍生剂选用最常用的f m o c c i ( s t e a d 和r i c h a r d s ，1 9 9 7 ) ，浓度为2 1 0 m o l ，流动相选用乙腈和水，在该条件下新霉素峰型对称，保留时间在1 7m i n 左右( 图 2 1 3 ) 。若用o p a 衍生液衍生，新霉素的响应值非常低。新霉素与f m o c c i 的反应时间与直 接影响新霉素的峰面积( 图2 1 4 ) ，影响该方法的检测灵敏度。反应时间为1 5r a i n 时新霉素 的响应值最大。与f m o c c i 反应1 5m a n 的衍生液需要甘氨酸终止，终止剂的浓度选择文献中 常用的0 im o l l ( s t e a d 和r i c h a r d s ，1 9 9 7 ) 。但终止后的衍生液要立即进行检测，因为随放 置时间的增长，药物峰面积衰减越大( 图2 1 5 ) 中国农业大学硕士学位论文 试验二 l 八 一，、j l 图2 一1 3 新霉素标准溶液色谱图 f i g u r e2 - 1 3t h ee h r o m a t o g r a mo f n e o m y c i ns t a n d a r ds o l u t i o n 1234 t i m e ( 血) 围2 - 1 4 新霉素时间衰减图 f i g u r e2 - “t k d e c 巧o f g m o c - c l - n e o m y c t ed e t - t v a t i v e 1 3 5 0 0 0 0 0 1 3 0 0 0 0 0 0 1 2 5 0 0 0 1 2 0 0 舢 1 1 5 0 n 衢n 556785 t i m e ( h l 图2 - 1 5 新