（内科学专业论文）hlrs3829461和rs1800588多态性与脑梗死的相关性.pdf

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0 0 5 ) 。多因素l o g i s t i c 回归分析显示 h l r s 3 8 2 9 4 6 1 多态性c c 型是脑梗死的危险因素( 尸= d 0 0 5 , 锨= j 7 8 8 5 , 9 5 c i ：1 2 0 4 , - , 2 8 5 9 ) 。 脑梗死组h l r s l8 0 0 5 8 8 c c 、c t 、t t 基因型频率分别为3 4 9 7 、 5 2 18 、1 2 8 8 ，对照组分别为5 4 5 5 、3 7 6 6 、7 7 9 ，有统计学意 义( 尸 - 0 0 5 ) 。脑梗死组h d l c 、a p o a l 水平低于对照组，而t c 、l d l c 、 t g 、明显高于对照组( 尸锄彷) ；按性别分层，脑梗死组男性c c 型 h d l c 、a p o a l 明显低于对照组，t c 、t g 、l d l c 明显高于对照组；脑 梗死组男性c t 型t c 、l d l c ，t g 高于对照组( 尸 - 0 0 5 ) ；脑梗死组女性 c c 型h d l c 、a p o a l 低于对照组，t c 、t g 、l d l c 、a p o b 高于对照组( p 知0 5 ) ，脑梗死组女性c m 型h d l c 、a p o a l 低于对照组，t c 、t g 、 l d l c 高于对照组( 尸 - 0 0 5 ) ，脑梗死组患者1 v r + c t 型h d l c 、a p o a l 水平 明显低于同基因型脑梗死组c c 型( 尸 - 0 0 5 ) 。多因素l o g i s t i c 回归分析显示 基因型c c 型可以导致患者的低h d l c 血症。2h l r s l 8 0 0 5 8 8 启动子多态 性t 等位基因与脑梗死的发生相关。h l r s l 8 0 0 5 8 8 启动子可能与血浆 h d l c 水平相关。 关键词：h l ；基因多态性；脑梗死；血浆脂蛋白 h l r s 3 8 2 9 4 6 1 和r s l 8 0 0 5 8 8 多态性与 a b s t r a c t o b j e c t i v et oi n v e s t i g a t et h ea s s o c i a t i o no f t h es t h eh e p a t i cl i p a s e ( h l ) g e n ew i t hc e r e b r a li n f a r c t i o n ( c oa n ds e t u ml i p i d m e t h o d s3 2 6p a t i e n t sw i t hc e r e b r a li n f a r c t i o na n d2 31n o r m a lc o n t r o l sw e r e e n r o l l e di nt h ep r e s e n ts t u d y g e n o t y p i n go fr s 3 8 2 9 4 6 1a n dm 18 0 0 5 8 8w a sp e r f o r m e d b yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( p c r - r f l p ) r e s u l t st h ef r e q u e n c i e so f h e p a t i cl i p a s eg e n er s 3 8 2 9 4 6 1p o l y m o r p h i s r nc c ，c t , t rw e r e 8 5 5 8 ，1 3 5 0 ，0 9 2 i nc ip a t i e n t sa n d7 7 6 2 ，2 2 5 1 ，0 8 7 i nn o r m a l c o n t r o l s ，r e s p e c t i v e l y ( p 妃旧t h ea v e r a g el e v e l so fh d l - c w e r el o w e ri nc ip a t i e n t s t h a nt h o s ei nn o r m a lc o n t r o l s ，w h e r e a st h el e v e l so ft ca n dl d l cw e r eh i g h e ri nc i p a t i e n t st h a nt h o s ei nn o r m a lc o n t r o l s ( p 姐蚴w h e ns t r a t i f i e db ys e x ，t h el e v e l so f h d l - cw i t hg e n o t y p ec t 椰i nf e m a l ep a t i e n t sw e r em u c hh i g h e rt h a nl e v e l so f h d l cw i t hg e n o t y p ec c 俨 o 。o ”l o g i s t i cr e g r e s s i o n a n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h er s 3 8 2 9 4 6 1p o l y m o r p h i s mg e n o t y p ec cw a ss u s c e p t i v et o c 1 妒= o 0 0 5 o r = i 8 8 5 , 9 5 c 1 ：1 2 0 4 2 8 5 t h ea l l e l ef r e q u e n c i e so fm 18 0 0 5 8 8w e r es i g n i f i c a n tb e t w e e nc ip a t i e n t sa n d c o n t r o lg r o u p s t h ef r e q u e n c i e so fc c ，c t ，t tw e r e 3 4 9 7 ，5 2 18 ，12 8 8 i nc i p a t i e n t sa n d5 4 5 5 ，3 7 6 6 ，7 7 9 i nn o r m a lc o n t r o l s ，r e s p e c t i v e l y ( o o 受t h e l e v e l so fh d l - c 、a p o a1w e r el o w e ri nc ip a t i e n t sc o m p a r e dw i t l lc o n t r o lg r o u p s ， w h e r e a st h el e v e l so ft c 、t g 、l d l - cw e r eh i g h e rc ip a t i e n t s c o m p a r e dw i t hc o n t r o l g r o u p s ( p 0 0 5 ) w h e ns t r a t i f i e db ys e x ，t h el e v e l so fh d l c 、a p o a 1i nm a l e p a t i e n t sg e n o t y p ec cw e r em u c hl o w e ri nc ip a t i e n t sc o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p s ， t h el e v e l so ft c 、t g 、l d l - ci nm a l ep a t i e n t sg e n o t y p ec cw e r eh i g h e ri nc ip a t i e n t s c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p s ( 尸姐) ；t h el e v e l so f t c 、t g l d l ci nm a l ep a t i e n t s g e n o t y p ec t + t t w e r eh i g h e ri nc ip a t i e n t sc o m p a r e dw i mc o n t r o lg r o u p s 俨 礁) ； t h el e v e l so fh d l - c 、a p o a li nf e m a l ep a t i e n t sg e n o t y p ec cw e r el o w e ri nc ip a t i e n t s c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p s ，t h el e v e l so ft c 、t g 、l d l ci n f e m a l ep a t i e n t s g e n o t y p ec t + t r w e r eh i g h e ri nc ip a t i e n t sc o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p s ( p 0 0 5 ) ； i v i n f a r c t i o n 2 t h ep o l y m o r p h i s mo fr s l8 0 0 5 8 8w a ss u s c e p t i v et oc e r e b r a li n f a r c t i o n t h e p o l y m o r p h i s mo f r s l8 0 0 5 8 8w a sa s s o c i a t e dw i 廿1h d l - co f s e r u ml i p i d k e y w o r d s ：h e p a t i cl i p a s e , g e n ep o l y m o r p h i s m ，c e r e b r a li n f a r c t i o n , s a - u ml i p i d v h l r s 3 8 2 9 4 6 1 和r s l 8 0 0 5 8 8 多态性与脑梗死的相关性 目录 第一章前言1 1 1h l 的合成、结构和功能2 1 2h l 在动脉粥样硬化过程中的作用4 第二章材料和方法7 2 1 研究对象7 2 2 主要实验仪器7 2 3 主要试剂8 2 4 数据库：9 2 5 主要溶液配制一9 2 6 试验方法1o 2 7 统计学方法一l4 第三章结果1 5 3 1 临床资料一1 5 3 2目的d n a 片段p c r 扩增结果l5 3 2 1 目的h l r s 3 8 2 9 4 6 1 d n a 片段p c r 扩增结果1 5 3 2 2 目的h l r s l 8 0 0 5 8 8 d n a 片段p c r 扩增结果1 6 3 3目的p c r 产物酶切基因型分型1 6 3 3 1h l r s 3 8 2 9 4 6 1 基因型酶切分析1 6 3 3 2h l r s l 8 0 0 5 8 8 基因型酶切分析1 7 3 4h l r s 3 8 2 9 4 6 1 多态性序列分析l7 3 5 脑梗死组与对照组h l 多态性分布频率的比较1 8 3 5 1脑梗死组与对照组h l r s 3 8 2 9 4 6 1 多态性分布频率的比较1 8 3 5 2脑梗死组与对照组h l r s l 8 0 0 5 8 8 多态性分布频率的比较1 8 3 6h l 脑梗死组与对照组血脂水平对照比较1 9 3 6 1 h l r s 3 8 2 9 4 6 1 脑梗死组与对照组血脂水平对照比较1 9 3 6 2 脑梗死组与对照组h l r s l 8 0 0 5 8 8 血脂水平对照比较1 9 3 7 脑梗死组与对照组不同性别h l 各基因型血脂水平的比较2 0 v 1 住论文 h l r s 3 8 2 9 4 6 1 各基因型血脂水平的 2 0 h l r s l 8 0 0 5 8 8 各基因型血脂水平的 2 0 ：11 c 回归分析2 l c 回归分析2 2 2 3 4 1h l r s 3 8 2 9 4 6 1 多态性与脑梗死及危险因素的相关性2 3 4 2h l r s l 8 0 0 5 8 8 ( - 5 1 4 c t ) 多态性与脑梗死及危险因素的相关性2 4 第五章结论2 6 参考文献2 7 综述缺血性脑卒中发病基因多态性3 1 附录h l 多态性与高甘油三酯血症的相关性研究4 0 致谢4 8 在读期间发表和投稿的论文4 9 v h l r s 3 8 2 9 4 6 1 和r s l8 0 0 5 8 8 多态性与脑梗死的相关性 英文缩略词 v i i i 江苏大学硕士学位论文 第一章前言 脑梗死( c e r e b r a li n f a r c t i o n ，c i ) 又称缺血性脑卒中，是由于脑动脉主干或皮 质支动脉粥样硬化导致血管壁增厚、管腔狭窄闭塞和血栓形成，引起脑局部血流 减少或供血中断，脑组织缺血缺氧导致软化坏死，局灶性系统症状体征。常继发 于动脉粥样硬化和高血压性动脉硬化，脑梗死的发病有众多复杂的遗传和环境因 素，基因变异是脑血管病的主要发病因素之一，具有明显的家族倾向。目前，人 们普遍认为基因多态性与脑梗死发病有密切相关性。 脑梗死是国际上死亡原因的三大类疾病之一，是我过死亡疾病的首要原因。 脑梗死发病率、致残率相当高，存活中5 0 7 0 的病人遗留瘫痪、失语等严重残 疾，给家庭和社会带来沉重的负担。大量临床研究表明动脉粥样硬化 ( a t h e r o s c l e r o s i s ，a s ) 是脑梗死的病理学基础，动脉粥样斑块是由遗传因素与多种 环境因素长期交互作用形成，其中血脂异常参与动脉壁从脂质堆积到斑块进展和 血栓形成的整个过程，在a s 的发生和发展中起着核心作用。高密度脂蛋白胆固醇 ( 1 1 i g l ld e n s i t yl i p o p r o t e i nc h o l e s t e r o l ，h d l c ) 是血浆中密度最高，颗粒最小的一 组脂蛋白，是血脂代谢的基础物质，h d l c 主要作用是将肝脏以外的胆固醇转运 到肝脏进行分解代谢，使血清游离胆固醇转化为乳糜微粒，可组织乳糜微粒在动 脉壁和其他组织中积聚，h d l c 增高有利于外周组织清除胆固醇，从而防止动脉 粥样硬化，故h d l c 被认为是抗动脉粥样硬化因子。研究表明h l 多态性与其酶活 性有关，h l ( h e p a t i cl i p a s e ，h l ) 的活性与血脂代谢密切相关i 堙】。t g 水平增高是 动脉粥样硬化的独立危险因素之一，t g 又称中性脂肪，由3 分子脂肪酸和1 分子甘 油酯化而成，是体内能量的主要来源。t g 主要存在于脂蛋白和乳糜微粒中，甘油 三酯是以极低密度脂蛋白循环于血液之中，极低密度脂蛋白转变为小而致密的脂 蛋白将导致动脉粥样硬化能力增高。除t g 外，外周血中还存在甘油二酯、甘油一 酯( 两者总和不足t g 的3 ) 和游离甘油( f g ) 。各种脂蛋白中，乳糜微粒( c m ) 、 极低密度脂蛋白( v l d l ) 及其残粒被t g 含量高，被统称为富含t g 脂蛋白( t r l ) ， 也称残粒样脂蛋白( r l p ) ，t g 在血浆中直接参与胆固醇和胆固醇酯合成。越来越 多的临床与实验证据提示，t r l 在a s 病因学中扮演重要角色，可能作用于a s 病变 早期。低密度脂蛋白胆固醇( 1 0 w d e n s i t y l i p o p r o t e i n ，l d l c ) 是由极低密度脂蛋 h l r s 3 8 2 9 4 6 1 和r s l 8 0 0 5 8 8 多态性与脑梗死的相关性 白( v l d l ) 转变而来。主要功能是把胆固醇运输到全身各处细胞，运输到肝脏合 成胆酸。每种脂蛋白都携带有一定的胆固醇，携带胆固醇最多的脂蛋白是l d l 。 体内2 3 的l d l 是通过受体介导途径吸收入肝和肝外组织，经代谢而清除的。余下 的三分之一是通过一条“清扫者”通路而被清除的，在这一非受体通路中，巨噬细胞 与l d l 结合，吸收l d l 中的胆固醇，这样胆固醇就留在细胞内，变成“泡沫”细胞。 因此，l d l 能够进入动脉壁细胞，并带入胆固醇。l d l 水平过高能致动脉粥样硬化。 近年来大量研究资料证明，h l 多态性与血脂及动脉粥样硬化密切相关，其中 关于h l 多态性的研究备受关注。 1 1h l 的合成、结构和功能 h l 是由肝脏细胞合成和分泌一种酸性糖蛋白，通过离子相互作用与硫酸肝素 蛋白聚糖( h e p e r a n 文1 l 自t ep r o t e o g l y c a n s ，h s p g ) 结厶t 2 1 ，是一种由4 7 6 个氨基酸组 成的糖蛋白，定位于肝细胞微绒毛外表面和肝窦状隙内皮细胞【3 4 】，位于染色体 1 5 q 2 1 - 2 2 ，基因全长3 5 k b ，含有9 个外显子，8 个内含子【5 6 。旮8 ，9 1 研究表g q h l 酶化作 用有赖于位于5 6 位天冬酰胺，h l 有两个结构区域，n 端3 3 5 个氨基酸残基是催化结 构域，酶催化活性中心由g l y - s e r - g l y 构成。c 端的3 3 6 - 4 4 8 氨基酸残基是与细胞表面 的h s p g 结合的结构域。新合成的h l 需要在内质网糖基化后转移到高尔基体，形成 具有催化活性的h l 。d u 西等研究表明【1 0 】，l p l 0 勺同源区域替换嵌合体酶上一个假想的 环路区域，这一区域覆盖h l 活性位点，结果这一环路覆盖了h l 的活性位点以至于 抑制了h l 对甘油三酯与磷脂的水解作用( 如图1 ) 。 n t e r m i n a ld o m a i n c t e r m i n a ld o m a i n l o o p d o m a i n 图1h l 的活性区域结构 江苏大学硕士学位论文 h l 水解磷脂( p l ) 和甘油三酯( t g ) 。它的功能如同磷脂酶a l 可以水解t g l 号 和3 号位置脂肪酸。它优先水解磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱( 不饱和脂肪酸和花生 四烯【l l l 。尼尔森医生和他的同事【1 2 】的早期研究表明h l 扮演了在体内一个特殊的 角色，乳糜微粒( c m ) 和高密度脂蛋白( h d l ) 是由肝脏分解和转运的。因为 h l 是2 酰基溶血磷脂酰胆碱和2 酰基一溶血磷脂酰乙醇胺的产物，是一种磷脂酶 a l 。这些溶血磷脂很可能迅速在肝细胞再利用，其机制与储存不饱和脂肪有关。 在1 9 8 6 年有证据指出h l 在水解t g 中一个作用在于它能够的聚积餐后高密度脂 蛋白( h d l ) ，认为那是在于高密度脂蛋白h d l 的亚型h d l 2 和h d l 3 之间平衡， 这种平衡是h l 和卵磷脂胆固醇酰基转移酶对h d l 的竞争结果。也有研究认为h l 在低密度脂蛋白( l d l ) 甘油三酯水解极低密度脂蛋白( v l d l ) 转换为低密度脂蛋白 ( l d l ) 过程中的最后阶段起重要作用。大量的实验室研究工作，已经表明在体外实 验中大量的h d l 是被h l 水解的，其产物是形成一个低胆固醇磷脂一载脂蛋白a l 复合体，称为p r e b h d l 。虽然p r e b h d l 被认为是最活跃的高密度脂蛋白( h d l ) 的一个分子，能吸收来自细胞的胆固醇，但它也可快速从载脂蛋白a 1 分解代谢 1 3 】。 c h e u n g 等【1 4 】从肾病综合征患者血清中提取了具有p r e b - h d l 特点的脂肪酶抑制剂。 结合这些研究表明p r e b h d l 作为h l 的作用产物，也是h l 一种抑制剂，能反馈 h l 的活动和调节p r e b h d l 下游产物。既然l c a t 可用p r e b h d l 作为底物，那么 平衡在于高密度脂蛋白亚型包括l c a t 、h l 竞争决定的p r e b h d l 和t g 富含h d l 的机制之间。 h l 在过剩的脂蛋白清除所起到桥梁作用。h l 在清除过剩的c m 和v l d l 的 作用还没得到明确证实。h l 可能在肝脏清除脂蛋白的多途径中出现，库珀【搭】彳艮好 总结和精确的评价了这些研究发现。目前的概念包含两步的过程，起初在肝脏狄 氏腔过剩的脂蛋白通过螯合作用与肝素、l d l 受体相关蛋白或h l 位点结合了， 这种结合作用依赖于包含载脂蛋白e 的微粒或者需要进入狄氏腔的载脂蛋白e 微 粒。第二步，这种螫合作用可能因为内在化的过剩微粒以更慢的形式出现而变得 迅速。有研究1 1 6 1 7 1 也表明h l 不需要主动变形参与螯合作用，且当脂蛋白结合功能 和肝素结合功能是完整的时候才起到“桥梁”作用。h u f f 等1 1 8 】通过建立肝细胞模型 研究来自v l d l 的胆固醇酯积累的决定因素是h e p g 2 ，h e p g 2 可以分泌和结合h l 。 在具有重要意义的h e p g 2 聚积胆固醇酯发现之前，典型的人类v l d l 是涉及l p l 3 h l r s 3 8 2 9 4 6 1 和r s l 8 0 0 5 8 8 多态性与脑梗死的相关性 的一个脂解过程。一旦酯化，这种聚积作用就需要肝素来起作用。大约有5 0 的 胆固醇酯积累作用被脂肪酶抑制剂，即四氢利泼斯汀所抑制。因此，在这一模型中， 大约一半脂蛋白的摄取取决于h l 的酶活性。 1 2h l 在动脉粥样硬化过程中的作用 在血浆中，h l 作为脂肪酶大家族中的一员与磷脂酶a 2 共同在脂质转运中起重 要作用，h l 不仅影响血浆脂蛋白的代谢和转运，而且还影响细胞内脂质代谢【1 9 1 。 h l 是脂质代谢途径的关键酶，大量研究表明h l 既有促进动脉粥样硬化，又有抗动脉 粥样硬化两方面作用【2 0 】。 1 2 1h l 致动脉粥样硬化作用 h l 可水解c m 、v l d l 、l d l 及h d l 中的t g ，释放出游离脂肪酸，在体内，h l 可水解c m 残粒表面的磷脂，使c m 残骸中的载脂蛋自e 暴露出来，促进c m 残骸与可 识别的载脂蛋白e 受体结合f 2 1 1 。h l 能水解i d l i 内核中残余的t g ，将i d l 转变成l d l 。 h l 活性改变还可以引起l d l 颗粒大小的改变，从而改变血浆小颗粒致密l d l 浓度。 h l 还可选择性地作用于h d l 2 ，水解其中的t g 和磷脂【2 2 1 。h d l 2 的磷脂水解后，表面 的胆固醇与磷脂的比例增高，促进胆固醇向肝脏流动【2 3 1 ，这有利于肝脏摄取h d l 中 胆固醇及其酯。与此同时，h d l 2 转变成h d l 3 进入血液循环，又可从肝外组织获取胆 固醇及其酯。可见，h l 在胆固醇逆向转运过程中起着十分重要的作用，h l 除了作为 酶发挥上述催化功能外，还可作为脂蛋白与肝细胞结合的配体蛋白参与肝脏对脂蛋 白的结合和摄取。d o n n e r 等【2 4 1 研究发现，表达h l 的细胞对脂蛋白的结合和摄取显著 增加；h l 不仅能够介导l r p 与脂蛋白的结合，从而促进细胞对脂蛋白的摄取【2 5 1 ，也能 介导l d l 受体与脂蛋白结合、通过l d l 受体促进细胞对脂蛋白降解【2 6 1 。h l 介导上 述脂蛋白受体与相应脂蛋白的结合是通过细胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖完成的【2 7 1 ， 因为缺乏这种蛋白聚糖的c h o 细胞不能降解h l ，肝素酶处理能抑$ 1 h l 介导的乳糜 微粒残粒摄取。 1 2 2h l 活性改变也起到抗动脉粥样硬化作用 h l 活性的改变可以通过不同方式改变h d l 抗动脉粥样硬化作用。h l 抗动脉 粥样硬化主要机制一方面作为配体，促进肝细胞摄取胆固醇和含载脂蛋白b 的脂 蛋白，降低血液中各种脂蛋白的浓度，起到抗动脉粥样硬化的作用，与h d l 受体 4 江苏大学硕士学位论文 等一起促进肝细胞摄取h d l - c 中的胆固醇，实现胆固醇的逆向转运；另一方面是 促进餐后血脂的清除，乳糜微粒具有致动脉粥样硬化作用，h l 可通过多种途径促 进餐后血脂( 乳糜微粒) 清除【2 6 】。h e d r i c k 等【2 8 】研究表明在a p o e 缺乏的小鼠，h l 的 缺乏将通过h d l 来提高胆固醇水平。m e z d o u r 等【2 9 】报道在a p o a i i 过渡表达的小鼠， h l 活性受到抑制，丧失了抗炎症反应功能而变成促进炎症反应，这一结果证明， h l 也影响其它脂蛋白代谢，可以解释为什么在h l 活性降低，h d l 水平增高并不 总是减少外周动脉的脂质沉积。 目前，h l 突变与动脉粥样硬化及脑梗死的研究结论尚不一致，且研究样本量 少，缺乏大样本实验。国内鲜有对上海市汉族人群h l r s 3 8 2 9 4 6 1 和r s l 8 0 0 5 8 8 位点基 因多态性与脑梗死关系的相关研究报道。本研究通过检测上海市汉族人群脑梗死 患者和健康对照者h l r s 3 8 2 9 4 6 1 和r s l8 0 0 5 8 8 基因多态性，了解它们在上海市汉族人 群等位基因频率分布情况及其与脑梗死发病及血脂代谢的相关性，对上海市汉族 人群脑梗死的分子遗传学研究提出新的方向，为脑梗死的预防和治疗提供新的理 论依据。 5 h l r s 3 8 2 9 4 6 1 和r s l8 0 0 5 8 8 多态性与脑梗死的相关性 6 实验技术路线 ll i入选病例 采血 1r 提取d n a 1 r 1r p c r 扩增目的d n a 一般资料收集 1r d n a 序列分析 1r 酶切和电泳 1r 血清h l 基因分型 1 ，上 上 统计分析 土 l 结论l li 闵行区中心 其中男1 7 4 女1 1 2 例， 两组在性别、年龄、既往疾病等方面具有可比性，居住地相同，均为汉族。 2 制定筛选标准 纳入标准： ( 1 ) 发病2 4 d 时内入院的急性脑梗死患者。 ( 2 ) 所有患者符合1 9 9 5 年1 0 月中华医学会第四届全国脑血管病会议制定的各 类脑血管疾病诊断要点，并经头部c t m r i 检查证实。 ( 3 ) 患者病情加重后经头颅c t 复查排除梗死后出血。 ( 4 ) 均接受规范的治疗方案( 如抗血小板、扩容、降压降糖、神经保护治疗) 。 排除标准 ( 1 ) 自身免疫性疾病、恶性肿瘤患者、血液系统疾病、风湿性疾病者，有严重 的肝肾功能不全者。 ( 2 ) 6 个月内有脑血管病史、急性心肌梗死、心肺复苏史者。 除记录神经系统病史及高血压、糖尿病病史外，还包括以下血管危险因素t 吸 烟、血糖( g l u ) 、总胆固醇( t c ) 、甘油三酯( t g ) 、高密度脂蛋白( h d l c ) 、低密度脂 蛋i 刍( l d l - - - c ) ，载脂蛋l 刍a ( a p o a ) ，载脂蛋l 刍b ( a p o b ) ，载脂蛋仨i e ( a p o e ) 。 该研究经本院医学伦理委员会批准，并征得所有入选群体签署知情同意书。 2 2 主要实验仪器 7 h l r s 3 8 2 9 4 6 1 和r s l 8 0 0 5 8 8 多态性与脑梗死的相关性 仪器名称 微量移液器( 1 洲，l o o u l ，2 0 0 u l ，5 0 0 u l ，l o o o u l ) 电热恒温水浴箱 微波炉 科大创新冷冻高速离心机 p c r 全自动扩增仪 t a k a r a 卧式电泳仪 b i o r a d 凝胶成像仪 c 8 0 0 0 全自动生化分析仪 s a n y o 低温血浆储存冰箱 涡旋振荡器 全自动洗板仪 酶标仪 电子天平 高速台式离心机 电热恒温干燥箱 2 3 主要试剂 主要试剂 高保真d n a 聚合酶( t a q 酶) 脱氧核苷三磷酸( d n t p ) lo x r e a c t i o nb u f f e r m g c l 2 t r i s c 1 饱和酚 三氯甲烷( c h c l 3 氯仿) 无水乙醇 琼脂糖( a g a r o s e ) d n am a r k p r e m i xe x t a qh s 厂家或品牌 上海森信实验仪器有限公司 格兰仕机械型有限公司 k d c 16 0 h r 德国b i o m t r a 公司 m u p i d - o n e 美国伯乐医疗器械有限公司 日本积水有限公司 青岛海尔股份有限公司 上海医科大学仪器厂 上海立信仪器有限公司 上海光正医疗仪器有限公司 德国b i o m e t r a 公司 上海跃进医疗器械厂 试剂提供或生产厂家 t a k a r a ，宝生物工程( 大连) 有限公司 t a k a r a ，宝生物工程( 大连) 有限公司 t a k a r a , 宝生物工程( 大连) 有限公司 t a k a r a , 宝生物工程( 大连) 有限公司 上海生工生物工程有限公司 上海化学试剂厂 上海振兴化工一厂 d i s t r i b u t e db yg e n et e c hc o m p a n yl i m i t e d t a k a r a ，宝生物工程( 大连) 有限公司 t a k a r a , 宝生物工程( 大连) 有限公司 。_ l 大学硕士学位论文 溴化乙锭 l o a d i n gb u f f e r 蛋白酶k 硼酸( b o r i ca c i d ) 溴芬兰( b r o m p h e n o lb l u e ) 氯化钠( n a c l ) 氢氧化钠( n a o h ) 磷酸氢二钠( n a 2 h p 0 4 ) 磷酸二氢钾( 1 ( h 2 p 0 4 ) 乙二胺四乙酸二钠( e d t a - n a 2 ) 三羟甲基氨基甲烷( 强s ) 十二烷基硫酸钠( s d s ) 醋酸钠( c h 3 c o o n a ) 虾碱酶 核酸外切酶 2 4 数据库 上海生工生物技术有限公司 t a k a r a , 宝生物工程( 大连) 有限公司 t a k a r a , 宝生物工程( 大连) 有限公司 t a k a r a , 宝生物工程( 大连) 有限公司 t a k a r a , 宝生物工程( 大连) 有限公司 t a k a r a ，宝生物工程( 大连) 有限公司 上海化学试剂厂 上海化学试剂厂 北京鼎国生物技术公司 上海凌峰化学试剂有限公司 上海生工生物工程有限公司 上海化学试剂厂 北京化工厂 北京化工厂 北京鼎国生物技术公司 s i g m a , 上海美季生物技术有限公司 g eh e a l t h c a r e v o v a g e n ( 1 ) n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ( n c b l ) ：g e n e b a n k 数据库( h t t p ：w w w n c b i h i m n i h g o v ) ( 2 ) h u m a ng e n em u t a t i o nd a t a b a s e 数据库 ( h t t p ：a r c h i v e u w c l n a c u k | u w c m m g h g m d h t m l ) ( 3 ) g e n e t i c ss e q u e n c e 数据库( h t t p ：w w w s e m b l r g d e x t m d 2 5 主要溶液配制 溶液配制时液体无特殊说明，均为蒸馏水。 9 h l r s 3 8 2 9 4 6 1 和r s l 8 0 0 5 8 8 多态性与脑梗死的相关性 ( 1 ) e d t a ( 0 5 m o l l ，h8 0 ) ；平称取e d t a o n a 24 6 5 2 5 9 、n a o h5 5 9 倒入容器 中，加蒸馏水2 0 0 m l ，磁力搅拌2 0 分钟，调p h 至8 0 移入容量瓶，定容至2 5 0 m l ， 高压蒸汽灭菌。 ( 2 ) p b s 缓冲液( g ) n a c l4 0 k c l0 1 n a 2 h p 0 4 0 7 8 k h 2 p 0 4 0 1 加蒸馏水定容至5 0 0 m l ，高压蒸汽灭菌，常温保存。 ( 3 ) 3 m o f l 醋酸钠溶液：无水醋酸钠粉末2 4 6 0 9 克加双蒸水定容至1 0 0 m l ， 高压灭菌，常温保存。 ( 4 ) d n a 抽提缓冲液( g ) i r i s 0 1 2 1 s d s0 5 e d t a3 7 2 2 加蒸馏水定容至l o o m l ，加n a o h 调p h 至8 0 ，高压蒸汽灭菌，3 7 ( 2 保存。 ( 5 ) t b e ( 1 0 x 5 0 0 m lp h8 3 ) t r i s 5 4 9 硼酸 2 7 5 9 e d t a ( 0 5 m m o l l ) 2 0 m l 加蒸馏水4 0 0 m l ，移入容量瓶，定容至5 0 0 m l ，使用时稀释2 0 倍。 ( 6 ) 2 琼脂糖：电子天平称取琼脂糖2 o g 放入烧杯中，加入t b e l 0 0 m l ， 混匀，把烧杯移至微波炉中加热至琼脂糖溶解。 2 6 试验方法 1 基因组d n a 提取：采集人外周静脉血2 m l ，枸橼酸钠抗凝，分离血浆和白 细胞，以经典酚一氯仿提取白细胞基因组d n a 。具体步骤如下： ( 1 ) 2m l 新鲜抗凝血，2 0 0 0 r p m 离心，1 0 m i n ： ( 2 ) 吸取上层血清放入8 0 冰箱保存； 1 0 江苏大学硕士学位论文 ( 3 ) 血细胞中加l y s i sb u f f e r 至1 0 m l ，混匀，室温静置1 5 m i n ： ( 4 ) 2 0 0 0 r p m 离心，1 0 r a i n ，弃上清； ( 5 ) 沉淀加入1 s m l 细胞裂解液( 1 y s i sb u f f e r ) ，轻轻上下振荡至透明，移至 1 5 m le p p c n d o r f 管； ( 6 ) 4 0 0 0 r p m 离心，l o m i n ，彻底弃上清； ( 7 ) 沉淀加入0 5 m le x t r a c t i o nb u f f e r ，混匀，3 7 水浴1 小时； ( 8 ) 加1 8 p 1 蛋白酶k ( 2 0m g m 1 ) ，3 7 ( 2 过夜； ( 9 ) 冷却至室温，加入等体积酚和氯仿各约5 0 0 i d ，轻轻上下振荡混匀5m i r a ( 1 0 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心，l o m i n ，4 c ； ( 1 1 ) 小心吸取上清至一个新的无菌离心管内，加入等体积氯仿，混匀； ( 1 2 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心， 1 0 m i n ，4 c ； ( 1 3 ) 小心吸取上清至新的无菌离心管内，加入2 倍体积的无水乙醇，轻轻 振荡可见白色絮状沉淀物，即为所要提取的基因组d n a ： ( 1 4 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心，1 5 m i n ，4 ； ( 15 ) 弃上液，7 5 乙醇洗涤沉淀， 1 2 0 0 0 r p m 离心，l o m i n ： ( 1 6 ) 弃乙醇，自然风干( 约1 5 m i n ) ； ( 1 7 ) 加适量( 4 0 5 0 i t 1 ) t e 缓冲液溶解d n a ； ( 1 8 ) 将d n a 置一8 0 冰箱保存。 2 目的片段p c r 扩增 1 ) 引物设计与合成：利用国际互联网在人类基因库中对h l 的s n p s 进行检 索，选定h l r s 3 8 2 9 4 6 1 和r s l8 0 0 5 8 8 位点，根据引物设计原则设计引物， h l r s 3 8 2 9 4 6 1 上游引物：5 g g c l 队c a c c t c c t a c t c a c3 ： 下游引物：5 ，c a a g 从g a t a 从c c a c c a l 盯3 ，扩增目的片段大小为3 0 2 b p 。 h l r sl8 0 0 5 8 8 上游引物：5 c t g g c t c a g g a a a g t g gt g t t 3 ； 下游引物：5 ，c a a g g g c a t c l 广r g c t t c t3 ，扩增目的片段大小为2 0 0 b p 。 2 ) p c r 扩增反应体系( 2 0 山) h l r s 3 8 2 9 4 6 l 和r s l 8 0 0 5 8 8 多态性与脑梗死的相关性 h o t 热启动混合t a q 酶 上游引物( 浓度i o p m ) 下游引物( 浓度l o 肛m ) 去离子水 模板d n a 3 ) 反应条件 1 0 m o 2 5 m o 2 5 m 8 5 m l p l h l r s 3 8 2 9 4 6 1 首先：9 5 ( 2 预变性5 m i r a 其次：9 5 c 变性4 0 s ，5 6 x 3 退火3 0 s ， 7 2 延伸4 0 s ，共3 0 个循环；最后：7 2 延伸5