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鹅m y o s t a t i n 基因单核苷酸多态性与 生产性能相关的研究 专业：动物遗传育种与繁殖 研究生：郑云 导师：龚道清教授 顾志良副教授 摘要 肌肉生长抑制素是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子。本研究采用 p c r s s c p 和d n a 测序的方法检测了m y o s t a t i n 基因的单核苷酸多态性，并对浙 东白鹅、五龙鹅、扬州鹅、朗德鹅、莱茵鹅、豁眼鹅、吉林农大自鹅、狮头鹅、 皖西白鹅、籽鹅等不同鹅品种( 品系) 单核苷酸多态性进行了群体遗传分析。同 时利用狮头鹅、皖西白鹅、籽鹅对m y o s t a t i n 基因基因型与1 1 l 周龄体重、屠体 重、全净膛重、半净膛重、胸肌重、腿肌重等性状进行了关联分析。结果如下： ( 1 ) 在检验的1 2 对m y o s t a t i n 基因的引物中，我们发现4 对引物的扩增片段具有 多态性，分别为启动子区域7 6 0 b p 处的t - g ，5 4 2 b p 处的c - t ，4 9 8 b p 处的a c 的 突变，内含子l 的1 6 3 2 b p 处的a - g 的突变。 ( 2 ) 不同鹅品种( 品系) 群体遗传学分析表明，启动子区域引物p 3 扩增片段多 态性位点在各群体中等位基因a 的频率均高于等位基因b ，且基因频率均高于 0 7 7 ，表现为优势基因。引物p 4 扩增片段多态性位点在扬州鹅、朗德鹅、狮头鹅 群体中等位基因d 的频率均高于等位基因c 的频率，等位基因d 的频率分别为 0 6 2 5 0 、0 5 4 8 8 、0 6 4 7 4 ，而在其余群体中均表现为等位基因c 的频率高于等位基 因d 的频率。因此我们可以推测等位基因d 可能与肌肉生长有关，其结果需进一 步验证。引物p 5 、p i i 扩增片段多态性位点在各群体中的等位基因频率分别表现 为等位基因e 均高于等位基因f 的频率，等位基因j 的频率均高于等位基因k 的 频率。 ( 3 ) 对m s i n 基因的不同基因型与皖西白鹅、籽鹅、狮头鹅检测个体的生产性能 进行最小二乘分析结果表明：在p 3 位点上狮头鹅1 周龄、6 周龄、8 周龄、9 周龄、 1 0 周龄、1 1 周龄体重，具有b b 型的个体体重显著高于a b 型个体的体重伊 d 0 5 具有b b 型个体的屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重显著高于a b 型 和删型，在皖西白鹅群体中的p 3 位点不同基因型b b 型显著高于a b 型和州型。 在p 4 位点上，在狮头鹅群体中的具有d d 型的个体各周龄体重、屠体重、半净膛 重、全净膛重、胸肌重、腿肌重显著高于c c 型和c d 型俾 o 夕；在皖西白鹅 群体中具有c c 型的个体3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、1 0 、1 l 周龄体重显著高于c d 型 p a 酊土具有c c 型个体的屠体重、胸肌重、腿肌重显著高于d d 型伊 n 雒名 在籽鹅群体中具有c c 型的个体的屠体重、半净膛重、全净膛重显著高于d d 型 p n 0 5 上在p 5 位点上，在狮头鹅群体中的具有e e 型个体的3 、4 、5 、6 周龄 体重显著高于e f t 型和f f 型伊 n ) ，具有e f 型个体的屠体重、半净膛重、腿 肌重、全净膛重、胸肌重显著高于f f 型r p d ) ；在皖西白鹅群体中的具有e e 型个体1 1 周龄体重显著高于f f 型俾 n 巧 具有胛型个体的屠体重，胸肌重、 腿肌重显著高于e f 型伊 n 0 5 上 关键词：鹅；肌肉生长抑制素基因：单核苷酸多态性；肉用性状 s t u d yo ns n p o ft h em y o s t a t i ng e n ea n di t sa s s o c i a t i o n w i t hp r o d u c t i o np e r f o r m a n c ei ng e e s e m sc a n d i d a t e ：z h e n gy u n d a v i s o r ：p r o f g o n gd a o q i n g a d j u n c tp r o f g uz h i l i a n g ( c o l l e g eo f a n i m a ls c i e n c ea n dt e c h n o l o g y ，y a n g z h o uu n i v e r s i t y ，c h i n a ) a b s t r a e t m y o s t a t i ni san e wm e m b e ro ft h et g f - ds u p e rf a m i l y i ti ss p e c i f i c a l l ye x p r e s s e d i ns k e l e t a lm u s c l ec e l l sa n df u n c t i o n sa sa n e g a t i v er e g u l a t o ro fs k e l e t a lm u s c l eg r o w t h t h i ss t u d yw a sd e s i g n e da n da i m e dt oi d e n t i f yt h es i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) o fm y o s t a t i ng e n eb yp c r - s s c pa n dd n as e q u e n c i n gi n v a f i o l l sb r e e d s i n c l u d i n gz h e d o n gw h i t eg e e s e , w u l o n gg e e s e ，y a n g z h o ug e e s e ，l a n d i s hg e e s e ，r h e i n e g e e s e ，h u og e e s e ，j i l i nw h i t eg e e s e ，s h i t o ug e e s e ，w a n x iw h i t eg e e s e ，z ig e e s ee t c ，a n d m a d et h ea n a l y s i so ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nm y o s t a t i na n dt h et r a i t so ft h ew e i g h to f 1 1 1 w e e k sg e e s e ，b o d yw e i g h t , c a r c a s sw e i g h t ，e v i s c e r a t e dw e i g h t ，h a l f - e v i s c e r a t e d w e i g h t , b r e a s tm u s c l ew e i g h t ，l e gm u s c l ew e i g h t t h er e s u l t sa r e a st h ef o l l o w i n g ： ( 1 ) t h e1 2p a i r so fp r i m e r sf o rm y o s t a t i ng e n ew e r ed e s i g n e d ，f o u rs n p sw e r e i d e n t i f i e di nt h eg e e s em y o s t a t i ng e n eb yp c r - s s c pa n dd n as e q u e n c i n g t h ef o u r s n p sf o u n di nt h ep r o m o t e rr e g i o no ft h em y o s t a t i ng e n ew e r er e s p e c t i v e l y , tt o0 ( 7 6 0 b p ) ，c t 0 t ( 5 4 2 b p ) ，a t o c ( 4 9 8 b p ) a n d t h e f i r s t i n t r o nr e g i o n a t o g ( 1 6 3 2 b p ) ( 2 ) p o p u l a t i o ng e n e t i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a tg e n o t y p ef r e q u e n c yo f a l l e l ea ( p 3 ) i i l p r o m o t e rr e g i o nw a sh i g h e rt h a nt h a to fa l l e l eb ，a n dt h ef r e q u e n c yi so v e ro 7 7 ，w h i c h h a saa d v a n t a g eo v e ro t h g rg e n o t y p e s f r e q u e n c yo fa l l e l ed ( p 4 ) a m o n gy a n g z h o u g e e s e ，l a n d i s hg e e s e ，a n ds h i t o ug e e s ew a sh i g h e rt h a nt h a to fa l l e l ec ，a n dt h e f r e q u e n c yo fa l l e l eda r er e s p e c t i v e l yo 6 2 5 0 o 5 4 8 8a n d0 6 4 7 4a m o n gt h et h r e e b r e e d s ，b u to nt h ec o n t r a r yi no t h e rb r e e d si tr e p r e s e n t e dt h a tf r e q u e n c yo fa l l e l eci s h i g h e rt h a nt h a to fa l l e l ed s oi tc a l lb ep r e s u m e dt h a ta l l e l em a yb er e l a t e dt ot h e g m w i h t h ep r e s u m p t i o ns h o u l dg e tf u r t h e rv a l i d a t e d g e n o t y p ef r e q u e n c yo fa l l e l ee o fp r i m e rp 5i sh i g h e rt h a nt h a to fa l l e l efi na l lb r e e d s ，a n df r e q u e n c yo fa l l e l ejo f p r i m e rp 1li sh i g h e rt h a nt h a to f a l l e l ek ( 3 ) a s s o c i a t i o no fg o o s em y o s t a t i ng e n es n p sa n dp r o d u c t i o nt r a i t sw e r ea n a l y s i s e d , t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ew e i g h to fb bg e e s eo f p 3w a sn o t a b l yl a r g e rt h a nt h eo n e o fa b g e e s ei nt h ee x p e r i m e n tc o n d u c t e da m o n gt h es h i t o ug e e s ea tt h ea g eo fo n e w e e k ，s i xw e e k s ，e i g h tw e e k s ，n i n ew e e k s ，t e nw e e k s ，a n de l e v e nw e e k s ( p o 0 5 ) ，a n d t h eb o d yw e i g h t ，c a r c a s sw e i g h t , e v i s c e r a t e dw e i g h t ，h a l f - e v i s c e r a t e dw e i g h t , b r e a s t m u s c l ew e i g h t ，l e gm u s c l ew e i g h to ft h eb bg e e s ea l s ow e r em u c hl a r g e rt h a nt h ea b g e e s ea n da ag e e s e ，a n dt h eg e n o t y p eb bo fw a n x iw h i t eg e e s eo fp 3w a sn o t a b l y l a r g e rt h a nt h eg e n o t y p ea ba n da a i na d d i t i o n , t h ew e i g h to fd dg e e s eo fs h i t o u g e e s eo f p 4i sm u c hl a r g e rt h a nt h o s ei nc cg e e s ea n dc dg e e s ei nb o d yw e i g h t ，c a r c a s s w e i g h t ，e v i s c e r a t e dw e i g h t ，h a l f - e v i s c e r a t e dw e i g h t ，b r e a s tm u s c l ew e i g h t ，l e gm u s c l e w e i g h t 伊 0 0 5 ) t h ew e i g h to fc cg e e s ew a sn o t a b l yl a r g e rt h a nt h eo n eo fc dg e e s e a m o n gt h ew a n x ig e e s ea tt h ea g eo ft h r e ew e e k s ，f o u rw e e k s ，f i v ew e e k s ，s i xw e e k s , s e v e nw e e k s ，e i g h tw e e k s ，n i n ew e e k s ，t e nw e e k s ，e l e v e nw e e k s ( p 0 0 5 ) ，a n dt h e w e i g h to fc cg e e s ei nc a r c a s s ，b r e a s tm u s c l e ，l e gm u s c l ew a s a l s ol a r g e rt h a nd dg e e s e ( p o 0 5 ) m o r e o v e r , a m o n gt h ez ig e e s e ，t h ec a r c a s sw e i g h t , e v i s c e r a t e dw e i g h t , h a l f - e v i s c e r a t e dw e i g h to fc cg e e s ei sa l s ol a r g e rt h a nd d g e e s ef p o 0 5 ) t h ew e i g h t o f e es h i t o ug e e s eo f p 5i sl a r g e rt h a nt h a to f e fa n df fo n e sa tt h ea g eo f t h r e ew e e k s , f o u rw e e k s ，f i v ew e e k sa n ds i xw e e k s o 0 5 ) ，a n dt h ec a r c a s sw e i g h t ，e v i s c e r a t e d w e i g h t ，h a l f - e v i s c e r a t e dw e i g h t ，b r e a s tm u s c l ew e i g h t ，l e gm u s c l ew e i g h to f e fg e e s ei s a l s ol a r g e rt h a nf fg e e s e ( p o 0 5 ) i nw a n x iw h i t eg e e s e ，t h ew e i g h to fe eg e e s ei s l a r g e rt h a ne fo n e sa tt h ea g eo fe l e v e nw e e k s ( p o 0 5 ) ，a n dt h ec a r c a s sw e i g h t ，t h e b r e a s tm u s c l ew e i g h t ，t h el e gm u s c l ew e i g h to ff fg e e s ei sn o t a b l yl a r g e rt h a ne fo l l e s 口 o 0 5 ) k e yw o r d s ：g o o s e ，m y o s t a t i ng e n e ，s i n g l en u e l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，m e a tp r o d u c t i o n t r a i t 缩略词表 ( a b b r e v i a t i o n s ) 缩略词英文全称中文全称 a f l p a m p l i f i e d f r a g m e n t sl e n g t hp o l y m o r p h i s m 扩增片段长度多态性 e d n a c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 互补脱氧核糖核酸 c h oc h i n e s eh a m s t e ro v a r y中国仓鼠卵巢上皮 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核耱核酸 d s c pd o u b l es t r a n dc o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m双链构象多态性 g d f 8 ，1 1g r o w t hd i 廊m t i a t i o nf a c t o r8 ，1 1生长分化因子8 ，1 1 h e h e t e r o z y g o s i t y 杂合度 h i vh u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv t r u s人类免疫缺陷病毒 i g f i i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r - i 胰岛素样生长因子i m a sm a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o n标记辅助选择 m hm u s c u l a rh y p e r t r o p l y双肌基囡 m s t n m y o s t a t i n 肌肉生长抑制素 m r n a m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d 信使核糖核酸 n ee f f e c t i v en u m b e ro f a l l e l e s有效等位基因数 o r f o p e nr e a d i n gf r a m e 开放读码框 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i 聚丙烯酰胺凝胶电泳 q t lq u a n t i t a t i v et r a i tl o c u s 数量性状遗传位点 r a p dr a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a随机扩增多态性d n a r f l pr e s t r i c t i o nf i a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m限制性片段长度多态性 s n p s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o 删s m 单核苷酸多态性 s s c p s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m 单链构象多态性 t g f 1 3t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rb o t a l 转化生长因子b 塑墨! 苎丝竺竺塑墨里兰壁堑墼童查堡兰竺主堡堂塑茎里窒 ! 第一部分文献综述 1m y o s t a t i n 基因研究进展 1 1 骨骼肌生长抑制素m y o s t a t i n 基因的结构和特点 1 9 9 7 年m e p h e r r o n 等根据t g f - 1 3 超家族( 转化生长因子b 超级族) 的保守区 设计了一对简并引物，用p c r 的方法扩增出一个约2 8 0 b p 的新产物，用该产物作 为探针筛选小鼠骨骼肌e d n a 文库，得到一个e d n a 序列( m e p h e r r o n 等，1 9 9 7 ) 。 分析表明该e d n a 中只有一个开放读码框( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) ，共编码 3 7 6 个氨基酸，即g d f 8 因子( 生长分化因子8 ，g r o w t h d i f f e m t i a t i o n f a c t o r 8 ) 。 这个因子具有t g f f 3 超家族成员结构上共同的特点：1 ) 在蛋白的n 末端有相同 的非亲水性氨基酸序列，作为分泌信号；2 ) 在c 末端有保守的蛋白酶水解位点 r s r r ：3 ) 一般有9 个半胱氨酸位于c 末端形成“半胱氨酸节点”；4 ) 其c 端通过 形成二硫键组成具有生物学活性的二聚体发挥功能。在c h o 细胞( 中国仓鼠卵巢 上皮细胞) 中表达g d f 8 的研究表明，与t g f b 超家族其他因子相似，g d f 8 因 子也能被分泌到胞外并被酶解加工，而后其c 端通过形成二硫键组成具有生物学 活性的二聚体。但g d f 8c 端区域的碱基序列与t g f 1 3 家族的其他成员的同源性 很低，因此目前无法把g d f _ 8 归入已有的亚家族中，而将其列为t g f - p 超家族中 的一类新因子。研究发现g d f 8 主要在骨骼肌中表达，g d f 8 基因敲除鼠的骨骼 肌是正常野生型小鼠的3 倍以上，丽在其他生长发育性状上没有任何表现型的差 异。这是自1 9 8 2 年p a l m i t e r 等将大鼠的生长激素基因转入小鼠体内产生“超级小鼠” 之后的又一只“超级小鼠”。g d f 8 基因因此得到广泛的关注。初步研究结果表明， g d f 8 因子对骨骼肌生长具有抑制作用，定名为肌肉生长抑制素( m y o s t a t i n ， m s t n ) ( m e p h e r r o n 等，1 9 9 7 ) 1 1 】1 2 、 3 1 。 1 9 9 8 年g o n z a l e z c a d a v i d 等1 4 克隆了人的m y o s t a t i n 基因组基因，人m y o s t a t i n 基因全长7 7 k b ，由3 个外显子和2 个内含子构成，内含子l 和内含子2 分别为1 s k b 和2 4 k b 。三个外显子编码的氨基酸长度分别为1 2 5 、1 2 4 和1 2 6 个氨基酸。m c p h e r r o n 等以小鼠m y o s t a t i n 保守的c 末端e d n a 为探针筛选不同动物的骨骼肌e d n a 文 扬州大学硕士学位论文 库，克隆了大鼠、人、猪、鸡、牛、绵羊、狒狒和斑马鱼的e d n a 序列。序列分 析表明，m y o s t a t i n 与t g f b 超家族其他成员一样，在不同物种间高度保守，就c 端序列而言同源性可高达9 0 以上。另外通过基因组s o u t h e r n 杂交分析，在大部 分物种中m y o s t a t i n 保守序列探针检测到另一个较弱的条带，进一步在人和小鼠中 分析表明此带与基因g d f 1 1 ( 生长分化因子1 1 ，g r o w t hd i f f e m t i m i o nf a c t o r1 1 ) 高度相符。 1 2m y o s t a t i n 基因的表达 最初，通过对小鼠m y o s m t mm r n a 分子杂交分析( n o r t h e r nb l o t a n a l y s i s ) ，发 现m y o s t a t mm r n a 仅存在于胚胎生长发育时期和成熟小鼠的骨骼肌中，而在其它 组织( 肺、胸腺、脑、肾、胰腺、肠、脾、睾丸、肝、卵巢等) 中均检测不到( m c p h e r r o n 等，1 9 9 7 ) 。原位杂交分析得知，在小鼠胚胎形成过程中m y o s t a t i n 因子在将来会 发育成骨骼肌的肌肉体节层特异性表达：在胚胎发育的后期和成年动物中， m y o s t a t i n 在全身所有骨骼肌中都有不同水平的表达，而在其他组织中检测不到。 可见，m y o s m t i n 因子对骨骼肌的发育起着十分重要和独特的作用和功能。 m y o s t a t i n 基因的表达随着生物体的发育而变化，起初m y o s t a t i n 被认为仅存在 于骨骼肌，而其他组织没有，但最近很多的报道认为m y o s t a t i nm r n a 和蛋白也 存在于其他组织中。s h a r m a 等( 1 9 9 9 ) 认为m y o s t a t i n 也可能在各种组织中起着不 同的作用1 5 1 。他们发现在羊和牛的心脏组织中有m y o s t a t i n 基因的表达。从比利时 蓝牛胚胎期的心脏组织获得的m y o s t a t me d n a 存在ll b p 缺失，而在正常的牛和羊 骨骼肌中检测到了未加工的和已有活性的m y o s t a t i n 。m y o s t a t i n 的表达不仅限于骨 骼肌，在胎儿和成年牛的心脏也有表达，定位于心脏的p u r k i n j e 纤维( 浦肯野纤维) 和心肌细胞中。说明在心脏的发育和生理过程中，m y o s t a t i n 起重要的作用。 s h a o q u a n 等人( 1 9 9 8 ) 发现在猪的腺体中有m y o s t a f i nm r n a ，可能调节初生 猪的生长，他们也同样发现相似的m r n a 在猪的骨骼肌中，但没在其他组织中检 测到。大部分的研究表明，m y o s t a t i n m r n a 的水平在胚胎期时最高，到了出生后 直至成熟不断下降。体重下降的h i v ( 人类免疫缺陷病毒，h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c y 郑云：鹅m y o s t a t i n 基因单核苷酸多态性与生产性能相关研究 v i r u s ) 感染者，肌肉生长抑制素的浓度明显较高( g o n z a l e z - c a d a v i d 等，1 9 9 8 1 【4 】。 w e h l i n g 等( 2 0 0 0 ) 的研究表明，即使在完全分化的肌肉细胞中，m y o s t a t i n 的表 达同样受到调节，表达量与肌肉重量变化呈负相判6 】。 1 3m y o s t a t i n 的生物学功能和作用机理 利用基因敲除技术( g e n ek n o c k o u t ) 使小鼠的m y o s t a t i n 基因c 端生物活性 区域缺失，得到缺陷型突变纯合体小鼠，此小鼠可以正常存活并能够生育后代。 检测其体重发现纯合突变的小鼠要比杂合体或野生型的小鼠重约3 0 ( 与性别年 龄无关) 。突变纯合体小鼠肩和臀部的肌肉明显肥大，移去皮肤发现整个身体的骨 骼肌都比野生型的小鼠大的多，单块肌肉的重量约为野生型小鼠的2 3 倍，而脂 肪重量没有太大的变化，所以骨骼肌重量剧增是导致突变小鼠体重增加的主要原 因。进一步检测发现突变型小鼠骨骼肌肌纤维的数目比野生型小鼠多出8 6 偿 n 0 1 ) ，d n a 的量约高出5 0 伊 口0 5 上这表明突变型小鼠肌肉肥大的原因 既有肌细胞的增生( h y p e r p l a s i a ) ，也有肌纤维的肥大( h y p e r t r o p h y ) 。s z a b o 等( 1 9 9 8 ) 报道，该基因的缺失会导致小鼠超级致密肌肉突变( c o m p a c th y p e r m u s c u l a r m u t a t i o n ) 。以上这些研究结果表明m y o s t a t i n 是小鼠骨骼肌特异性生长发育抑制因 子川。 m y o s t a t i n 的这一功能几乎同时由3 个实验室在比利时蓝牛( b e l g i a nb l u e ) 和 皮尔蒙特牛( p i e d m o n t e s e ) 以及a s t u r i a n a 牛得到了验证( g r o b e t 等，1 9 9 k a m b a d u r 等，1 9 9 7 ：m e p h c r r o n 等，1 9 9 7 ) s l 阴【2 】。双肌臀比利时蓝牛具有十分强壮的骨 骼肌，由于肌肉增生( 肌纤维数目增加造成的) 使这种牛的肌肉比其它品种的高 2 0 。尽管对双肌牛的遗传方式已经认识，即是由常染色体上隐性基因控制的，而 且已经将它定位在2 号染色体着丝点附近( c h a r l i e r 等，1 9 9 5 ) ，但其分子遗传的机 理并未搞清。g r o b e t 等( 1 9 9 7 ) 用候选位置克隆的方法证明牛的m y o s t a t i n 基 因与双肌牛表型有关，m y o s t a t i n 基因的编码区的1 1b p 的缺失引起比利时蓝牛和 a s t u r i a n a 牛肌肉的增生f i 】。几乎在同时，m c p h e r r o n 等( 1 9 9 7 ) 用p c r 方法扩增 了牛肌肉生长抑制素基因的3 个外显子，分析表明比利时蓝双肌牛在外显子3 缺 扬州大学硕士学位论文 4 失l l b p ，造成移码突变，使得从缺失后面的第1 4 个密码子开始停止翻译，其结果 是c 一端仅7 个氨基酸得到翻译，其余1 0 2 个氨基酸全部丢失，因而导致肌肉生长 抑制素失去生物学功能。牛的m y o s t a t i n 基因和小鼠有很高的同源性( 9 5 以上) ， 但比利时蓝牛的基因有一个无义突变( n o n s e n s em u t a t i o n ) ，不能合成有活性的 m y o s t a t i n 。k a m b a d u r 等( 1 9 9 7 ) 也发现了比利时蓝牛的m y o s t a t i n 基因第三外显 子的l l b p 缺失，而在皮尔蒙特牛的该区域存在g 突变为a ，导致编码的氨基酸由 保守的半胱氨酸变为酪氨酸，结果肌肉生长抑制素的功能全部或几乎全部丧失 9 1 。 对非双肌牛生长抑制索基因进行分析，未发现肌肉生长抑制素基因在比利时蓝牛 和皮尔蒙特牛检出的突变。根据这一结果推测，肌肉生长抑制素基因的突变是造 成双肌的原因，比利时蓝牛骨骼肌的超量生长可能是由于在骨骼肌细胞中缺少 m y o s t a t i n 抑制作用的缘故。s m i t h 等( 1 9 9 7 ) 的结论进一步验证了上面的结果， 他们将牛的m y o s t a t i n 基因定位在牛的2 号染色体靠近着丝粒的2 q l l 处，而这一 区段正好包含m h ( 双肌基因，m u s c u l a rh y p e r t r o p l y ) 基因座位“。 人的m y o s t a t i n 基因研究也表明该基因与肌肉生长发育相关。研究发现该基因 的启动子区含有m y o d 的结合位点。m y o d 是生物生长发育过程中的一种重要的 转录调节因子。实验证明，m y o d 是引导骨骼肌细胞世系传代的主要参与者，对于 转化的成纤维细胞系的肌原性转变是必须的，所以m y o s t a t i n 基因的骨骼肌特异性 表达可能与m y o d 因子的调节直接相关。另外，m y o s t a t i n 基因的表达在h i v 感染 所引起的骨骼肌萎缩而消瘦的病人中高于正常人( g o n z a l e z - c a d a v i d 等，1 9 9 8 ) ，提示 人类中的某些肌萎缩疾病很可能与m y o s t a t i n 表达异常直接相关【4 j 。 尽管m y o s t a t i n 对骨骼肌生长的抑制功能已被超级鼠等所证实，但其控制肌肉 纤维数量的机理还未阐明。 1 4m y o s t a t i n 基因的研究 1 4 1m y o s t a t i n 基因的研究现状 牛 牛的m y o s t a t i n 基因有3 个外显子和2 个内含子组成，第一、第二外显子为5 0 6 b p 塑蚕堕丝坚塑塑墨里兰堡董墼兰查堡兰尘兰垡墼塑羞堕塑三 和3 7 4 b p ，而第三外显子长度不等( 1 7 0 1 、1 8 1 2 、1 8 8 7 b p ) ，两个内含子为1 8 4 0 b p 和2 0 3 3 b p ，转录起始位点在a t g 上游1 3 3 b p ，p o l y a 信号有3 个，分别在终止密 码子的下游1 3 0 1 、1 4 0 1 、1 4 7 7 b p 处( j e a n p l o n g ，2 0 0 1 ) b 2 1 。p o n c e l e t 等建立了能够 表达牛肌肉生长抑制素融合蛋白的小鼠c h o k 1 细胞系和体外验证的小鼠c 2 c 1 2 成纤维细胞系以及监测纯化的重组蛋白生物活性的方法，以分析该因子的作用机 制1 1 3 1 。p i r o t t i n 等建立了牛2 号染色体着丝粒端高分辨的遗传图谱，建立了个跨 越肌肉生长抑制素基因的重叠群( c o n t i g ) ，覆盖约1 2 m b ，相距最远的2 个标记距 离为7 c m ，分辨率为1 6 0 k b c m t l 4 1 。 c a s a s 等( 1 9 9 9 ) 研究了m y o s t a i n 对皮尔蒙特牛c 3 1 3 y 突变肉牛出生重、断 奶重、周龄重及难产的遗传效应，结果表明：出生重杂合型m h + 较突变型+ ，+ 重 3 2 k g ，难产率野生型m h m h 高于杂合型m h + 0 1 9 ，断奶重杂合型m h + 比突变型 + + 重9 1 蚝，周龄重杂合型i i l i 卅超过突变型斗+ 4 5 k g t l 5 1 。吕文发等( 2 0 0 6 ) 利用 r t - p c r 技术从西门塔尔牛肌肉组织的总r n a 中扩增出m y o s t a t i n 基因的c d n a 序 列，扩增出1 1 2 5b p 片段i 。 猪 s o n s t e g a r d ( 1 9 9 8 ) 将猪的m y o s t a t i n 基因用荧光原位杂交技术物理定位在 1 5 口2 3 。同时通过在第二内含子的多态性标记和相关的微卫星标记连锁分析将该基 因遗传定位在1 5 号染色体连锁群上【m 。j i 等采用n o r t h e r n 杂交分析技术检测到2 个转录子( 1 5 和o 8 k b ) ，从基因的表达来看，猪肌肉生长抑制素基因的m r n a 在 胎儿发育的第2 1 和3 5 天即可在整个胚胎中检测到，至第4 9 天时显著上升 ( p o o s a 从妊娠的第1 0 5 天至出生，背最长肌m r n a 的量显著下降，生后2 周左右( 4 k g 体重) 达到最低点，到体重达5 5 、1 0 7 和1 6 2 k g 时，m r n a 又显著升 高俾 n 叮) 【1 8 1 。s t r a t i l ( 1 9 9 9 ) 报道了猪m y o s t a t i n 基因全序列，该基因共包含3 个外显子，编码部分分别为3 7 3 b p 、3 7 4 b p 、3 8 1 b v ，2 个内含子分别为1 8 0 8 和1 9 7 7 b p ， 还鉴定出两个突变位点( 调控区6 0 7 t a 和外显子c t ) 1 9 1 。 姜运良( 2 0 0 0 、2 0 0 2 ) 对猪的肌肉生长抑制素基因进行了s n p s 搜索，其范围 扬州大学硕士学位论文 覆盖了几乎所有的编码区( 9 6 5 4 ) 和9 7 1 b p 的非编码区。结果在5 调控区检测 到一个t a 的颠换、内含子g a 的转换。编码区的c t 的转换，其结果是消 除了一个h i n f i 或t a qi 限制性内切酶的酶切位点。同时对猪肌肉生长抑制素基因 5 调控区t a 突变与生长性状的关系进行了分析。结果表明，m y o s t a t i n 基因型 对猪后期日增重的效应在剔除基因型与品种的互作效应以后几乎达到显著水平r 尸 = 0 0 5 2 2 ) ，突变等位基因的携带者具有较高的后期平均日增重t 2 0 l 。关学敏等( 2 0 0 6 ) 运用p c r - s s c p 技术对猪肌肉生长抑制素基因5 调控区的突变与部分生产性能f 初 生重和断奶重) 的关系进行了分析，结果表明发现m y o s t a t i n 基因型对初生重影响显 著，对断奶重影响不显掣2 1 1 。杨晓静等( 2 0 0 6 ) 研究发现大白猪公猪m y o s 扭t i i i m r n a 表达水平在2 0 日龄时达到高峰且显著高于相同日龄二花脸公猪r 尸 0 0 5 ) ，而二花 脸公猪在4 5 日龄时才显著升高，其他日龄品种间差异不显著。二花脸公猪和母猪 出生后m y o s t a t i n m r n a 表达水平均表现为上升，4 5 日龄时达到高峰，1 2 0 日龄时 公母猪间差异显著俨 n 卿【2 2 1 。 羊 c l o pa 等( 2 0 0 4 ) 分析了比利时t e x e l 双肌绵羊的遗传机制，与普通绵羊 ( r o m a n o v ) 相比，双肌羊的肌肉生长抑制素基因的编码区虽然没有碱基差异，但 采用该基因的侧翼的微卫星标记进行连锁分析表明，在绵羊染色体2 q 远端区存在 一个对肌肉发育产生效应的q t l ( 数量性状遗传位点) ，推断影响该基因表达的区 域很可能在3 ，或5 ，端的非翻译区或内含子部分【2 3 1 。 刘铮铸等( 2 0 0 6 ) 用p c r - r f l p 法对山羊进行多态性分析，共有2 处突变， 对突变位点产生的不同基因型与体重进行分析表明：九4 型个体的断乳重显著高于 船型和a b 型伊 p i c 0 2 5 为中度多态，p i c o 2 5 为低度多 态。计算公式如下： p i c = 1 一只2 一2 只2 c 2 = 2 只( 1 一只c ) 其中：k 为等j = 位l 基因l 数= l 目= l + ；1 只和马夯莉筠第i 和第j 个等位基因的频率。 h a r d y - w e i n b e r g 平衡检验：指在一个无穷大或足够大规模的封闭的、随机交配 的孟德尔群体中，基因频率和基因型频率在世代交替过程中保持稳定不变，这种 稳定状态称为h a r d y w e i n b e r g 平衡。 r ：釜氅掣 l 玩 其中，口：实际观察值；易：理论值；1 1 ：等位基因数 根据屠体性状及供试鹅群的特点，构建如下线性模型：y = 旷g + b + e ，其中y 为个体观察值，“为群体均值，g 为检测的基因型，b 为品种，e 为随机误差，假 定e 服从正态分布。所有数据均用s p s s l 3 0 统计软件统计分析，基因型与生长性 能的各指标的关系用一般线性模型分析。结果用x - 士s d ( 平均数士标准差) ，具体各 基因型的比较通过多重比较进行。显著性标准为p 0 0 5 为差异显著，p 0 0 1 为差 异极显著。 扬州大学硕士学位论文 第三部分结果与分析 1 鹅m y o s t a t i n 基因s n p s 多态性检测 根据鸡m y o s t a t i n 基因的全序列( a f 3 4 6 5 9 9 ) 和鹅m y o s t a t i n 部分序列 ( a y 3 2 9 6 0 1 ) 设计了1 2 对引物，其中启动子区域五对( p 1 、p 2 、p