（动物遗传育种与繁殖专业论文）猪MEF2A基因的克隆及表达规律的研究.pdf

摘要 摘要 m e f 2 家族属于m a d s 超家族，广泛的存在于骨骼肌与心肌细胞中，是最早发现具有肌 肉调控特性的d n a 结合活性因子。m e f 2 是肌肉组织发生和发育过程中的重要调控因子，控 制脊椎动物肌肉特异基因表达，在肌纤维发育和神经系统发育中都起重要调节作用。基于肌 细胞增强子在调控细胞增殖和肌肉分化中的重要作用。，进一步揭示其功能和作用机理，有助 于更好的理解肌肉组织的发生与发育模式。本研究采用比较基因组学和生物信息学等方法， 克隆m e f 2 a 基因并对其结构进行分析；通过构建分子进化树来研究m e f 2 a 基因的系统发育： 采用r e a lt i m ep c r 方法，研究了纯种大白猪m e f 2 a 基因不同组织不同发育阶段的表达规律 和m e f 2 家族4 个基因的组织表达规律。主要研究结果如下： 1 克隆了猪m e f 2 a 基因c d n a 序列( g e n b a n k a c c e s s i o nn u m b e r ：e f 5 7 6 9 2 3 ) ，基因编 码区全长1 5 2 4b p ，编码5 0 8 个氨基酸，分子量为5 0 8 4 4 9 8d a ，其结构上存在一个m a d s - b o x 的结构域、位于1 0 2 4 3 附近。 2 对猪m e f 2 家族基因的4 个基因进行多重序列比对，发现一个极高的同源性区域，此 处主要为m a d s - b o x 区。4 个基因的m a d s 保守结构域同源比对分析，表明m e f 2 b 与m e f 2 d 的m a d s - b o x 结构域的同源性最高为1 0 0 ，m e f 2 a 与m e f 2 b 和m e f 2 d 的m a d s - b o x 结 构域分化程度最大，同源性为8 9 。 3 基于猪m e f 2 , 4 基因的c d n a 序列，依据n e i g h b o r - j o i n i n g 算法，构建了9 个物种分 子进化关系树。 4 采用r e a lt i m ep c r 的方法对9 0 、1 8 0 、2 7 0 日龄纯种大白猪的m e f 2 a 基因心、肝、 胃、脾、肾、肺、大肠、小肠、背肌、腿肌1 0 个组织表达量进行了检测：表明m e f 2 a 基因 在肌肉组织中表达量较高且稳定，在其他组织中表达量较低，肝中的表达量最低。 5 同样方法对9 0 日龄m e f 2 家族4 个基因进行了1 0 个组织的表达量检测，4 个基因组 织表达上具有共同特征：肌肉组织( 背肌、腿肌、心肌) 表达量较高，脏腑肌( 胃、大肠、 小肠) 表达量次之，其他组织中表达量较低；同时，也对同一组织中4 个基因的表达情况进 行了比较。 关键词：猪；肌细胞增强子2 ；基因克隆；基因表达；实时定量p c r 东北农业大学农学硕士学位论文 m 1；l i i i ；m _ ；n i 。im m m ；m l ! 曼曼曼鼍苎曼曼曼! 曼曼蔓! 曼曼曼曼曼皇曼曼曼! 曼曼曼曼曼曼曼曼鼍曼曼曼! 曼鼍曼曼寞 s t u d y o n c l o n i n ga n de x p r e s s i o n o fp i gm e f 2 ag e n e a b s t r a c t m e f 2g e n ef a m i l yb e l o n g st ot h ef a m i l yo fm a d s ( m c m l ，a g a m o u s ，d e f i c i e n s ，s e r u m r e s p o n s ef a c t 0 0 一b o xt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s , m e f 2e x i s ti naw i d em n g eo fc a r d i a ca n ds k e l e t a l m u s c l ec e l l s ，i st h ef i r s td i s c o v e r e dd n a b i n d i n ga c t i v i t yf a c t o rw i t ht h em u s c l ep r o p e r t y ，i s 姐 i m p o r t a n tr e g u l a t o r yf a c t o rf o rm u s c l eh i s t o g e n ya n dd e v e l o p m e n t i tc a nc o n t r o lv e r t e b r a t e m u s c l e s p e c i f i cg e n ee x p r e s s i o n ，a n di ti si m p o r t a n tf o rt h ep r o c e s so fm u s c l ef i b e ra n dn e l v o u s s y s t e md e v e l o p m e n t b e c a u s eo ft h em e f 2p l a y sa l le s s e n t i a lr o l e si nr e g u l a t i n gc e hm u l t i p l i c a t i o n a n dt i s s u ed i f f e r e n t i a t i o n ，t of u r t h e rr e v e a lt h ef u n c t i o na n dm e c h a n i s mo fm e f 2 c o n t r i b u t et o b e t t e ru n d e r s t a n d i n gt h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n tm o d eo fm u s c l et i s s u e i nt h i ss t u d y , c l o n i n g t h em e f 2 aa n da n a l y s i si t ss t r u c t u r eb yc o m p a r a t i v eg e n o m i c sa n db i o i n f o r m a t i c sm e t h o d s ， p h y l o g e n e s i so fm e f 2 aa l s ob ea n a l y z e db yd r a w i n gp h y l o g e n t i ct r e e ；e x p r e s s i o no fm e f 2 ag e n e a n dm e f 2g e n ef a m i l yi nd i f f e r e n tt i s s u e sa n dd i f e r e n tp e r i o do nl a r g ew h i t ep i g sw e r ea n a l y z e db y r e a lt i m ep c r ；1 n h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 m e f 2 ag e n eo fp i gw a sc l o n e d ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r ：e f 5 7 6 9 2 3 ) n ec o d i n g r e g i o no fp i gm e f 2 ag e n ei sc o m p o s e do f1 5 2 4 b pe n c o d i n g5 0 8a 八a n dm o l e c u l a rw e i g h ti s 5 0 8 4 4 9 8d a t h e r ei sam a d s - b o xd o m a i ni nt h ev i c i n i t yo f1 0 2 4 3 2 t h e r ef r e dam a d s b o xd o m a i nb yc o m p a r i s o no fh o m o l o g yi nt h ep i gm e f 2g e n ef a m i l y t h ec o m p a r i s o no fh o m o l o g yo nm - a d s b o xd o m a i ni nf o u rg e n e ss h o wt h a t ：t h eh o m o l o g yo f m e f 2 ba n dm e f 2 di s1 0 0 ；i e f 2 ah a sl a r g ed i f f e r e n t i a t i o nl e v e l ，t h eh o m o l o g yw i t hm e f 2 b a n d 匝f 2 d i s 8 9 3 b a s e do nt h ee d n as e q u e n c eo fp i gm e f 2 ag e n e ，p h y l o g e n e s i so fn i n es p e c i e sm e f 2 ab e a n a l y z e db yd r a w i n gp h y l o g e n t i ct r e ew i t hn e i g h b o r - j o i n i n gm e t h o d 4 e x p r e s s i o no fm e f 2 ag e n ei n1 0t i s s u e s ( h e a r t ，l i v e r ，s t o m a c h ，s p l e e n ，k i d n e y ，l u n g ， l a r g ei n t e s t i n e ，s m a l li n t e s t i n e ，d o r s a lm u s c l e ，l o w e rl i m bm u s c l e ) o n9 0 ，1 8 0 ，2 7 0 一d a y o l d l a r g ew h i t ep i g sw e r ea n a l y z e db yr e a lt i m ep c r t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ee x p r e s s i o no fm e f 2 a g e n ei nm u s c l et i s s u ei sh i g ha n ds t a b l e ，a n do t h e ro r g a n i z a t i o n si sr e l a t i v e l yl o w , l i v e r i sl o w e s t 5 e x p r e s s i o no fm e f 2g e n ef a m i l yi n1 0t i s s u e so n9 0 d a y - o l dl a r g e w h i t ep i g sw e r e a n a l y z e db yt h es a m et o o t h e d n er e s u l t ss h o w e dt h a te x p r e s s i o no ff o u rg e n e sw i t hc o m m o n f e a t u r e s ：t h e r ei sh i 【g he x p r e s s i o ni nm u s c l et i s s u e ，e g ：d o r s a lm u s c l e ，l o w e rl i m bm u s c l ea n d h e a r tm u s c l e ；t h es e c o n di sv i s c e r a lm u s c l e ，e g ：s t o m a c h ，l a r g ei n t e s t i n ea n ds m a l li n t e s t i n e ；l o w e x p r e s s i o ni nl i v e r ，k i d n e ya n dl u n g 。a ts a m et i m e ，c o m p a r e dt h ee x p r e s s i o no fm e f 2g e n e n a b s t r a c t 寰曼曼鼍蔓m ,i 鼍曼曼曼鼍鼍曼曼皇曼曼曼鼍舅曼曼! 曼曼量曼量曼皇曼曼! ! 鼍邑曼曼曼曼曼曼鼍曼曼曼曼曼曼曼 f a m i l yi ns a m et i s s u e k e yw o r d s ：p i g ；m e f 2 ；c l o n i n g ；g e n ee x p r e s s i o n ；r e a lt i m ep c r c a n d i d a t e ：y a n gl o n g s p e c i a l t y ：a n i m a lg e n e t i c sb r e e d i n ga n dr e p r o d u c t i o n s u p e r v i s o r ：p r o ll i ud i i i i 研究生学位论文独创声明和使用授权书 一； 一一i | i ! i i 曼曼皇曼曼曼葛 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ! 注；如遗直墓丝壶要挂型直明数：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位做作者躲秒 日期抄罗年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位做作者签名：初缸 导师签 日期如罗年加加 日期：泗劳民f 船 前言 1 前言 猪作为肉用家畜，目前衡量其生产性能好坏的主要指标就是瘦肉率、生长速度和肉质。 从解剖学角度上讲这三项指标都与单位面积的肌纤维数和肌纤维直径有关。单位面积上的肌 纤维数越多、肌纤维直径越大猪的产肉量就越高：但肌纤维直径的增加会影响肉质，肌纤维 直径小的肌肉，其系水力强，肌肉嫩度好。所以肌纤维的发育状况与动物的生产性能有最直 接的关系。 近年来，在脊椎动物与无脊椎动物组织特异性基因调控途径的研究上，骨骼肌的发生与 发育己被作为一个模式系统，成为研究的热点。陆续有多种在骨骼肌的发生与发育过程中起 关键作用的调节因子被发现，本试验所涉及的肌细胞增强子( m e f 2 ) 即是其中的一种。 1 1 骨骼肌发生和发育过程中的调控因子 由于近年来组织化学技术、d n a 重组技术、基因敲除( k n o c k o u t ) 技术以及转基因技术 的应用，对胚胎肌肉生成的分子调控机制的研究取得了长足的进展，鉴定出了多种调节肌肉 特异性转录的基因。 1 ) 生肌调节因子家族( m y o g e n i cr e g u l a t o r yf a c t o r s ，m r f s ) m r f s 具有一个共同的保守中央蛋白单元，大小为8 0 个氨基酸，称为碱性螺旋环螺旋 ( b h l h ) 。这个单元对m r f s 功能的发挥有决定性作用。 2 ) 肌细胞增强子2 家族( m e f 2 m a d sd o m a mt r a n s c r i p t i o ne n h a n c e rf a c t o r2 ) 或称为 肌细胞特异性增强子结合因子2 家族( m y o c y t e s p e c i f i ce n h a n c e rb m d m gf a c t o r ) m e f 2 属于m a d s ( m c m 1 ，a g a m o u s ，d e f i c i e n sa n ds e r u mr e s p o n s ef a c t o r ) 超家族，脊椎动 物的m e f 2 由m e f 2 a ，m e f 2 b ，m e f 2 c 和m e f 2 d 等4 个成员组成。它们具有m a d s 超家 族所共有的由5 6 个氨基酸组成的单元，称作m a d s b o x ，其功能是使蛋白质之间形成二聚体 以及识别靶d n a 并与之结合。除此之外，m e f 2 还包含一个由2 9 个氨基酸组成的结构域， 其作用是识别靶d n a 上的序列一c t a a t 4 t a g a 一并与之结合。m e f 2 形成同源二聚体或 异源二聚体，通过m e f 2 结构域与靶d n a 的调控区结合，转录激活肌肉特异性基因的表达， 如m 肌酸激酶，m h c ( 肌球蛋白重链) ，d e s m i n 及某些m r f s 等。与m r f s 不同的是，m e f 2 不仅在骨骼肌中表达，也在心肌、内脏平滑肌以及脑和神经峭中表达。 3 ) 转化因子鼻超家族( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - f l ，t g f - f 1 ) t g f - f l 家族中研究得最多的是肌肉生长抑制素( m y o s t a t i n ，m s t n ) 基因。m s t n 基因在小 鼠和牛方面也称为骨骼肌生长分化因子8 ( g r o w t hd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r 8 ，g d f 8 ) 基因，该基因 在胚胎发育和成年个体中都会表达。现有研究已表明该基因的作用主要表现为抑制肌形成， 并发现在牛中的“双肌”表型就是该基因的突变造成的。 4 ) p a x 3 蛋白 东北农业大学农学硕十学位论文 p a x ( p a i r e db o xg o n e ) 基因编码由4 7 9 个氨基酸组成的蛋白质，它包括两个保守的d n a 结 合单元：一个是由1 2 8 个氨基酸组成的氨末端配对的结构域，另一个是由6 0 个氨基酸组成的 配对的同源域。p a x 3 蛋白参与了四肢前生肌节细胞的增殖、特化与迁移。 5 ) u m 蛋白 l i m 蛋白是一个富含c y s 的单元，是发育上重要的转录因子。肌肉u m 蛋白( 用m l p 表示) 由两个相邻的结构域组成，随后是一个g l y 丰富的区域。在骨骼肌和心肌基因的表达 中m l p 起着主要的调控作用，它可能对细胞周期进行直接的负调控，允许m r f s 引导细胞 脱离细胞周期，从而诱导终端分化。 1 2 骨骼肌发育正调控因子一肌细胞增强因子2 ( m e f 2 ) 1 2 1m e f 2 的概念与结构 肌细胞增强子2 ( m e f 2 ，m a d sd o m a i nt r a n s c r i p t i o ne n h a n c e rf a c t o r2 ) 是一种最早发现 于发育中骨髂肌管核的蛋白质，具有d n a 的结合活性，最早发现可与肌肉肌酸激酶 ( m u s c l e c r e a t i n ek i n a s e ，m c k ) 基因启动子中丰富的岍d n a 序列结合。m e f 2 属于转录 调节因子m a d s b o x 家族，在脊椎动物中编码基因有4 种类型：m e f 2 a ，m e f 2 b ，m e f 2 c 和 m e f 2 d 。 m e f 2 在不同物种中具有共同的结构特点：n 端几乎相同，都含有一个m a d s b o x ，并 且与m a d s 。b o x 直接相邻一个m e f 2 结构域。而m e f 2 的结构差异性则体现在其c 端转录 活性区上( 如图1 1 ) 。m e f 2 的m a d s b o x 是一个含有5 7 个氨基酸的d n a 结合区域，具有高 度的保守性，与其它m a d s b o x 家族转录因子一样，拥有一些不变的残基，而这些保守的残 基对d n a 的序列识别十分重要。其主要作用是能与c t a a t 4 t a g a d n a 序列结合并介导 m a d s b o x 蛋白质的二聚化。m e f 2 结构域是m e f 2 因子所特有的，由m a d s b o x 临近的2 9 个氨基酸组成。其主要功能是有助于提高d n a 结合的亲和力和蛋白质的二聚化，同时也为 m e f 2 与其它辅助因子间相互作用提供了场所。舰的c 端是一个转录活性区。 2 前言 m 叠f 2 a k 曰2 b 翻e f 2 c 抽r 图1 - 1 脊椎动物的四个舰基因调控因子结构示意图 f i g 1 1s c h e m a t i cd i a g r a m so fm e f 2f a c t o r ss t r u c t u r e so ft h ef o u rv e r t e b r a t em e f 2g e n ep r o d u c t s a r es h o w n m e f 2 与其它含有m a d s b o x 的蛋白质一样，必须要与各种转录的辅因子一起作用，才 能调控下游特定靶基因的表达。由于该转录活性区域具有多种选择性剪接方式，因此很少含 有同源的氨基酸，从而形成了不同类型的m e f 2 基因产物。故m e f 2 因子不但可发生同源二 聚化还可发生多种异源二聚化。其它的m a d s b o x 家族成员则不具备这种特性，表明除m e f 2 家族以外，其它转录因子m a d s b o x 内没有形成二聚化的特定氨基酸残基。m e f 2 因子的 m a d s b o x 具有高度的保守性。检测来自于不同脊椎动物的m e f 2 基因产物，除了c 端区域 有差异外，5 0 的氨基酸是相同的，9 5 拥有同样高保守的m a d s b o x 和m e f 2 区域。与脊 椎动物相比较，非脊椎动物的m e f 2 因子也拥有同样的m a d s b o x 和m e f 2 区域。而且在果 蝇的m e f 2 基因保守区域内，也含有与脊椎动物相同的m e f 2 基因内含子和外显子，它们都 是来源于共同的m e f 2 祖先基因。但是，m e f 2 与其它s b o x 家族成员间却很少保持同 源。在m e f 2 的c 端保守区域内含有潜在的磷酸化位点( 例如p 3 8 ，e r k s 等) ，但不是所有的 磷酸化位点都能够被显露出来，其中一些与转录活性区s ) 重叠。在不同类型m e f 2 的c 端区域中，除了保守区域和一小段酸性外显子外，很少含有相同的氨基酸。 m e f 2 作为一种重要的转录调节冈子，其特定的结构还可使其与其它转录因子相互作用， 这对在多种系统中促进肌肉的分化起着重要的作用。 3 东北农业大学农学硕上学位论文 1 2 2m e f 2 的生理功能 由于m e f 2 蛋白是由选择性的拼接作用而成，所以有多种结构不同亚型。m e f 2 广泛地 存在于肌肉组织，神经组织等处。结构的多样性决定了m e f 2 功能的多样性。现在己知的功 能主要有以下几大方面： 1 ) m e f 2 在肌纤维发育中的调：霄作用 m e f 2 广泛的存在于骨骼肌与心肌细胞中，最早发现具有肌肉特性的d n a 结合活性的因 子，可与大多数肌肉特定基因的启动子或增强子直接结合。m e f 2 的d n a 结合活性在骨骼肌、 心肌和平滑肌都高度表达。 m e f 2 与生肌调节因子家族( m r f s ) 成员之间相互作用，可激活骨骼肌特异性基因的表达。 生化和基因的研究证据己表明，m e f 2 是m r f s 的协同调节因子它能够识别m r f s 碱性螺旋 环螺旋结构( b h u ) 中的碱基区域。主要通过m e f 2 的m a d s - b o x 区域和肌肉b h l h 蛋白质 上的3 个肌形成氨基酸间的相互作用来完成。因此，骨骼肌的生成是由两个不同的却能相互 诱导、相互作用的肌肉转录因子家族介导的。m e f 2 不能单独激活肌肉基因的表达，它们只 是直接通过与肌肉转录因子的d n a 结合区域间相互作用，来增强m r f s 蛋白质的转录活性。 已有实验证实，在肌肉发育中，m e f 2 和b h l h m r f 家族共同对促黑素释放因子4 ( m e l a n o t r o p i n r e l e a s i n gf a c t o r ，m r f 4 ) 启动子进行调节。m r f 4 ( m r f s 成员) 的启动子中含有丰 富的肌肉特定表达信息，但其充分表达需要含有m e f 2 的结合位点，当m e f 2 位点突变时可 严重损害m r f 4 启动子产生特定性的肌反应。另有实验表明，在肌强直性的肌肉中，与 m a p k p 3 8 通路相关的m e f 2 的转录活性有明显增强，但m e f 2 与d n a 结合的亲和力并没 有改变。近来发现在发育的肌节中，m e f 2 家族中最早被表达的是m e f 2 c ，随后依次是 m e f 2 b 、a 、d 。 在人类心脏的整个发育阶段，四种m e f 2 转录物m e f 2 a ，m e f 2 b ，m e f 2 c ，m e f 2 d 的表达均能检测到，只是m e f 2 b 转录物在大鼠心脏发育过程中是下调的。m e f 2 基因的选 择性剪接和转录的调节，尤其是m e f 2 d ，在人类心脏的发育过程中具有重要作用。m e f 2 因 子在心脏的前体、发育的心脏和平滑肌细胞中都有表达。近来实验表明，m e f 2 a 具有一种 特定的转录活性，能够维持出生后心脏中细胞构造的完整和保持适当的线粒体容量，而其它 类型的m e f 2 因子没有这种转录活性。 m e f 2 在骨骼肌和心肌中有高度的表达，并且是激活可收缩蛋白和其它肌肉特定基因表 达的重要转录因子。虽然m e f 2 在平滑肌细胞中也有高度表达，但经实验发现平滑肌细胞中 的m e f 2 不与可收缩蛋白基因一同下调，因此认为可能与肌肉收缩无关。另外，m e f 2 a ， m e f 2 b ，m e f 2 d 的m r n a 在心内膜的平滑肌细胞中被上调，在最接近内腔的细胞层表达水 平最高，而m e f 2 c 的表达水平没有明显的增加，这表明m e f 2 转录因子可能与活化的平滑 肌表型有关。 2 ) m e f 2 在神经系统发育中的作用 m e f 2 在神经系统的发育中具也有重要的作用。在中枢神经系统的神经细胞中，所有 m e f 2 家族成员都能高度表达，其中以m e f 2 c 最为明显。m e f 2 在有丝分裂后的神经细胞中， 4 前言 是作为一种钙依赖性的调节因子，可以选择性的表达，并且成为这些神经细胞存活所需的关 键因子。当钙流入小脑颗粒神经细胞后，使m a p k p 3 8 通路磷酸化，激活m e f 2 转录因子。 从而刺激m e f 2 依赖性基因进行转录，调节神经细胞的存活。这表明m e f 2 依赖性的转录是 小脑颗粒神经细胞存活所必须的。 3 ) m e f 2 在肝星状细胞中的作用 肝星状细胞( h e p a t i cs t e l l a t ec e l l ，h s q 是肝纤维化发生发展过程中起关键作用的细胞。其 兼具平滑肌细胞和神经细胞的某些特征，在钙离子内流下可以收缩，活化后成为肌成纤维样 细胞。据此，对m e f 2 的研究开始把注意力转向研究h s c 内m e f 2 的表达和功能。据报道 在正常的成年小鼠肝脏中检测不到m e f 2 的表达，而近来有实验表明，从大鼠肝脏中分离出 星状细胞，在体外培养的过程中星状细胞逐步活化，分别收集新分离和活化的星状细胞，用 r t - p c r 方法检测m e f 2m r n a 水平，用w e s t e r n 印迹检测m e f 2 蛋白水平，发现m e f 2 a 和 m e f 2 d 的m r n a 和蛋白均随着细胞的活化而逐步升高。又用l u c i f e r a s e 报告基因法和e m s a 方法测定m e f 2 的活性，发现在活化细胞中m e f 2 的d n a 结合功能和转录激活功能均有升 高。另将活化的星状细胞株h s c 2 t 6 培养在基底膜样基质( m a t r i g e l ) ，使t 6 转变成静止的 星状细胞，在t 6 静止过程中，m e f 2 的蛋白表达和活性均下降。将表达m e f 2 的质粒转染到 星状细胞中。m e f 2 可显著促进a s m a 的表达，而如果用m e f 2r n a i ( s m a l li n t e r f e r e n c er n a ) 阻断内源性m e f 2 的表达，a s m a 的量与之相比显著下降。用表达m e f 2 的重组腺病毒感染 星状细胞，测定细胞增殖和细胞周期的分布。结果表明，垭f 2 可促进细胞增殖，促进细胞 从g 0 gi 期进入s 或g 朋订期。 1 2 3m e f 2 家族基因的定位与多态性研究 目前已有多个物种的m e f 2c d n a 被分离并测序。研究发现同一物种的m e f 2c d n a 序 列并不单一，在不同组织细胞中有一定的差异，也就是说最终发挥生理作用的m e f 2 蛋白并 不是单纯由某一个垭f 2 基因编码的，而是经过m r n a 的选择性拼接作用而成。m a r t i n 等 ( 1 9 9 4 ) 首先用人鼠细胞杂交克隆板的方法将小鼠的m e f 2 a , m e f 2 c 和m e f 2 d 基因定位于第 7 号、1 3 号和3 号染色体。g r a c e 等( 1 9 9 5 ) 利用相似的方法将人的m e f 2 a , m e f 2 b , m e f 2 c 和 m e f 2 d 基因定位于1 5 q 2 6 、1 9 p 1 2 、5 q 1 4 、和l q l 2 , , - q 2 3 ，并将人鼠的m e f 2 d 基因定位结果对 比，推断m a r t i n 等未报道的鼠m e f 2 b 基因位于第八号染色体上。 在猪方面，w a g e n k n e c h t 等( 2 0 0 3 ) 根据人m e f 2 d 和部分猪的该基因片断序列设计引物， p c r 扩增了猪m e f 2 d 基因的第四、五外显子和第四内含子，并在第四内含子内发现一处c t 的突变。同时他们将该基因定位于4 q ，在该区域已定位了多个与胭体性状和生长速度有关的 0 t l 。 1 2 4m e f 2 家族基因表达和激活的调节 尽管m e f 2 对于肌肉基因的激活的重要性是毋庸置疑的，但是m e f 2 蛋白在不同细胞类 5 东北农业大学农学硕十学位论文 皇鼍曼曼曼曼曼! 曼! ! 曼! ! 曼! ! 曼! 曼曼曼曼曼曼曼曼! ! 曼曼! 曼! 曼! 曼! ! ! ! ! 曼! 曼曼曼! 曼! ! 曼! ! 曼nn j m ! a 曼璺 型中的分布也引起了很大的争论。大多数研究描述了i v 匝f 2 的d n a 结合活性高度富集在肌 肉细胞，然而其他研究也说它无处不在，并不是只在肌肉细胞中表达。对于这一不同结果的 争论上不清楚，但是由于m e f 2 受多水平的调节，且由于不同的细胞培养方法和测定条件， 得到m e f 2 表达的不同结果也是正常的。的确，这里有确切的证据表明m e f 2 的表达受到转 录、翻译和逆转录的调控，这种多种调节机制为这个家族因子在细胞分化和生长中的功能提 供了多个检测点。 1 不同细胞类型中m e f 2 蛋白和m r n a 的分布 m e f 2 表达调节的最初是在胚胎发生中出现的m r n a 水平的积累。在脊椎动物和果蝇中 m e f 2 的转录物在胚胎发生中的生长的肌肉细胞系中高度富集。在鼠和小鸡中，m e f 2 c 是 m e f 2 基因中最早被表达的，它的转录物先出现在中胚层的前期，引起心脏的发生( e d m o n d s o n e ta l1 9 9 4 ) 。这不久，其它m e f 2 基因的转录产物在生长的心肌膜中表达。在生长中的骨骼肌 和平滑肌的细胞系中发现的m e f 2 基因伴随着他们不同的激活方式，这种高水平的转录产生 了高水平的m e f 2 蛋白，这些蛋白在哺乳动物胚胎发生中的肌肉细胞系中能够清楚地被发现 ( s u b r a m a n i a n & n a d a l g i n a r d1 9 9 6 ) 。在非洲蟾蜍属胚胎中，母体中产生的未受精的卵中m e f 2 转录产物表达水平较 氐( c h a m b e r se ta l1 9 9 2 ) 。紧接着是原肠胚形成，m e f 2 转录产物和结合 活性水平持续增加，直到会游泳的蝌蚪期，这些转录产物产生在体壁中胚层和m y o t o m a l 的 肌细胞q h ( c h a m b e r sc ta l1 9 9 2 ) 。相似的，果蝇的单一的m e f 2 基因在未分化的中胚层和紧接 着的原肠胚中表达，随后的胚胎发生和幼虫中仅在骨骼肌、心肌和内脏细胞系中表达( l i l l y e t a l1 9 9 4 ，n g u y e ne ta l1 9 9 4 ，t a y l o re ta l1 9 9 5 ) 。 在培养的骨骼肌细胞中，已经报到了m e f 2 d 在起始分化的多层肌肉母细胞中表达 ( b r e i t b a r t e t a l1 9 9 3 ) 。m e f 2 a 蛋白出现在进入不同分化途径的细胞中，m e f 2 c 表达较晚，出 现在分化途径中。m e f 2 表达的不同时间模式的意义尚不明确。 m e f 2 家组成员除了在肌肉细胞中表达之外，在中枢神经系统中也有很高水平的表达。 在脊椎动物中，每一个m e f 2 基因在大脑的不同区域都有独一无二的表达形式( l e i f e re t a l 1 9 9 3 ，l y o n se t a l1 9 9 5 ，i k e s h i m ae t a l1 9 9 5 ，xl i ne ta l1 9 9 6 ) 。在小脑、大脑皮层和海马的表达 量特别突出。m e f 2 在神经细胞中表达的时间符合m e f 2 因子在神经分化中所起的作用，但 是迄今为止尚没有神经靶基因被识别。在果蝇中，d m e f 2 在神经元的蘑菇体中也高表达， 这个蘑菇体是学习和视觉神经元的中心的功能( s c h u l ze ta l1 9 9 6 ) 。缺乏m e f 2 的果蝇胚胎死 于肌肉缺陷早于神经系统的发生( l i l l ye ta l1 9 9 5 ，b o u re ta l1 9 9 5 ，r a n g a n a y a k u l ue ta l1 9 9 5 ) 。 m e f 2 在神经发育和其他组织的功能尚没有确定。 2 转录控制 如上述讨论，m e f 2 表达的调控最早发生在胚胎发育中m r n a 积累的过程。脊椎动物 m e f 2 基因包含长的5 非编码区、多种选择性剪切的外显子和大量的内含子。由于它的复杂 性，尚没有一个脊椎动物的m e f 2 基因的顺式作用调控序列被描述。然而，在果蝇中定义控 制m e f 2 转录的调控元件取得了进步。d m e f 2 基因的上游1 2k b 包含至少十二个独立的增 6 前言 强子，他们中的每一个都能够在发育中支配一个转录的时空表达形式。d m e f 2 完整的表达 需要这些不同调控元素的整合，这贯穿了整个胚胎和成肌发育过程中。 两个d m e f 2 增强子的特征已经被详细描述。一个是肌肉特化增强子，它可以在心脏前 体细胞和类似心脏组织的胚胎中直接转录( g a j e w s k ie ta l1 9 9 7 ) 。这个增强子有两个形成心肌 同源结构域蛋白t i n m a n 的结合位点，这是果蝇心肌形成所必需的( a z p i a z u & f r a s c h1 9 9 3 ， b o d m e r1 9 9 3 ) 。目前为止d m e f 2 是t i n m a n 识别的唯一一个体内靶基1 园( g a j e w s k i e t a l1 9 9 7 ) 。 这些结合位点的突变消除了增强子的活性，t i n m a n 在热休克启动子的控制下异位表达，使这 些增强子在中胚层外被激活( g a j e w s k ie ta l1 9 9 7 ) 。这些结果表明t i n m a n 在心脏形成中的 部分功能是激活d m e f 2 。这很令人感兴趣去推测t i n m a n 和其同系物n h c 2 5 在心肌分化过程 中起到相似的作用。n k x 2 5 在脊椎动物心脏发育过程中比m e f 2 表达早( l i n t se t a l1 9 9 3 ， h a r v e y1 9 9 6 ) 。这可以勉强的确定n k x 2 5 也类似于t i n m a n 具有激活m e f 2 基因表达的功能。 d m e f 2 在胚胎和成年骨骼肌前体中的表达依靠另外一个增强子，位于基因上游大约2 k b ( c r i p p se ta l1 9 9 8 ) 。这个增强子受碱性螺旋环螺旋( b h l h ) 控制的t w i s t ，这对果蝇中胚层 特化和肌形成是必需的( b a y l i e s & b a t e1 9 9 6 ) 。t w i s t 通过直接结合一个e b o x ( c a n n t g ) 来激活这个d m e f 2 增强子，这在r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 黑腹果蝇a n dd v i r i l i s 是保守的。 在t w i s t 不存在的胚胎中，中胚层不能形成，d m e f 2 也不表达( l i l l ye ta l1 9 9 4 ，n g u y e ne ta l 1 9 9 4 ，t a y l o r e t a l1 9 9 5 ) 。通过对t w i s t 利用温度敏感突变，说明t w i s t 对于成年骨骼肌前体 细胞中d m e f 2 增强子的激活是必需的；这个增强子在中胚层早期也被激活，这表明它在发 育的很多时期都调节d m e f 2 的转录。如果在接着的原肠期关闭t w i s t ，骨骼肌就不会正确的 形成( b a y l i e s b a t e1 9 9 6 ) 。同样，缺乏d m e f 2 一种相似的表型会出现在躯体肌肉组织中 ( r a n g a n a y a k u l ue t a l1 9 9 5 ) 。在缺乏t w i s t 时导致骨骼肌不能正常的形成和分化，可能是由 于这个增强子不能够激活d m e f 2 直接造成的( c r i p p s e ta l1 9 9 8 ) 。因为t w i s t 也在细胞中 表达，但是没有活性，t w i s t 必须与其他的调节因子共同作用。t w i s t 在胚胎发生中是否调节 m e f 2 基因的表达尚未确定。 3 翻译调控 在成年组织，m e f 2 c 的转录产物仅在骨骼肌、脑和脾中表达，然而其他m e f 2 因子的 转录产物在各组织中都表达( p o l l o c k & t r e i s m a n1 9 9 1 ，c h a m b e r se ta l1 9 9 2 ，y ue ta l1 9 9 2 ， m a r t i ne ta l1 9 9 3 ，m c d e r m o t te ta l1 9 9 3 ，b l a c ke ta l1 9 9 7 ) 。尽管m e f 2 a ，m e f 2 b ，m e f 2 d ，的 转录产物广泛的表达，有报道指出其相应的蛋白大多只在肌肉和神经细胞中表达( y u 甜口f 1 9 9 2 ，l e i f e re ta l1 9 9 3 ，l e i f e re ta l1 9 9 4 ) 。 在血管平滑肌细胞已经对肛f 2 蛋白水平和m r n a 水平进行了研究，当有血清刺激时m e f 2 a 蛋白的表达水平显著增加，但是相应的m r n a 水平并没有变化( s u z u k ie ta l1 9 9 5 ) 。在骨骼 肌细胞中已经表明，m e f 2 a 转录产物的3 u t r 非编码区序列对翻译调控其重要作用( b l a c k 甜a l1 9 9 7 ) 。m e f 2 的m r n a 的一个进化保守的3 u t r 非编码区序列在非肌肉细胞中能抑 制转录，然而这种抑制可以在肌肉分化时被解除( b l a c ke ta l1 9 9 7 ) 。研究中检测到的抑制 水平和血管平滑肌细胞中血清刺激后m e f 2 蛋白水平的变化相似，这表明3 u t r 非编码区序 7 东北农业大学农学硕 ：学位论文 _ _ i i ii,： i i 列组成对m e f 2 a 的翻译调控有很大作用( s u z u k ie ta l1 9 9 5 ，b l a c ke ta l1 9 9 7 ) 。 尽管研究表明转录调控机制在调解m e f 2 基因表达中起到重要作用，也有研究表明其转 录产物m e f 2 蛋白在胚胎发育中任何组织都表达( d o d o ue ta l1 9 9 5 ，o m a t s k y m c d e r m o t t 1 9 9 6 ) 。最