（免疫学专业论文）小鼠胚胎干细胞分离培养及其生物学特性的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我 所知，除了文中特别加以标注和致谓t 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得南昌太学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：哔餐 签字日期：w6 年 6 月，口日 学位论文版权使用授权书 本学位沦文作者完全了解南昌文学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大 学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：豫导导师签名：i j 艮 j 签字日期：上6 年6 月，。w 签字日期：p 6 年易月f 。曰 学位沧文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话 邮编 小鼠胚胎干细胞分离培养及其生物学特性的研究 研究生：谢安 导师：汪泱研究员 中文摘要 目的： 胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l s ，e s c s ) 是由动物或人植入前胚胎的内 细胞团( i n n e rc e l lm a s s ，i c m ) 或原始生殖细胞( p r i m o r d i a lg e r mc e l l s ，p g c s ) 分离出来，经体外分化抑制培养筛选出的具有全能性的胚胎细胞。e s c s 是研 究哺乳动物早期胚胎发生，如细胞组织分化、基因表达调控等的个理想模 型，还可为未来再生医学细胞替代疗法和组织器官移植等提供无尽的供体来 源。本实验旨在研究如何从b a l b c 小鼠的囊胚中分离出具有全能性的胚胎 干细胞，并对胚胎干细胞集落进行培养、鉴定，以了解胚胎干细胞生物学特 性，为掌握小鼠e s c s 分离培养技术及将来进一步研究人e s c s 打下基础。 方法： 1 、收集b a l b c 小鼠3 5 d 胚龄的囊胚，分离i c m 细胞进行培养，以 小鼠原代胚胎成纤维细胞( p r i m a r ym o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t ，p m e f ) 作为 饲养层，倒置显微镜下观察并记录集落的形成及生长情况，并进行消化传代 培养。 2 、对细胞集落进行碱性磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，a k p ) 、特殊期 胚胎抗原( s t a g e s p e c i f i ce m b r y o n i ca n t i g e n ，s s e a ) 一1 等e s c s 标志物检测， 并观察其体外向成熟细胞自然分化及向神经细胞定向诱导分化的潜能。 3 、分离提取不同分化阶段e s c s 的胞浆及胞核蛋白，通过免疫印迹法 ( w e s t e r nb l o t t i n g ) 检测e s c s 的增殖分化与核因子一1 c b ( n u c l e a rf a c t o rr 3 3 ， n f r d 3 ) 活化的关系。 结果： 1 、本实验共获得胚泡7 1 个，内细胞团离散后有3 0 例内细胞团出现类e s c s 样集落，大部分可传至3 - 4 代，目前有l 例稳定传至1 2 代而未发生分化，仍 在继续传代培养中。 2 、集落具有典型的e s c s 形态，a k p ，s s e a 一1 均阳性，体外分化具有多 样性，在维甲酸( r e t i n o i ca c i d ，r a ) 诱导下能够向神经样细胞分化。 3 、免疫印迹法检测发现不同阶段的e s c s 胞浆均表达i v t 3 ，而其胞核未 见n f r , b p 6 5 蛋白的表达。 结论： 1 、成功分离1 例具有e s c s 生物学特性的b a l b c 小鼠e s c s 样集落， 并稳定传代至今。一 2 、e s c s 增殖分化过程与n f 一1 c b 信号通路的活化无明显关系。 关键词： 胚胎干细胞；b a l b c 小鼠；原代小鼠胚胎成纤维细胞；细胞培养；n f v _ 1 3 a b s t r a c t o b j e c t i v e e m b r y o n i cs t e mc e l l s ( e s c s ) a r ep l u r i p o t e n tc e i l sd e r i v e df r o mt h ei n n e rc e l l m a s s ( i c m ) o fp r e i m p l a n t a t i o nm a m m a lo rh u m a ne m b r y o sa n dp r i m o r d i a lg e r m c e l l s 伊g c s ) o fe m b r y o s e s c sw e r ee s t a b l i s h e da sas u i t a b l em o d e lt os t u d yt h e e v e n t sw h i c ho c c u r r e di ne a r l yd e v e l o p m e n to fm a m m a l i a ne m b r y o ，s u c ha sc e l l d i f f e r e n t i a t i o na n dg e n ee x p r e s s i o nr e g u l a t i o n i ti sa l s oa ni d e a ls o u r c eo ft i s s u e e n g i n e e r i n ga n dc e l ls u b s t i t u t i v et h e r a p yo fr e g e n e r a t i v em e d i c i n e t h et a r g e to f t h i s e x p e r i m e n t i st o i n v e s t i g a t eh o wt oi s o l a t et o t i p o t e n tm o u s ee s c sf r o m b a l b cs p e c i e sm i c ea n dt oa n a l y s i ss o m eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fe s c s m e t h o d s 1 、t h eb l a s t o c y s t so f3 5 df r o mb a l b cm i c ew e r ec o l l e c t e d ，i c mw e r e i s o l a t e da n dc u l t u r e do nt h ep r i m a r ym o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t ( p m e f ) c e l l f e e d e rl a y e r s t h ec h a n g e so fc e l lc o l o n i e sw e r eo b s e r v e db yi n v e r t e dp h a s e c o n t r a s tm i c r o s c o p ea n dr e c o r d e d 2 、e s l i k ec o l o n i e sw e r ec o n t i n u e dd i s a g g r e g a t e da n dc u l t u r e d t h ee s - l i k e c o l o n i e sw e r ei d e n t i f i e db yd e t e c t i o no fs o m es p e c i a lm a r k e r so fe s c s ，a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( a k p ) a n ds t a g e s p e c i f i ce m b 叮o n i ca n t i g e n ( s s e a ) 一1 ，a n db y o b s e r v a t i o nt h ea b i l i t yo fd i f f e r e n t i a t i o ni nv i t r o 3 、c y t o p l a s m i cf r a c t i o na n dn u c l e a rf r a c t i o no f e s c si nd i f f e r e n ts t a g ew e r e e x t r a c t e da n dt h er e l a t i o n s h i po ft h ep r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fe s c sw i t h t h ea c t i v a t i o no fn u c l e a rf a c t o rr d 3 ( n f - r d 3 ) w e r ea n a l y z e d r e s u l t s 1 、i nt h i ss t u d y ，7 1b l a s t c y s t so fb a l b cm i c ew e r ec o l l e c t e d ，3 0e s - l i k e c o l o n i e sw e r eo b t a i n e da n dm o s to ft h e mc o u l db ec u l t u r e dt om o r et h a nt h r e e p a s s a g e s ，o n eo f t h e mw a sp a s s a g e dt o12p a s s a g e sa n dc u l t u r e ds t a b l e l y 2 、a l lt h ee s l i k ec o l o n i e ss h o w e dt y p i c a lm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f e s c s a k pa n ds s e a 一1p o s i t i v ee x p r e s s i o n ，a n dc o u l dd i f f e r e n t i a t et on e u r o n l i k e 5 c e l l si n d u c e db yr e t i n o i ca c i d ( r a ) 3 、r e s u l t so fw e s t e r nb l o t t i n ga s s a ys h o w e da l lc y t o p l a s m i cf r a c t i o no fe s c s i nd i f f e r e n ts t a g ee x p r e s s e di r d 3 ，b u tt h ee x p r e s s i o no f n f r i b ，p 6 5w e r en o tf o u n d i nn u c l e a rf r a c t i o n c o n c l u s i o n 1 、o n ee s l i k ec o l o n yt h a th a dt y p i c a lb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fe s c sw a s i s o l a t e ds u c c e s s f u l l y 2 、t h ep r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fe s c sw e r ei n d e p e n d e n to nn f r b a c t i v a t i o n k e yw o r d s e m b r y o n i cs t e mc e l l s ；b a l b cm i c e ；p r i m a r ym o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t ； c e l ic u l t u r e ；n f r d 3 6 刖罱 胚胎干细胞( e m b r y o m cs t e mc e l l s ，e s c s ) 是由动物或人囊胚的内细胞团 ( i n n e rc e l lm a s s ，i c m ) 或原始生殖细胞( p r i m o r d i a l g e r mc e l l s ，p g c s ) 分离 出来，经体外分化抑制培养筛选出的具有全能性的细胞。经适当的因子诱导， e s c s 可以分化成一种或多种细胞类型，并可与受体胚胎嵌合形成嵌合体。因 此，e s c s 是研究哺乳动物早期胚胎发生、细胞组织分化、基因表达调控等的 一个理想模型，还可为未来临床细胞替代疗法和组织器官移植等提供无尽的 供体来源。1 9 9 9 年美国( ( s c i e n c e ) ) 将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界 十大科技进展之首，2 0 0 0 年，t i m e 周刊又将其列为2 0 世界末世界十大科 技成就之首，并认为e s c s 和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前 景的领域。 1 9 8 1 年e v a n s 和k a u f m a n 利用实验中获得的延迟着床的囊胚，并将其培 养于丝裂霉素c ( m i t o m y c i nc ，m c ) 处理的s t o ( 一种己建系的小鼠胎儿 成纤维细胞) 饲养层上，获得增殖而未分化的i c m ，进一步培养获得多个e s c s 克隆并建系 1 j 。周年m a r t i n 等用免疫外科法分离得到小鼠囊胚i c m ，将其培 养于s t o 饲养层和小鼠p s a 1e c s c 条件培养基上，建立了小鼠e s c s 系 2 1 。 1 9 8 4 年，w o b u s 首次以小鼠原代胚胎成纤维细胞( p r i m a r ye m b r y o n i cf i b r o b l a s t ， p m e f ) 为饲养层获得了小鼠e s c s 系1 3 。1 9 8 9 年e i s t e t t e r 等首次解聚小鼠桑 椹胚卵裂球并置于p m e f 上培养建立了小鼠e s c s 系，并且与完整桑椹胚分 离e s c s 相比具有较高的成功率【4 1 。虽然s t o 或p m e f 饲养层是天然的有效 分化抑制物，但本身存在的一些不利因素也逐渐暴露出来，如细胞污染，m c 毒性等，凼此人们寻找e s c s 的无饲养层培养的方法。1 9 8 7 年，s m i t h 和 h o p p e r 等首次使用大鼠肝细胞条件培养基作为分化抑制物建立了小鼠e s c s 系 5 1 。随后n i c h o l s 及p e a s e 等直接用白血病抑制因子( 1 e u k e a m i ci n h i b i t o r y f a c t o r ，l i f ) 代替饲养层维持e s c s 而获得成功并建立e s c s 系旧”。1 9 9 2 年， m a t s u i 等以附植后小鼠胎儿生殖嵴的p g c s 为材料，分离得到小鼠e g c s 系， 首次建立了鼠e g c s 系 8 1 。可能是遗传背景的不同，不同品系小鼠e s c s 建系 的难易程度和建系效率存在着较大的差异性。自1 9 81 年e v a n s 和k a u f m a n 建 立1 2 9 系小鼠e s c s 系以来，此后的十年间并未见其它品系小鼠e s c s 建系成 功的报道。直至1 9 9 1 年l e d e r m a r m 等将3 日龄的桑椹胚过夜体外培养后，转 移至人膀胱癌细胞饲养层上培养，成功建立了c 5 7 b l 6 j 系小鼠e s c s 系【w 。 此后，k a w a s e 等以s l l o 为成纤维细胞饲养层，在培养液中添加过量的m l i f 也建立了c 5 7 b l c j 系小鼠e s c s 系【10 】。1 9 9 6 年n o b e n t r a u c h 等首次报道 建立了b a l b c 系小鼠e s c s 系 1 1 】。孙方臻等【1 2 1 将源于s w i s s 小鼠远交群 的昆明( k m ) 系小鼠囊胚培养于p m e f 上，建成了三个昆明小鼠e s c s 系。 虽然目前关于e s c s 建系的方法报道很多，但e s c s 的建系研究更多层面 上属于方法学上的探索，其培养过程本身就是一个相当复杂的系统。而且人 胚胎时期是一个由多潜能e s c s 发育成成熟组织器官的复杂过程，是由单细胞 生物进化为最高级灵长类的一个重演，因此e s c s 要直接应用于人类疾病的治 疗，还需要经过大量的基础科研，积累丰富的基础实验资料。受人卵泡来源 的限制，目前大多数e s c s 研究仍集中在小鼠e s c s ，建立小鼠e s c s 系，掌握 e s c s 的分离培养技术及研究e s c s 增殖与分化调控可为进一步研究人e s c s 分离培养技术及分化调控机制积累资料。 目前国际上通用的小鼠e s c s 系大多是从1 2 9 品系小鼠中获得的，而1 2 9 品系小鼠易感染多种疾病，具高频自发畸胎瘤，其e s c s 容易发生癌化，因此， 该品系小鼠不宜用于免疫学和细胞、组织移植研烈”j 。b a l b c 小鼠是医学 上应用最广泛、已经全面鉴定的性状优良的小鼠品系。1 9 9 6 年n o b e r t r a u t h 掣1 1 1 首次建立b a l b c 小鼠的e s 细胞系，1 9 9 9 年，d i n k e l 等【1 4 】首次用b a l b c 小鼠的e s c s 获得转基因小鼠，来自b a l b c 小鼠的e s c s 克服了1 2 9 小鼠e s c s 的上述缺点，e s c s 及其分化产物接种到同种小鼠体内后，不发生异体排斥反 应，在医学免疫学及组织移植研究中显示出其独特的优点。 明确e s c s 自我更新和多向分化的调控机制，对其将来的应用具有十分重 要的参考价值，近年来国内外学者在信号转导网络等方面进行，许多探讨。 其中土要有l i f 介导的信号传导系统【l5 】和转录因子o c t 3 4 通路【l6 j 。l i f 与其受体 l i f r 结合激活j a k ，通过j a k s t a t 3 通路活化s t a t 3 ，维持e s c s 的未分化状态，这 种l i f l i f r g p l 3 0 j a k - s t a t 3 是目前已知的维持e s c s 未分化的状态的主要信号 通路；o c t 3 4 在囊胚发育的i c m ，胚胎发育的原始生殖细胞以及e s c s 中具有丰 富的表达，而在滋养外胚层和原始内胚层以及分化的e s c s 中表达均下调，敲 除o c t 3 4 基因，e s c s 将发生类似于滋养外胚层和原始内胚层的分化，说明 o c t 3 4 基因与胚胎细胞的发育全能性密切相关，在维持e s c s 未分化状态时也 是必不可少的；- , e e 新的转录调控因子n a t l o g 也发现与e s c s 保持未分化有关 1 7 1 ；此外，f g f ，b m p 和w n t 等信号通路被发现与维持e s c s 自我更新有关 1 8 2 0 1 ； 最近又有科学家发现t g f a c t i v i n n o d a l 信号系统在维持e s c s 的多潜能性方面 是必须的1 2 。 核因子v b ( n u c l e a rf a c t o r 出，n f r d 3 ) 是一种广泛存在于体内多种细胞 的核转录因子，目前已发现它除了调节着1 0 0 多种靶基因的表达，如细胞因子、 化学趋化因子、生长因子、黏附因子、某些急性期反应蛋白以及参与免疫识 别的受体和抗原呈递的蛋白质等阱1 ，这其中就包含了一些与e s c s 自我更新和 多向分化相关的细胞因子。有研究者发现，在许多细胞类型中，n f k b 的活化 能够诱导l i f 的表达【2 2 1 ；此外，n f 曲还能够调节b m p 2 的基因转录口3 】；n f r d 3 抑制物i r d 3 的过渡表达，还可导致b m p 一4 基因下游区发生改变【2 训。另外n f r b 还参与胚胎的发育，而e s c s 体外能够分化成所有三胚层的细胞类型，这点与 胚胎的发育很相似。但是n f r d 3 信号通路的活化是否直接与e s c s 增殖分化有 关，目前还未见报道。 本实验采用p m e f 作为饲养层细胞，从孕鼠囊胚中提取i c m 与饲养层 细胞共同培养，分离培养b a l b c 小鼠e s c s ，并对其特异标志及多分化潜能 等生物学特性进行观察和鉴定，同时观察其在增殖分化的不同阶段n f r b 的 活化状态，为掌握e s c s 分离培养技术及探讨e s c s 的增殖分化调控机制奠定 实验基础。 材料与方法 一、实验材料 1 、实验动物 健康雌、雄性b a l b c 小鼠，由南昌大学医学院动物科学研究部购得。 2 、主要实验仪器设备 超净工作台( 中国苏净集团安泰公司) c 0 2 培养箱( 美国f o r m a 公司) 低温高速离心机( 美国s i g m a 公司) 荧光显微镜 ( 日本o l y m p u s 公司) 倒置显微镜( 日本o l y m p u s 公司) 体视显微镜( 日本o l y m p u s 公司) 纯水仪( 德国s a r t o r i u s 公司) 电子天平( 瑞士m e t t l e r t o l e d o 公司) 低温高速离心机( 美国s i g m a 公司) 冻存盒( 美国n a l g e n e 公司) 酶标仪( 芬兰l a b s y s t e ma s s e a tm u l t i s k a n ) 垂直电泳设备( 国产，北京市六一仪器厂) w a t m a n n3 m 滤纸( 美国b d 公司) 硝酸纤维膜，n c 膜( 美国b d 公司) 漩涡混合器( 国产，上海医科大学仪器厂) 水平摇床( 国产，北京市六一仪器厂) 暗盒( 美国柯达公司) x 胶片( 美国柯达公司) 3 、主要试剂及配制 d m e m 粉剂( c a t ，n o 1 2 8 0 0 0 1 7 ，g i b c o ) k n o c k o u td m e m ( c a t n o 1 0 8 2 9 0 1 8 ，g i b c o ) k n o c k o u ts r( c a t n o 】0 8 2 8 0 2 8 ，g i b c o ) 胎牛血清( f b s )( 批号：0 4 1 2 2 0 ，杭州四季青) 新生牛血清( n c s )( 批号：0 5 0 9 2 8 ，杭州四季青) e s c u l t t mf e t a lb o v i n es e r u m ( c a t # 0 6 9 0 2 ，s t e m c e l l ) l g l u t a m i n e( c a t n o 2 5 0 3 0 0 81 ，g i b c o ) m e mn o n e s s e n t i a la m i n oa c i d ss o l u t i o n ( n a a s ) ( c a t n o 111 4 0 0 5 0 ， g i b c o ) p e n i c i l l i n s t r e p t o m y c i n ( c a t n o 1 5 1 4 0 1 2 2 ，g i b c o ) h u m a nf g f - b a s i c ( c a t # 1 0 0 1 8 b ，p e p r o t e c h ，i n c ) t r y p s i n - e d t a ( c a t n o 2 5 3 0 0 0 5 4 ，g i b c o ) 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ( p - m e ) ( s 3 1 1 7 3 3 9 ，m e r c k ) e d t a n a( 进口分装，美国a m r e s c o 公司) 鼠单克隆抗体s s e a 一1 ( s c - 2 1 7 0 2 ， s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y ) m i t o m y c i nc ( 进口分装，美国r o c h e 公司) 二甲基亚砜( d m s o ) ( d 5 8 7 9 ，s i g m a ) 孕马j f i l 清促性腺激素( p m s g ) ( 天津市华孚高新生物技术公司) 人绒毛膜促性腺激素( h c g )( 上海第一生化药业有限公司) 碱性磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，a k p ) 试剂盒( 上海太阳生物技术有 限公司) n s e( t b d 进口分装) n e s t i n( m a b 3 5 3 ，c h e m i c o n ) g f a p( m a b 3 6 0 ，c h e 仉c o n ) n u c l e a re x t r a c tk i t( 美国a c t i v e m o t i f 公司) 蛋白定量试剂盒( 美国b i o - r a d 公司) t r i s b a s e( 美国a m r e s c o 公司) 丙稀酰胺( 美国a m r e s c o 公司) 亚甲双丙稀酰胺( 美国a m r e s c o 公司) 十二烷基素硫酸钠( s d s )( 美国a m r e s c o 公司) 四已基已二胺( ! d )( 美国a m r e s c o 公司) 过硫酸钠( 美国a m r e s c o 公司) 甘氨酸( 美国s i g m a 公司) e c l 发光液 ( p r o d # 3 4 0 7 7 ，p i e r c e ) 兔抗i r t 3 c t( s c 371 ，s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y ) 鼠抗n f r d 3 n f kb n f kb p 6 5 ( s c 一8 0 0 8 ，s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y ) 羊抗兔i g g h r p ( z b ，2 3 0 1 ，s i g m a ) 羊抗鼠i g g h r p ( z b 2 3 0 5 ，s i g m a ) p m e f 培养基：d m e m + 1 0 f b s + 1 0 0 9 m lp e n i c i l l i n + 1 0 0 9 9 m l s t r e p t o m y c i n e s c s 培养基：k n o c k o u td m e m + 1 0 k n o c k o u ts r + 1 0 e s c u l t f b s + 10 n g m ll i f + 1 0 n g m l b f g f + o h n mn a a s + 2 m ml g l u t a m i n e + 0 1m md m e10 0 u m 1p e n i c i l l i n + 10 0 p g m ls t r e p t o m y c i n e b 培养基：k n o c k o u td m e m + 1 0 k n o c k o u ts r + 1 0 e s c u i t f b s + 10 n g m lb f g f + 0 1 m mn a a s + 2 m ml g l u t a m i n e + 1 0 0 u m lp e n i c i l l i n + 1 0 0 u g m ls t r e p t o m y c i n p m e f 冻存液：n c s 含1 0 d m s o e s c s 冻存液：5 0 f b s + 4 0 e s c s 培养基+ 1 0 d m s o 电泳液缓冲液：0 0 2 5 mt r i s ，0 1 9 2 m 甘氨酸，0 1 s d s 。 保存，每次溶液可重复使用3 - - 5 次。 转移缓冲液( p h 8 3 ) ：1 9 2 m m o l l 甘氨酸，2 5 m m o l l i r i s ， 级s d s ，2 0 甲醇 溶解后4 c 0 0 5 电泳 2 0 x t b s 缓冲液：1 mt r i s h c l ( p h 8 0 ) ，3 mn a c l ，用浓h c l 调至p h 7 4 常温保存。 t b s t 缓冲液：l t b s 含有0 0 1 ( v v ) 的吐温2 0 。 封闭液：含5 脱脂奶粉的t b s t 缓冲液。溶解后4 v 保存。使用时，恢 复室温，用量以盖过膜面即可。 1 0 过硫酸铵( a p ) ：l g a p 溶于1 0 m l 水。 1 0 s d s ：l gs d s 溶于1 0 m l 水。 5 s d s 上样缓冲液：1 mt r i s h c i ( p h 6 8 ) ，s d s l 0 9 ，b m e1 2 5 m l ， 甘油4 m l ，溴酚蓝2 5 m g ，加双蒸水定容为1 0 m l 。 混匀后，分装于1 0 m l e p 管中，4 。c 保存。 浓缩胶缓冲液( p h 6 8 ) ：6 0 6 9t r i s b a s e 溶解于4 0 m l 双蒸水中，用h c l 调p h 至6 8 ，定容为5 0 m l 。 分离胶缓冲液( p h 8 8 ) ：9 0 8 9t r i s b a s e 溶解于4 0 m l 双蒸水中，用h c l 调p h 至8 8 ，定容为5 0 m l 。 1 0 分离胶：双蒸水1 4 2 m l 、3 0 丙稀酰胺母液1 1 7 m l 、分离胶缓冲液 ( p h 8 8 ) 0 8 7 5 m i 、1 0 a p3 0 1 x l 、t e m e d1 9 p l 1 2 分离胶：双蒸水1 1 9 m l 、3 0 丙稀酰胺母液1 4 m l 、分离胶缓冲液 ( p h 8 8 ) 0 8 7 5 m l 、1 0 a p3 0 p l 、t e m e d2 0 儿l 4 浓缩胶：双蒸水1 4 3 m l 、3 0 丙稀酰胺母液o 4 1 6 m l 、浓缩胶缓冲液 ( p h 6 8 ) o 6 2 5 m i 、1 0 a p2 5 p l 、t e m e d 3 0 l l l 二、实验方法 ( 一) 原代小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层的制备 1 、实验动物的处理 小鼠饲养条件为每日光照1 2 h ，暗室1 2 h ，室温1 8 - 2 5 ，雌性小鼠在第 1 日下午1 8 ：0 0 用l m l 注射器腹腔注射p m s g ，每只1 0 i u ，4 8 h 后即第3 日 下午1 8 ：0 0 再次腹腔注射h c g ，每只1 0i u ，注射完后将雌性小鼠与雄性小 鼠按1 ：1 合笼，次日( 第4 日) 上午9 ：0 0 点前观察雌鼠有无阴道栓，发现阴 道栓的雌鼠做好标记，备用。 2 、原代小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养 取孕1 3 5 d 雌性小鼠，引颈法处死，无菌条件下分离并剪开子宫，剥离胎 鼠，去除胎鼠头部，四肢及内脏，得胎鼠躯干后洗涤数次至无肉眼可见血色。 将胎鼠躯干转至无菌小青瓶中( 每2 3 只放入一瓶) ，用无菌眼科剪剪成1 m m 3 大小的碎块，加入少量p b s ，连同碎块转移至5 0 m l 刻度离心管。静置5 r a i n 后吸去上清，加入胰蛋白酶消化液，大致一只胎鼠加入l m l 的量，培养箱中 孵育1 5 r a i n 。取出后吹打组织，使其尽量消化。组织块较为粘稠时停止消化。 加入2 0 m l 的p m e f 培养基终止胰酶消化，吹打混匀，静置待组织块都沉淀后 将上层液转入到另一5 0 m l 刻度离心管中。此步操作重复2 遍。1 5 0 0 转m i n 离心1 0 m i n ，去除上清，加入p m e f 培养基分装至t 2 5 培养瓶中，至3 7 。c ， 5 c 0 2 饱和湿度培养箱中培养。每日观察，待细胞长满瓶底，消化冻存于液 氮中备用。 3 、饲养层的制备 复苏冻存的p m e f 并培养至融合状态，弃去旧培养基，换上含1 0 p g m lm c 的p m e f 培养基，置培养箱中孵育2 5 h 。弃去培养基，用已预温的p b s 液洗 涤细胞5 次。消化细胞并制备成浓度至2 5 3 5 1 0 5 m l 的细胞悬液，将细胞接 种到新的四孔板中，每孔l m l 。至3 7 ，5 c 0 2 饱和湿度培养箱中培养过夜， 次日观察，若细胞密度过低，则重新补加处理过的细胞，以保证细胞连成一 片而无空隙。饲养层最好在制备后2 4 小时内使用，因此根据实验需要，包括 p m e f 复苏在内，一般在冲卵前4 5 d 或细胞消化前3 4 天开始准备。 ( 二) 小鼠胚胎干细胞的分离培养及鉴定 1 、小鼠囊胚的获取 取孕3 5 d 雌性小鼠，引颈法处死，无菌条件下打开腹腔，暴露双侧子宫， 分离子宫系膜并剪断子宫角和子宫颈，放置一无菌平皿中。用l m l 一次性注 射器吸取o 3 o 5 m l 已预温的冲卵液，从子宫一端小心插入子宫腔并快速推进， 胚胎会随冲卵液从另一端冲出，换另一端重复上述操作。将装有回收冲出液 的瓶皿在体视显微镜下镜检，收集囊胚期或桑椹期胚泡，在p b s 液滴中清洗 后转移至已事先制各好的饲养单层上，每孔放置一个囊胚。转移前先将饲养 层中p m e f 培养基换成已复温的e s c s 培养基。 2 、胚胎干细胞的分离 培养一天后，观察可发现囊胚突破透明带，4 8 h 左右可见囊胚贴壁生长。 此时发现滋养层细胞舒展开并贴附在培养板底部生长，i c m 则位于滋养层中 央向卜- 隆起生长。继续培养2 4 天后，在酒精灯火焰上拉长巴氏吸管制作毛 细吸管，一种内径稍大于i c m 直径，另一种稍小于i c m 直径。事先准备好数 个p b s 小液滴和消化液小液滴，用内径稍大的毛细吸管，体视显微镜下小心 挑起i c m 转入p b s 液滴中洗涤后，转入消化液中，至培养箱中孵育5 m i n 。 取管径稍小的毛细吸管，在液滴中轻轻反复吹吸内细胞团，使其分散成5 1 0 个细胞的小团块。将分散的内细胞小团块，连同消化液滴一同加入到新鲜制 备的饲养单层中，事先换成e s c s 培养基，继续培养观察。 3 、胚胎干细胞的传代培养 每日观察细胞，2 3 天后可发现e s c s 样小集落，4 6 天集落进一步增大 并可准备消化传代。根据集落多少选择不同的消化方法，如集落过少，则同 步骤2 采取液滴消化；集落数量较多时则采取全层消化法，弃去培养基，加 入己复温的p b s 洗涤2 遍，加入e s c s 消化液o 1 m l ，培养箱中孵育3 4 m i n 后，加入o 9 m le s c s 培养基终止消化。轻轻吹打，使其成为单细胞悬液，将 其l ：2 接种到新制备的饲养单层上继续传代培养。 4 、胚胎干细胞的生物学特性观察 ( 1 ) 冻存和复苏 同细胞传代培养方法全层消化e s c s ，培养基终止消化后5 0 0 9 离心5 m i n ， 弃上清，e s c s 冻存液重悬细胞，分装于无菌冻存管中，每支l m l 。置冻存盒 中8 0 冰箱，次日转入液氮保存。 常规方法复苏e s c s ，将液氮中取出的冻存管置3 7 水浴至完全融解，无 菌条件下将细胞悬液转入刻度离心管中，缓慢滴加培养基洗涤一遍后，重悬 细胞并取少量行苔盼蓝染色记数，其余细胞接种到预先制备的饲养层细胞上， 3 7 。c ，5 c 0 2 饱和湿度培养箱中培养，每日观察及换液。 ( 2 ) 碱性磷酸酶的检测 取干净无菌的细胞爬片置于4 孔板中，细胞消化时取适量细胞悬液加入 板孔中置3 7 。c ，5 c 0 2 饱和湿度培养箱中培养。2 3 天细胞贴壁并形成集落 后，取细胞爬片，按试剂盒说明书，用重氮偶联法对e s c s 进行a k p 染色。 胞浆中出现红棕色颗粒为阳性。 ( 3 ) s s e a 一1 的检测 同上步骤取含e s c s 样集落的细胞爬片，采用免疫细胞化学间接荧光法来 检测细胞特性，主要步骤如下： 滴加4 。c 多聚甲醛固定液固定细胞1 5 m i n ，吸去固定液，p b s 洗涤3 次，每次5 m i n 。 加入1 ：2 0 0 稀释的特异性一抗s s e a 一1 ，3 7 。c 湿盒孵育2 h 或4 | 。c 过夜。 吸去一。抗，p b s 洗涤3 次，每次5 m i n 。凉干，滴加1 ：2 0 0 稀释的异 硫氰酸荧光素( f i t c ) 标记的兔抗鼠i g g ，3 7 。c 湿盒孵育1 h 。 吸去二抗，p b s 洗涤3 次，每次5 m i n 。凉干液体后5 0 缓冲甘油封片， 荧光显微镜下观察并照相。 结果判定：胞膜呈绿色荧光的细胞为阳性细胞。 ( 4 ) e s c s 体外多分化潜能的观察 从培养皿中吸出培养基并用p b s 液冲洗，弃p b s 加适量消化液，快速将 培养皿置于显微镜下观察细胞同时拍击培养皿以使e s c s 集落游离。观察到许 多的细胞集落在游动且饲养层仍粘附在培养皿中时，加入e s c s 培养基并终止 消化并吸出集落悬液，离心后加入e s c s 培养基重悬并置于无p m e f 饲养层的 培养皿中培养并孵育过夜。次日可见培养皿底部已形成许多集落，重复上述 步骤，最后用不含l i f 和b m e 的e b 培养基重悬细胞。这种悬浮培养使得细 胞形成细胞聚集称为拟胚体( e m b r y o n i cb o d i e s ，e b ) 。一般培养3 天即形成 简单e b ，5 - 8 天后形成成熟e b 。每1 2 天换液一次。将成熟e b 接种到的塑 料培养皿中，e b 培养基培养，每天观察细胞分化形态并隔天换液。 ( 5 ) e s c s 向神经细胞定向分化潜能的观察 同上述方法形成e b ，培养4 天后，换上含5 1 07 的维甲酸( r e t i n o i ca c i d ， r a ) e b 培养基，每l 2 天换液。r a 处理4 天后，重新换上不含r a 的e b 培养基并接种到塑料培养皿中培养，每天观察细胞分化形态并隔天换液。采 用免疫细胞化学间接荧光法来检测诱导后细胞n s e ，n e s t i n 和g f a p 表达。 ( 三) n f 。k b 信号系统的活化状态 分别提取增殖分化不同阶段的e s c s ，包括生长期的e s c s 、培养4 天的 e b 、培养8 天e b 和已发生自然分化的e s c s ，提取胞浆及胞核蛋白，进行免 疫印迹检o h , 4 ： 1 、细胞蛋白的提取 参照试剂盒说明书，用预冷的含磷酸酶抑制剂的p b s 液冲洗一遍细胞后， 加入少量的此含磷酸酶抑制剂的p b s 液并刮下细胞，4 。c 离心机5 0 0 9 离心 5 r a i n 收集细胞沉淀并冰上保存。加入低渗液破除细胞膜，加入去垢剂并4 。c 1 4 0 0 0 9 离心3 0 s 收集上清并分装，此即胞浆蛋白提取物。在沉淀中加入核裂 解液，低温振荡并4 。c1 4 0 0 0 9 离心1 0 m i n 收集上清，此上清即胞核蛋白提取 物。两种提取物各取少量按照蛋白定量试剂盒说明测定蛋白含量，其余分装 - 8 0 保存备用。 2 、s d s p a g e 蛋白电泳 取待测蛋白加入等量2 上样缓冲液后，沸水浴3 m i n ，备用。分别取3 0 1 x g 蛋白以1 2 分离胶行胞浆蛋白电泳，1 0 分离胶用于胞核蛋白电泳，分别以 l p s 激活的r a w 2 6 4 7 细胞胞浆胞核提取物为阳性对照，浓缩胶以8 0 v 电压 电泳l h ，以电压1 2 0 v 行分离胶电泳2 h 。电泳结束后考马斯亮蓝染色，脱色 并观察电泳结果，照相。 3 、免疫印迹 取与凝胶等大的硝酸纤维膜和滤纸，浸泡于转移缓冲液中1 0 m i n 。自负极 到正极，依次放置滤纸、凝胶( 剪掉浓缩胶) 、硝酸纤维膜和滤纸，转移缓 冲液中1 0 0 m a 电流转移2 h 。室温封闭1 h ，分别加入1 ：2 0 0 稀释的一抗( 胞 浆蛋白为兔抗b d 3 a ，胞核蛋白为鼠抗n f k b p 6 5 ) ，4 。c 冰箱过夜。次日取出 置于室温l h ，1 t b s t 洗涤膜3 次，每次1 0 m i n 。加入1 ：2 0 0 0 稀释的二抗( 胞 浆蛋白为羊抗兔i g g h r p ，胞核蛋白为羊抗鼠i g g h r p ) ，室温孵育1 h 。 1 t b s t 洗涤膜3 次，每次1 0 m i n 。待曝光显