（动物遗传育种与繁殖专业论文）影响小鼠核移植胚发育因素的研究.pdf

影响小鼠核移植胚发育因素的研究 摘要 细胞核移植的成功率受诸多因素的影响。除维持重构卵核的正确倍性及其重 新程序化的影响外，卵母细胞的处理方法、显微操作技术、不同的胞质受体与不 同的供体细胞及其状态对重构胚的发育有着重要的影响。本实验采用m i i 期卵母 细胞作为受体和颗粒细胞作为供体，对小鼠核移植技术中影响重组胚的相关因素 进行了研究，其结果如下。 l 、用透明质酸酶处理卵丘卵母细胞复合体时，其浓度和处理时间均对重组 胚的发育产生影响。当透明质酸酶浓度为1 5 0pg m l 并用移卵管反复吹打2 m i n 时，可获得较好的重组胚发育率( 8 0 8 ) 。 2 、本实验比较了电激活不同参数及卵龄对卵母细胞激活的影响。 相同脉冲强度、脉冲宽度、脉冲次数下，卵龄为1 7 h 的卵母细胞获得较高的 激活率( 7 1 7 ) 和发育率( 8 4 8 3 9 4 ) 。 在相同卵龄、脉冲脉宽、脉冲次数下，脉冲强度为1 0 0v m 时卵母细胞的 激活率为最高( 7 2 7 9 6 ) ，2 - 细胞、囊胚发育率也达到峰值( 8 5 o 3 5 o ) ，为适 宜卵母细胞激活脉冲强度。 在相同卵龄、脉冲强度、脉冲次数下，当脉冲宽度为8 0us 时卵母细胞的激 活率达到了最高( 7 6 7 ) ，2 - 细胞、囊胚发育率也达到峰值( 8 0 4 3 4 8 ) ，为 适宜的卵母细胞激活脉宽度数。 在相同卵龄、脉冲强度、脉冲宽度下，3 次脉冲的激活率高于2 次，但激活 后的2 一细胞、囊胚发育率2 次脉冲( 7 0 3 2 9 7 ) 高于3 次。因此2 次为适 宜卵母细胞激活脉冲次数。 与电激活( 7 4 5 ) 相比s r c l 2 激活法可以获得较高的激活率( 7 8 o ) ，但 激活后的2 一细胞、囊胚发育率低于电激活法( 6 7 6 2 1 6 ) ，仅为( 5 2 8 0 8 3 ) 。 3 、在核移植的3 种不同类型核质组合中。类型i 和类型i i 的重组胚继续培 养出现了桑椹胚和囊胚的发育。第二种类型组合比第一种类型组合的胚胎发育率 低。类型i i i 的2 一细胞发育率较低和前两种类型相比具有显著的差异( a ：b o 0 1 a ：c o 0 1 ) ，并且没有出现桑囊发育。 关键词：小鼠；颗粒细胞；核移植；激活 s t u d y o fl n f l u e n c ef a c t o ro nn u c l e a r t r a n s f e r e m b r y o sd e v e l o p m e n t o fm i c e a b s t r a c t a g r e a td e a lo f f a c t o r sh a sm u l t i p l ee f f e c t so nt h es u c c e s sr a t eo fc e l ln u c l e a r t r a n s f e r b e s i d e st h ee f f e c to fm a i n t a i n i n gp l o i d yo fr e c o n s t r u c t e do v u mc o r ea n d r e p r o g r a m m i n gt h e d o n o rn u c l e i ，t r e a t m e n tm e t h o do fo o c y t e 、m i c r o o p e r a t i n g t e c h n o l o g y 、d i f f e r e n tc y t o p l a s tr e c i p i e n ta n dd i f f e r e n td o n o r n u c l e ia n di t ss t a t eh a v e i m p o r t a n ti n f l u e n c eo n c o n s t r u c td e v e l o p m e n to f e m b r y ot h er e c i p i e n ti so o c y t e si n m e t a p h a s e - i i ，d o n o r n u c l e ii st h eg r a n u l ec e l li nt h i se x p e r i m e n ti n f l u e n c ef a c t o r so n r e c o n s t r u c t e de m b r y oi nn u c l e a rt r a n s f e rt e c h n o l o g yo fm i c ew e r er e s e r c h e d ，t h e r e s u l t sa sf o l l o w s 1 、t h ec u m u l u s e n c l o s e do o c y t ec o m p l e x e st r e a t e dw i t hh y a l u r o n i d a s e ，t h e c o n c e n t r a t i o na n dt r e a t e dt i m eb o t hi n f l u e n c et h ed e v e l o p m e n to f r e c o n s t r u c te m b r y o 、斫t hm o v eo v u mt u b eb l o w i n ga n db e a t i n gf o r2 m i nr e p e a t e d l y c a l lo b t a i nb e t t e r r e c o n s t r u c te m b r y od e v e l o p m e n t r a t e ( 8 0 8 、 2 、t h i s e x p e r i m e n tc o m p a r e d i f f e r e n tp a r a m e t e ro f e l e c t r i c i t ya c t i v a t ea n da g e i n f l u e n c eo nt h eo o c y t ea c t i v a t e o o c y t e st r e a t e d w i t hs a m ep u l s e s t r e n g t h ，p u l s ed u r a t i o n , p u l s et i m e s ，t h e o o c y t e sa t 1 7 hc a ng e th i g ha c t i v a t i n gr a t e ( 7 17 1a n dd e v e l o p m e n tr a t e ( 8 4 8 1 3 94 、 i nt h es a m e a g e ，p u l s ed u r a t i o na n dp u l s et i m e s ，t h eo o c y t ea c t i v a t er a t er e a c h e d t i p t o “7 27 ) w h e n t h ep u l s es t r e n g t ha tt h e1 0 0 v m m ，2 - c e l la n db l a s t u l ad e v e l o p e r a t ea l s or e a c h e dp e a kv a l u e ( 8 5 o 3 5 o ) ，s ot h i sp u l s es t r e n g t hw a ss u i t a b l ef o r o o c y t e sa c t i v a t i o n i nt h es a m ea g e ，p u l s es t r e n g t ha n dp u l s et i m e s p u l s ed u r a t i o na tt h e8 0 9 s ，t h e o o c y t ea c t i v a t er a t er e a c h e df i p t o p ( 7 6 7 ) ，2 - c e l l ，b l a s t u l ad e v e l o p er a t eb o t hr e a c h p e a kv a l u e ( 8 0 4 3 4 8 ) ，s ot h i sp u l s ed u r a t i o n w a ss u i t a b l ef o r o o c y t e s a c t i v a t i o n i nt h es a m e a g e ，p u l s es t r e n g t ha n dp u l s ed u a r t i o n , t h ea c t i v a t er a t eo f 3t i m e s p u l s ei sh i g h e rt h a n2t i m e s p u l s e ，w h i l ei tw a sj u s tr e v e r s eo f 2 - c e l la n db l a s t u l a d e v e l o p er a t e ( 7 0 f 3 2 97 1 s o2t i m e s p u l s e w a ss u i t a b l ef o ro o c y t e sa c t i v a t i o n s r c l 2a c t i v m i o n c a n g e th i g ho o c y t e a c t i v a t e r a t e ( 7 8 ，0 ) c o m p a r e dw i t h e l e c t r o a c t i v a t i o n ( 7 45 ) ，w h i l e2 - c e l la n d b l a s t u l ad e v e l o p er a t e ( 5 28 0 83 0 o ) w a s l e s st h a ne l e c t r o a c t i v a t i o n ( 6 7 6 2 l6 ) 3 、i n3d i f f e r e n tk i n d so fk a r y o p l a s m sc o m b i n a t i o no fn u c l e a rt r a n s f e r m a i n t a i nc u l t i v a t i o no fr e c o n s t r u c t e de m b r y oi & i ic a ng e tm u l b e r r ye m b r y oa n d b l a s t u l at h ee m b r y od e v e l o pr a t eo f1 1w a sl o w e rt h a n i t h e2 - c e l ld e v e l o pr a t e w a sl o w e ra n dd i f f e r e n tf r o mt h eo t h e r ss i g n i f i c a n t l “a ：b 0 0 1a ：c 0 ，0 1 ) , t h e r ew a s n o b l a s t u l a k e yw o r d ：m i c e ；c u m u l u sc e l l ；n u c l e a rt r a n s f e r ；a c t i v a t e 缩略词 英文缩写英文全称中文译文 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签时间：o f 岳多年月p 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签她 时间：必f 年 月p 日 翩始研 2 十 时间：0 蚶年么f t i d e t - 1 l _ _ 一 刖罱 1 本实验研究的目的与意义 随着操作技术的不断完善以及大量研究工作的开展，动物核移植取得了飞快 的发展。由胚胎细胞克隆1 1 到体细胞克隆| 2 】以及异种间克隆吲都获得了成功。 目前尽管核移植方面取得了极大进展，但是通过核移植技术获得的克隆动物的缺 陷也日益突出，如克隆胚胎体外培养发育率低、移植后的流产率、畸胎率和早亡 率高，甚至出现早衰现象。其根本原因是与核移植相关的许多基础理论问题尚不 清楚。 目前核移植的成功率仍然很低，除维持重构卵核的正确倍性及其重新程序化 的影响外，卵母细胞的处理方法、显微操作技术、不同的胞质受体与不同的供体 细胞及其状态均对重构胚的发育有着重要的影响【4 】。为了探讨这些问题，本研究 试图通过不同方法的比较和用不同的供体核与胞质组合来研究影响核移植胚胎 发育的因素，分析供体细胞核和受体细胞质之间相互作用的关系，找到最佳细胞 周期的供体细胞与受体卵胞质的组合，以求获得较高的核移植重组胚的发育率。 2 哺乳动物核移植的研究进展 核移植是将动物早期胚胎细胞或体细胞的细胞核移植到去核的受精卵或成 熟卵母细胞中，重新构建新的胚胎，使重构胚发育为与供核细胞基因型相同后代 的技术过程，又称动物克隆技术。细胞核移植( n u c l e a rt r a n s f e r ) 这一概念是 s p e m a n n ( 1 9 3 8 ) 根据所有的胚胎细胞都具有与受精卵完全相同、且有可能拥有发 育全能性的细胞核论点的基础上提出的【7 】。他设想将胚胎卵裂球核移植到卵母细 胞中，以评估细胞核的分化程度。然而，由于实验条件的限制，直到1 9 5 2 年b r i g g s 和k i n g 才首次获得两栖类美洲豹蛙的胚胎细胞核移植后代，这一结果表明，两 栖类原肠胚细胞核具有极强的可塑性，仍保留着发育的全部基因组【8 】。1 9 6 2 年， g u r d o n 用细胞核移植技术，把蝌蚪的肠上皮细胞注入爪蟾破坏了细胞核的卵母 细胞内，培养出了爪蟾正常个体。这一结果说明，两栖类体细胞核在卵母细胞质 调控下仍可去分化，恢复到全能状态，具有发育的全能性。上述研究的初衷在于 揭示与细胞核有关的细胞核可逆性等发育生物学的理论问题，对哺乳动物无性繁 殖的研究提供了思路，奠定了理论和技术基础。在过去的2 0 年，特别是2 0 世纪 的最后几年中，哺乳动物核移植技术有了飞速的发展。1 9 8 1 年，h o p p e s 克隆小 鼠成功标志首例哺乳动物克隆成功【9 l 。随后，他采用显微去核和病毒介导相继获 得克隆羊、克隆免、克隆猪【”i 。以前的核移植仅局限于原核互换【5 1 或用早期胚胎 的卵裂球【1 】作为供核，到1 9 9 5 年才真正进入了核移植时代。c a m p b e l l 等f 6 悯培 养的分化细胞作为供核，诞生了两只羊羔( m e g a n 和m o r a g ) 1 9 9 7 年，w i l m u t 等 b j 匪道了第一只用成年动物体细胞克隆的动物“多莉”，这一被喻为具有划 时代意义的结果，诱发了生物学界的一场动物克隆风暴，随后不同的科学家采用 与“多莉”类似的方法分别获得牛皮肤成纤维细胞、牛卵丘细胞、牛乳腺上皮细 胞、耳组织类成纤维细胞和输卵管上皮细胞的体细胞核移植后代。另外一些学者 通过与“多莉”不完全相同的方法获得小鼠卵丘细胞、山羊耳组织成纤维细胞等 为核供体的体细胞核移植后代。克隆鼠、牛、山羊、猴、猪等动物纷纷诞生。人 们从这些结果中看到了核移植技术广阔的应用前景，如在家畜改良、拯救濒危动 物、以及人类医疗等方面，都有着不可估量的作用。 2 1 哺乳动物核移植的生物学意义 核移植技术是研究胚胎细胞核发育全能性以及核质关系的重要手段。哺乳动 物体细胞核移植己在羊、牛、猪、免、鼠、大熊猫等多种动物的多种细胞获得成 功，它揭示了细胞质对细胞核的巨大影响作用，增进了对细胞分化、细胞全能性 等发育生物学基本问题的深入认识；细胞具有发育所需全部遗传信息，一旦分化， 只能按既定方向发育，但哺乳动物核移植的成功说明已经高度分化的体细胞核仍 具有发育全能性( t o t i p t e n c y ) ，即能够再程序化( r e p r o g r a m ) ，并指导早期胚胎 细胞发育成新个体。体细胞核移植的成功说明高度分化的细胞也能够在一定条件 下去分化而恢复其全能性，发生基因表达时序再程序化。早在7 0 多年前，s p e m a n n 等就提出核等能性或基因组发育时期连续性的观点1 7 。成年哺乳动物体细胞克隆 后代的产生，证实了上述观点，即哺乳动物细胞分化是一种系统、连续的基因表 达上的改变，这种改变是由于核质间的相互作用造成的，并包含不可逆转的基因 修改。 2 2 胚胎细胞核移植的研究进展 哺乳动物胚胎细胞核移植，是将哺乳动物早期胚胎分离成单个卵裂球，把每 个细胞卵裂球移入预先去核的卵子内，使这些受核卵发育成胚胎，然后移植给受 体，获得后代的生物技术。8 0 年代以来，应用哺乳动物胚胎细胞核移植克隆胚胎 技术己取得了可喜成就，相继获得小鼠、绵羊、牛、兔、山羊和猪的克隆后代。 近来，应用细胞核移植技术克隆动物又取得了突破性进展，相继获得了以培养 6 - 1 3 代的克隆动物i l ”。通过核移植可从单个胚胎得到数个甚至无数个无性繁殖 同质个体。与胚胎分割和体外受精相比，不仅能降低胚胎的生产成本，扩大胚胎 的来源，而且可成批生产具有相同基因型的动物，促进畜群品质改良。 22 1 小白鼠 1 9 8 1 年，h o p p e s 克隆小鼠成功1 9 1 。首次获得了无性生殖小鼠，即克隆小鼠。 湖南湘雅医学院的陆长富自1 9 9 5 年9 月开始，以小鼠胚胎为材料进行核移植实验 2 并干1 9 9 6 年t 2 f 出生了两批共6 只核移植小鼠1 1 2 1 。在实验中，其运用了显微操作 技术与细胞融合技术、先用p h 2 5 的酸性t y r o d e 液将昆明白小鼠的卵母细胞透明 带溶解一个小孔、再用一内径约2 5 p n 的玻璃针将卵母细胞的核接连同部分细胞质 及细胞膜一同吸出、使卵母细胞去核。然后从黑色c 5 7 4 、鼠的2 细胞胚吸取一个单 卵裂球移植到去核卵母细胞的透明带内构建去核卵母细胞一单卵裂球复合体。再 将复合体转移到4 5 的p e g ( 聚乙二醇) 内2 3 分钟后取出、用m 2 培养基洗涤、在 3 7 。c 、5 c 0 2 培养箱内用含2 0 人血清的h a m s7 卜1 0 培养基培养4 个小时后观察、 选择复合体己融合为一个细胞的胚胎。让其在体内发育，直至出生。实验对9 0 4 枚卵母细胞进行了去核处理、去核成功的共3 5 9 枚、从5 3 5 枚2 一细胞胚吸取了3 5 9 个单卵裂球与其构成复合体、复合体经p e g 处理后，4 5 枚发生了融合、符其中的 1 3 1 枚分别移植至i j 2 4 只假孕母鼠输卵管内。移植后有4 只母鼠因麻醉意外死亡。剩 下的2 0 只母鼠共移植了i i 7 枚胚胎。其中2 只分别于1 9 9 6 年1 2 月1 4 日及2 1 日各产下 了3 只小鼠。6 r 小鼠中5 只体毛为黑色。与供核鼠的毛色相同，另1 只为棕色介 于供核鼠与受核鼠的毛色之间。 2 2 2 猪 猪胚胎核移植首先由p r a t h e r 等1 9 8 9 年获得成功，获得7 头原核杂交换后代和 1 头4 一细胞胚卵核移植后代【l ”。之后，各国学者对猪的核移植进行了广泛研究。 在国内，猪的胚胎细胞核移植也取得了成功。猪胚胎核移植目前以早期卵裂球做 供体。次级卵母细胞做受体。胚胎细胞分化的标志之一是母体合子转变( m a t e r h a lt o z y g o t et r a n s i t i o n ，m z t ) ，此时胎儿基因组开始转录r n a ，并控制发育 ，猪胚胎m z t 发生在4 一细胞期。f r e t i a g 等1 1 4 1 通过3 h 一尿嘧啶掺入试验，发现猪4 一 细胞期胚核d n a 开始转录，4 一细胞期到透明带完整的胚胎，以卵裂球计尿嘧啶掺 入的速率差异不显著，为0 2 9 0 3 7 x 1 0 。 m o l 细胞3 h ，孵化囊胚卵裂球尿嘧啶 掺入速率显著增加，为0 8 6 x 1 0 。1 5 m o l 细胞3 h ，也说明透明带完整胚胎核的活 性基本相同。s c h o e n b e c k 等1 1 5 1 研究表明猪胚胎基因组从4 一细胞期的1 6 h 开始控 制发育。p r a t h e r 和r i c k o r d s ! ” 研究发现r n a 的合成与加工始于4 一细胞期的2 4 h ， 当把1 6 - 细胞期胚核移入卵母细胞，就探测不到r n a 的转录，说明卵母细胞质使1 6 一细胞期的核转变为原核状态，卵母细胞质对核的重排不受m z t 的影响。n a g a s h i m a l l 7 1 等研究表明4 7 细胞弄1 1 8 - 1 6 细胞期胚核都能支持重组胚的发育，分别有4 0 5 $ 1 1 4 3 2 重组胚发育到2 8 细胞期，差异不显著，但研究却发现4 一细胞期后的 核作供体重组胚的发育率有所降低。 2 23 绵羊 英国剑桥大学司w i l l a d - s o n l l 8 1 从绵羊8 - $ 1 1 1 6 - 细胞胚胎中取出单个卵裂球， 并放入含有去核或未去核的卵母细胞( 处于m i i 期) 的透明带中，然后用h v j 或电融 合法诱导融合。如此重建的胚胎用琼脂包埋后放入绵羊的结扎输卵管中培养4 5 5 5 天，从裹胚形成的时间和分裂细胞数来分析，这种重建胚与自然受精比较 无显著差异。由8 一细胞胚核移植形成的4 枚囊胚，有3 枚足月产羔，其中有2 羔为 同卵双生。1 6 一细胞核移植胚移植3 头受体后6 0 天屠宰，发现所有受体均各怀一个 胎儿。 2 2 4 牛 w i l l a d s e n 首次报告了牛胚胎多代克隆的研究结果，获得了首例第3 代克隆牛 1 1 9 1 。w e s t h u s i n 等从超排处理母牛用手术法移出输卵管，收集卵母细胞作胞质 受体；以超排母牛发情后第5 和第6 天收集的胚胎、冷冻一解冻胚胎和第l 代核移植 胚作核供体。将供体卵裂球移入去除极体和一半细胞质的卵母细胞的卵周隙中， 进行电融合，再移入绵羊输卵管内培养，6 d 后回收克隆胚进行 评定。结果4 组的融合率和胚胎存活率均无显著差异，表明非手术采集的鲜胚冷 冻一解冻胚和第1 代核移植胚均可作为核供体，生产克隆胚胎【2 0 】，s t i c e 等报道 2 1 1 ，从超排母牛生殖道回收m i i 期卵母细胞，移除极体及其周围胞质作受体，并以 h o e c h s t3 3 3 4 2 检测去核结果。以超排母牛收集的1 6 6 4 细胞期胚胎为核供体。核 移植胚移入绵羊输卵管作体内培养。然后，以克隆胚为核供体进行多代克隆。结 果从l 枚亲本胚胎通过连续4 代克隆，第1 代获1 l 枚克隆胚，第2 代1 6 枚，第3 代2 0 枚，第4 代7 枚，共计获得5 4 枚多代克隆胚胎；将少数克隆胚胎移植至受体母牛， 产生了第1 ( 8 头) 、2 ( 1 头) 和3 ( 1 头) 代克隆牛。为探索供体胚胎和受体卵母细胞 的来源途径，e c t o r s 等( 1 9 9 5 ) 从屠宰场收集卵巢分离卵母细胞，体外培养成熟后 作为受体细胞；以体外成熟、体外受精和体外培养发育至桑堪期胚胎的卵裂球作 供体细胞核，进行重复克隆( r e c l o n i n g ) 研究【2 ”。结果表明，第1 代和第2 代克隆 分别获1 1 枚( 2 0 7 ) 和1 5 枚( 2 0 2 ) 克隆胚；卵裂率分别为8 6 8 和7 8 2 ；桑堪胚 一囊胚发育率分别为( 1 4 5 9 6 ) 和( 1 4 9 ) ，均无显著差异。两代克隆胚与体外受精 胚相比，卵裂率无显著差异，但8 一细胞期以后的发育率则显著较低。体外受精囊 胚的细胞数显著比克隆囊胚者多，两代克隆囊胚的细胞数则无显著差异。将少量 第1 和第2 代克隆胚胎移植至受体母牛，分别产出6 头( 2 1 4 ) 和5 头( 2 0 8 ) 克隆 牛。t a k a n o 等( 1 9 9 7 ) 进行了多代克隆囊胚的冷冻保存研究口”。从超排母牛收集 2 0 - 5 0 细胞期胚胎作亲本供体，以体外成熟卵母细胞为受体。重组胚体外培养3 4 d 发育至8 - 1 6 细胞期的第1 代克隆胚作为供体，进行第2 代、第3 代克隆。第3 代克隆 的每一供体胚平均获得3 0 枚囊胚，显著多于第1 代( 6 2 枚) 和第2 代( 1 9 8 3 k ) 所获 囊胚数。三代克隆囊胚的平均细胞数无显著差异，但显著少于体外受精囊胚的细 胞数。以三代克隆所获的一部分囊胚作冷冻一解冻处理，并与其鲜胚移入受体母 牛作对比，分别产出3 头( 3 1 4 ，2 1 ) $ n 4 头( 4 2 0 ，2 0 ) 克隆牛。 4 22 4 家兔 免胚核移植的成功首先由s t i c e 和r o b l 于1 9 8 8 年报道瞄4 1 。他们以8 1 6 细胞期 胚胎为核供体，去核成熟卵母细胞为核受体，采用显微操作、电融合的方法，获 得了6 只核移植仔免。随后c o l l a s 采用改进的电激活与电融合技术，以1 6 细胞期 胚胎细胞核为核供体，提高了核移植的成功率【2 ”。现已证明，3 2 6 4 细胞期胚 胎细胞核移植后可以指导胚胎发育至产仔【2 6 】；内细胞团细胞核移植后可以指导 移核胚在体外发育至囊胚i ”。在国内，中科院发育所杜森、中国农科院畜牧所黄 少华和江苏农科院王斌等人也成功地获得了免胚核移植的后代。 2 、3 体细胞核移植研究进展 体细胞核移植是指将成年动物细胞核经显微手术和细胞融合的方法移植到 去核的卵母细胞内或将体细胞核直接注入到去核卵母细胞质中，重新组成胚胎并 使之发育乃至产生子代1 2 7 1 。体细胞核移植与胚胎细胞核移植的不同在于，核移 植中供体细胞的来源不同。胚胎细胞核移植的供体细胞一般为发育到一定时期的 胚胎卵裂球。体细胞核移植的供体细胞一般为除胚胎细胞以外的其他细胞的细胞 核，体细胞核移植的成功大大增加了核移植中供体细胞的来源，因此具有广阔的 发展前景。 克隆绵羊d o l l y 的问世，不仅给人们的观念带来了很大的改变，而且由于克 隆技术所蕴藏的商业和社会价值，在全世界引起了轰动。世界许多实验室都把研 究方向转到哺乳动物体细胞克隆上，并己在猪、牛、山羊、绵羊、小鼠、兔和猫 等许多动物上获得成功。其中研究最多最深入的还是牛，目前已用胎儿成纤维细 胞、卵丘细胞、子宫细胞、输卵管细胞、耳细胞、皮肤细胞、骨骼肌细胞、肝细 胞、乳腺细胞及从初乳中获得的乳腺上皮细胞等获得了克隆后代。 猪：2 0 0 0 年，p o l e j a e v a 等口8 1 得到首例体细胞克隆猪之后，o n i s h i 等【2 ”，b e t t h a u s e r 等，相继分别成功地得n t 体细胞克隆猪。2 0 0 3 年，s a n g h w a n 等1 3 1 1 克 隆出了表达强荧光蛋白的转基因猪。j a g d e e c e 等1 3 2 1 克隆出了敲除n 一1 ，3 一半乳糖 苷转移酶基因的克隆猪，从而为人类培育异种器官移植猪跨进了一大步。在国内， 孙兴参等”墩得了猪卵丘细胞克隆囊胚。2 0 0 3 年西北农林科技大学冯秀亮【3 4 】7 导 到了人体细胞和猪卵母细胞异种核移植囊胚。尽管如此，猪的体细胞克隆效率很 低，许多有关环节的机制还不清楚。 牛：在国外，1 9 9 9 年z a k h a r t c h e n k o 、b o o t h p j 获得了体细胞克隆牛。2 0 0 0 年k i s h i 、k a t o 、k u b o t a 、等通过同样方法也取得了牛体细胞核移植的成功1 3 3 ”。在国内，中国农业大学安晓荣，朱士恩等2 0 0 2 年通过卵丘细胞核移植获得了 克隆牛犊【4 。 羊：1 9 9 7 年w i l m u t 等【2 1 获得了第一只体细胞克隆动物“多莉”。为哺乳动 物细胞克隆开创了新纪元，具有跨时代的意义。从而使克隆技术从胚胎核移植时 代转入体细胞克隆时代。在这之后许多人采用不同的方法也取得了体细胞克隆羊 的成功1 4 1 删。国内扬州大学的王玉阁等用胎儿成纤维细胞通过核移植获得了克隆 山羊i 删。 除了应用新鲜体细胞及卵母细胞进行体细胞核移植研究外，人们还对冷藏 4 5 1 与冷冻保存的体细胞【蚓、卵母细胞i 钥或弃核并激活后的胞质体冷冻保存、 克隆胚的冷冻保存【4 9 的研究，对解决体细胞不能长期保存与应用的问题、屠宰淡 季受体卵母细胞的供应问题及克隆胚的运输、保存及与受体动物子宫环境同步化 的问题起到促进作用。一些学者已报道冻存卵母细胞可支持核移植胚发育到囊胚 期【4 ”。还有学者报道玻璃化冷冻的卵母细胞用于核移植和新鲜卵母细胞一样好 p 。甚至有学者报道经血清饥饿进入静止期的卵丘细胞在一7 04 c 冻一融后立即进 行核移植，重构胚卵裂率高达9 7 ，显著高于非冷冻细胞( 8 5 ) 】。 23 1 胎儿成纤维细胞 s c h n i e k e 掣”】采取3 5 日龄绵羊胎儿成纤维细胞，体外培养2 9 代，核移植后 产6 羔。c i b e l l i 等【5 2 j 采取5 5 日龄牛胎儿成纤维细胞，体外培养传2 代，核移植后产 4 犊。w e l l 等【”1 采取3 4 日龄牛胎儿成纤维细胞，体外培养2 8 代，核移植后获得妊 娠。v i g n o n 等【5 4 j 采取5 0 6 0 日龄牛胎儿成纤维细胞，体外培养2 1 2 代，核移植后 产1 犊。此外，其他科学家在兔和猪上也进行了试验，但未见有产仔的报道。 23 2 乳腺细胞 w i l l m u t 等【2 】从一只6 岁妊娠母羊乳腺中采取细胞，经培养传代和血清饥饿法 处理后，通过核移植得到2 7 7 枚融合胚，再经体内培养后有2 9 枚发育到囊胚，移植 给1 3 只受体母羊，其中有一只妊娠并最终产下一只活羔，从而诞生了世界首例成 年体细胞核移植后代。z a k h a r t c h e n t o 等【55 】从一头2 3 岁牛乳腺中采得细胞，体 外培养l 5 代，核移植后共获9 3 枚融合胚，其中3 2 枚( 3 4 ) 发育到囊胚，胚胎移植 后有两头受体妊娠4 月以上。如能顺利诞生，它将成为继多莉之后的第二个成年动 物乳腺细胞核移植后代，而成为第一个牛乳腺细胞核移植后代。近期，日本科学家 从一头产犊后母牛初乳中获取乳腺细胞，核移植后成功产犊，为非手术法获取牛 乳腺细胞用于核移植开辟了新途径。 2 33 卵丘颗粒细胞 w a k a y a m a 等【56 】分离卵母细胞周围的卵丘细胞作为核供体细胞，不经培养直 接作核移植，获得5 0 多只克隆小鼠。这是继“多莉”后的第二批哺乳动物体细胞 核移植后代，它的成功有力地支持了w i l m u t 等 5 5 的试验结果。w a k a y a m a 等p6 j 同 时还进行了公鼠睾丸支持细胞和雌鼠神经细胞的核移植试验并获得附植的结果， 但均中途流产。k a t a o 等【”l 采取屠宰场牛卵巢卵母细胞周围的卵丘细胞，经培养 6 传代和血清饥饿法处理，核移植后共获4 7 枚融合胚，其中1 8 枚( 4 9 ) 发育到囊胚， 将6 枚移植给3 头受体，出生了5 头牛犊( 8 3 ) ( 其中3 头生后即死亡) 。这是迄今为止 体细胞核移植成功率最高的一次报道。卵丘细胞适宜于核移植的可能原因有：( 1 ) 卵丘细胞是自然静止在g o g 1 期的细胞；( 2 ) 卵丘细胞是包围在卵母细胞周围的细 胞，核移植后二者胞质更易互融；( 3 ) 卵丘细胞内端粒酶活性较高，因此不会由于 染色体端粒变短而使细胞老化。 2 3 4 输卵管子宫上皮细胞 在k a t o 等1 5 ”的试验中，进行了输卵管上皮细胞的核移植试验。输卵管上皮细 胞同样从屠宰场动物身上获取，经培养传代和血清饥饿法处理，核移植后共获9 4 枚融合胚，其中2 4 枚( 2 3 ) 发育到囊胚，把4 枚移植给2 头受体，结果出生了3 头牛犊 ( 其中1 头生后死亡) 。另外媒体报道，韩国科学家以牛子宫上皮细胞作为核供体也 获得了核移植后代。 23 5 肌肉细胞 v i g n o n 等p 8 1 采取5 0 6 0 日龄牛胎儿肌肉细胞，培养3 1 2 代，核移植后最终 获2 5 的妊娠率( 后报道出生两头牛犊) 。 2 3 6 耳部皮肤细胞 v i g n o n 等【5 4 l 采取牛犊耳部皮肤细胞，培养传代2 1 2 代作为核供体，最后获l 头妊娠和1 头产仔的结果。z a k h a r t c h e n t o 等p 习采取一头2 3 岁牛耳部成纤维细 胞，培养l 5 代后作为核供体，最后得到妊娠的结果。最近据媒体报道，美国华裔 科学家杨向忠领导的课题组从一头1 3 岁高龄母牛耳部取得细胞，最后成功获得核 移植后代。这一结果证实，利用体细胞核移植技术来拯救由于老龄而绝育的有价 值育种是可行的。目前尚未在正式学术刊物上看到有关文章发表。 2 、4 异种问核移植研究进展 异种间核移植，也叫种间核移植( i n t e r s p e c i e sn u c l e a r t r a n s p l a n t a t i o n ) ，是指将 某一种动物的细胞核通过显微操作移植到另一种动物的去核卵母细胞中，并使之 发育的过程。并且在自然界中也存在着种间杂交的现象。异种阃胚胎卵裂球细胞 以及体细胞核移植的研究表明，卵母细胞对移入的细胞重新编程的能力，在某些 不同品种的哺乳动物之间，似乎并不受到限制。异种克隆在一些鱼类、两栖类上 已获成功。有人报道，牛卵母细胞可作为多种动物细胞核的受体，异种克隆后， 能使羊、猴、鼠和猪等不同种属动物的细胞核激活，并可发育为早期胚胎。美国 a d v a n c e dc e l lt e c h n o l o g y ( a c t ) 公司1 9 9 8 年宣布，早在1 9 9 6 年，他们将一个 人的面颊细胞与去核的牛卵母细胞融合，形成的杂合细胞至少在体外分裂了5 次，至3 2 细胞阶段而终止了实验。a c t 公司1 9 9 8 年1 1 月1 2 日同时宣布，将杂 合细胞，或称异构胚继续培养，至囊胚阶段后，分离内细胞团，已培育出具有全 7 能性的胚胎干细胞。异种克隆对于挽救濒危动物，尤其是体外生产异种克隆的人 类囊胚，从而分离人类胚胎干细胞，具有重要意义。人类胚胎干细胞的研究，主 要受到伦理道德的限制。1 9 9 8 年，t h o m p s o n 和g e a r h a r t 分别报道使用体外受精 胚胎和流产胎儿，成功地分离了胚胎干细胞。所使用的方法，必须要杀死“个 人”，才能获得胚胎干细胞。而异种克隆的优势在于，不使用人类胚胎或胎儿作 为干细胞的来源，而是选用人体体细胞和动物卵，完成人细胞核的“去分化”过 程，指导胚胎发育最有人将l 例包皮过长的男童切除皮肤的成纤维细胞，移入 去核兔卵母细胞，共获1 0 9 枚胚胎，其中部分发育至桑套胚阶段【5 ”。 2 4 1 鱼类的异种闻核移植 在低等脊椎动物中，由于鱼类的卵子很大，又很容易进行体外培养，也由于上 个世纪5 0 6 0 年代受显微操作技术、胚胎培养技术和仪器的限制，研究者都采用 鱼类和两栖类的卵子进行有关的核移植和显微操作。 我国学者早在2 0 世纪6 0 年代就开始了鱼类的异种核移植。在鱼类不同属问 的囊胚细胞核移植研究中，童弟周等把鲤鱼胚胎细胞核移植到鲫鱼去核卵中，有 3 2 的移核胚发育到成鱼【。严绍颐等把鲫鱼的细胞核移植到鲤鱼的去核卵中， 有0 9 发育到成鱼。在鱼类不同亚科问的囊胚细胞核移植研究中，童弟周【6 l 】等 把金鱼囊胚细胞核移植到去核的鲭皴鱼卵胞质中，有0 4 发育成幼鱼。鲂皴鱼 囊胚细胞核移植到金鱼卵胞质中组成的移核胚胎，有i 1 发育成幼鱼。将发育 到囊胚的金鱼鳞皴鱼移核胚胎细胞核再移植到金鱼的去核卵中，有i 6 发育为 幼鱼。在另一个亚科间的组合，草鱼核移入团头鲂卵胞质中，虽然移核鱼的形态与 核供体( 草鱼) 相似，但与草鱼和团头鲂相比，移植鱼均有新的血清蛋白出现，并认 为这是由于受体胞质影响了供体核的基因表达所致。在科问的金鱼核移到泥鳅卵 胞质的异种核移植中，5 的移植胚发育到幼鱼【“。目间的异种核移植组合，如罗 非鱼核移入鲤鱼卵胞质或泥鳅卵胞质中均有发育到幼鱼的记录。另外，目间的罗 非鱼核与金鱼卵胞质的组合，甚至纲间的小鼠核与泥鳅卵胞质的组合也可发育至 原肠胚和囊胚阶段【6 3 6 4 1 。 24 2 两栖动物的异种间核移植 梁桂霞等报道 ”l ，将非洲爪蟾囊胚细胞核移人花背蟾赊成熟去核末受精卵 中有3 6 5 的发育到囊胚，1 4 的发育成蟒鲜，0 3 6 的发育成幼蟾；将中华大 蟾赊囊胚细胞核移人花背蟾赊成熟去核末受精卵中有2 9 1 的发育到囊环，2 o 的发育成蟒鲜，但没有能发育成幼蟾。 243 哺乳动物问的异种核移植 1 9 9 2 年，w o l f e 和k r e a m e r 报道了进行哺乳动物种间核移植的情况，他们将 1 6 3 2 期的牛胚胎核移入对半分割的美洲水牛、山羊、绵羊和仓鼠的去核卵母 细胞中。另外，山羊和绵羊的胚胎细胞也作为供体移入对半分割的牛卵中。重构 胚移入绵羊输卵管内进行体内培养，6 7 d 后冲出以分析重构胚的发育状况。结 果指出，与同种内的核移植相比较，异种间核移植胚胎发育至囊胚的效率很低。仅 有很少的牛美洲水牛和牛羊的核质杂合胚发育至囊胚阶段。异种问核移植胚的 囊胚发育率不到2 。其中1 个山羊一牛的异质扩张囊胚经冻存后移植到一经同步 化处理的西班牙母兔( s p a n i s h d o e ) 体内，结果未观察到有活体胎儿妊娠。他们的 实验也观察到，牛的供体核移入仓鼠卵母细胞中的异种重构胚不能进行甚至1 次 的分裂，7 2 枚重构胚无1 例可分裂到2 细胞期1 6 6 1 。d o m i n k o 等【6 7 野牛、绵羊、 猪、猴和大鼠的体细胞作供体移入牛去核卵母细胞中，重构胚均发育到囊胚，前4 种组合囊胚率分别为1 7 3 1 3 9 ，1 4 3 ，1 6 6 。其中以绵羊和野牛体细胞作供 体重构胚移植受体均得到早期妊娠。w h i t e 等【6 8 】以盘羊体细胞作供体，以绵羊卵 母细胞作受体构建重构胚，囊胚率为1 5 6 ，经分析胚胎细胞具有正常核型，移植 受体后有早期附植。y o o n 等【_ 7 0 】进行猪牛异种细胞核移植也得到了体外发育囊胚。 韩国学者h w a n g 等 7 1 l 用成年韩国虎的皮肤成纤维细胞分别与猫和牛的卵母细胞 构建重构胚，桑囊率分别为8 8 ，1 8 。将1 6 0 枚2 4 细胞胚移植到3 只狮子和 1 只虎的输卵管，结果3 只狮子分别于4 4 ，6 0 和1 2 0 d 返情，1 只虎于5 8 d 返情。 在国内，梅祺等进行了以小鼠8 细胞分裂球( 含细胞核) 移入兔去核卵母细胞 的实验。结果移入小鼠输卵管中的融合重构胚有4 3 1 的发生分裂，有5 4 的重 构胚发育到囊胚期i “j 。 王敏康等采用小鼠2 细胞期胚胎的核质体( k a r y o p l a ) 为供体，移入兔去核 卵母细胞的实验结果也证明，小鼠兔异种间的核移植重构胚可在体外培养的条 件下发育至囊胚期。将在体外培养发育到2 4 细胞期的重构胚分别移入受体小 鼠和受体兔中，结果均末产仔，也未发现死胎和着床点【7 2 l 。陈大元等在用不同类 型大熊猫体细胞为供体进行的异种核移植研究中，将体外培养的大熊猫骨骼肌、 子宫上皮和乳腺细胞分别作为供体核移入兔的去核卵母细胞中，均可支持早期重 构胚的发育。其中以乳腺细胞效果最好，骨骼肌细胞最差。对线粒体d n a 的分析 表明，重构囊胚中并存有大熊猫和兔的线粒体，但细胞核d n a 完全属于大熊猫的 7 3 1 。刘冀珑( 2 0 0 0 年博士学位论文) 采用新鲜分离的小鼠卵丘细胞直接注入到受 体牛的去核卵母细胞中，经过激活处理后进行体外培养，结果有5 7 的重构卵可 进行分裂。以这些分裂为8 1 6 细胞期的卵裂球为供体与去核小鼠卵母细胞进行 电融合，结果有2 0 4 5 的继代重构卵发生卵裂，但未能发育到4 细胞期。我们 最近在大、小鼠和沙土鼠间进行的核移植交换后的体外受精及核移植结果表明， 以装入小鼠透明带的去核大鼠m i i 期卵母细胞为受体，通过显微操作移入c 5 7 b l 6 小鼠( 黑色) 的m i i 期核( 纺缍体) 及少量细胞质，经电融合方式构建成异质重构卵 母细胞，并在m 1 6 + e t 培养液中与c 5 7 b l6 小鼠的获能精子进行i v f 。结果表明 这种重构卵可与小鼠精子完成正常的i v f 及第l 2 次分裂。将1 3 细胞期的 2 2 个重构胚胎移入4 只自然交配后怀孕1d 的昆明小鼠( i r d “l k l m ，白色) 的输卵 管中，结果无异种重构胎儿出生，子宫中也未发现有着床点和死