（农业昆虫与害虫防治专业论文）棉铃虫中肠Cry1A结合蛋白分离、鉴定及其与抗性的关系.pdf

摘要 转基因棉花的大规模种植对控制棉花害虫的危害发挥了重要作用，但害虫长期处于转基因作 物b t 毒蛋白的高压选择下，害虫对b t 作物抗性问题将不容忽视。昆虫对b t 毒素的抗性机制是复 杂和多样的，但中肠结合位点的改变是最主要的一种机制。棉铃虫中已知的受体有氨肽酶n 和钙 粘蛋白。保存在本实验室的高抗c r y l a 蛋白的棉铃虫品系经前人研究未发现该品系存在钙粘蛋白 基因的缺失、失活，比较抗、感品系棉铃虫的钙粘蛋白、a p n 序列，只发现少量氨基酸的变异， 因此该棉铃虫品系对c r y l a 产生抗性很可能与受体蛋白表达水平变化相关或存在其它的受体蛋 白。 本文首先比较了西种双向电泳系统以及几种b b m v 提取方法对双向电泳的影响，建立了棉 铃虫中肠b t 结合蛋白蛋白质组学的研究方法，利用蛋白质组学的方法分离和分析了棉铃虫中肠 c r y l a 毒素的结合蛋白，比较了抗、感品系棉铃虫中c r y l a c 结合蛋白的变化，探讨该棉铃虫品 系对b t 毒蛋白产生抗性的可能机制。并比较了抗、感品系棉铃虫中与不同b t 毒蛋白作用的结合 蛋白的差异。在国内首次开展了利用蛋白质组学研究棉铃虫的中肠b t 结合蛋白及其与抗性的关 系。主要结果如下： 1 、方法的建立：比较i s o d a l t 和i p g d a l t 两种双向电泳系统，发现这两种系统都可以 用于棉铃虫c r y l a c 结合蛋白的分离，i s o d a l t 对结合蛋白的分离效果虽比i p g d a l t 更好， 尤其对高分子量蛋白的分离明显优于i p g d a l t 法，但由于上样量少，因此对后续的质谱分析非 常不利；i p g d a l t 虽较昂贵但有利于进行后续试验，因此本文选用i p g d a l t 系统进行双向电 泳。比较已报道的这三种b b m v 提取方法：w o l f e r s b e r g e r 法、e n g l i s h r e a d d y 法、a b d u l r a u f 法， 结果显示这三种方法对分离c r y l a c 结合蛋白的种类没有影响，但这三种方法获得的蛋白量不一 样结果。总结三种方法的优点，建立了一种新的综合b b m v 提取方法，获得了高量的蛋白，通 过双向电泳和结合试验证明该方法适合双向电泳c r y l a 结合蛋白研究。 2 、利用双向电泳结合w e s t e r n 杂交以及生物质谱的方法，研究了棉铃虫中肠c r y l a c 结合蛋 白，首次鉴定得到棉铃虫中肠四种新的c r y l a c 结合蛋白：v - a t p a s e 亚基b 、热激蛋白、肌动蛋 白以及一种未知的新蛋白。肌动蛋白和v - a t p a s e 亚基a 已报道为烟芽夜蛾中c r y l a c 结合蛋白， 热激蛋白和未知新蛋白为首次报道的昆虫中肠c r y l a c 结合蛋白。 3 、用蛋白质组学的方法比较了抗、感棉铃虫中肠结合蛋白的数量和表达量，结果发现结合 蛋白种类无差异，但其中一种新的结合蛋白在抗性品系中表达量至少下降了6 4 9 倍。前人的研究 说明，碘标记结合试验证明结合位点或受体数目减少是该抗性品系对c r y l a 毒蛋白产生抗性的主 要原因。结合前人研究和本文结果，本文新结合蛋白表达量严重降低可能是该抗性品系产生抗性 的原因之一。 4 、初步比较c r y l a c 、c r y l a b 和c r y l a h 作用于敏感品系和抗性品系的结合蛋白。结果发现 无论是抗性品系和敏感品系c r y l a b 的结合都是最少的，在敏感品系中，c r y l a b 未结合肌动蛋白 和v - a t p a s e ，而c r y l a c 和c r y l a h 对肌动蛋白和v - a t p a s e 结合强，说明新蛋白和热激蛋白对毒 素的作用过程来说可能是必需的，肌动蛋白和v - a t p a s e 可能与毒力相关。前人研究c r y l a b 和 c r y l a h 对c r y l a c 毒蛋白抗性品系存在一定的交互抗性，各个b t 蛋白在c r y l a c 抗性品系和敏感 品系中结合蛋白的差异还是存在于新蛋白的表达量上，新蛋白表达量下降可能与交互抗性产生有 关，也可能存在其他的原因。 关键词棉铃虫，b t ，结合蛋白，蛋白质组学，抗性 a b s t r a c t t h ew i d es p r e a dp l a n to f b tc o t t o nh a sp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nc o t t o np e s tc o n t r o l ，p e s t sa r e s e l e c t e du n d e rt h ep r e s s u r eo fh i g h d o s eb tt o x i np r o d u c e db yb tc o t t o nf o ral o n gt i m e ，t h e r e f o r et h e r e s i s t a n c ee v o l u t i o no fp e s tt ob tc o t t o ns h o u l dn o tb ei g n o r e d t h er e s i s t a n c em e c h a n i a mo f b tt o x i nt o i n s e c t si sc o m p l e xa n dv a r i a b l e ，b u tt h ec h a n g eo ft h eb i n d i n gp r o t e i n si nt h em i d g u ti st h em a i no n e t h ek n o w nr e c e p t o r si nc o t t o nb o l l w o r m ( h e l i c o v e r p aa r m i g e r a ( h 让b n e 0 ，c b w ) a r ea m i n o o p e p t i d a s e n ( a p n ) a n dc a d h e r i n l i k ep r o t e i n s a c c o r d i n gt ot h et e s tr e s u l t so fp r e d e c e s s o r s ，n od i s r u p t i o na n d i n a c t i v a t i o no fc a d h e r i ng e n eb u to n l yaf e wc h a n g eo fa m i n oa c i d sh a db e e nf o u n di na p na n d c a d h e r i n l i k ep r o t e i n so ft h e c r y l a c - r e s i s t a n tc b ws t r a i np r e s e r v i n gi n t h i sl a b ，p r o b a b l yi t s c r y la c - r e s i s t a n tr e l a t e st ot h ec h a n g eo fe x p r e s s i o n a ll e v e lo fr e c e p t o rp r o t e i no rt h e r em a yh a v es o m e o t h e rr e l a t e dr e c e p t o r sp r o t e i n s 。 f i r s t l yw ec o m p a r e dt w os y s t e m so ft w o - d i m e n s i o ne l e c t r o p h r e s i s ( 2 - d e ) a n dt h r e ep r e p a r e d m e t h o d so fb b m v , t h e nb u i l dt h ep r o t e o m i ca n a l y s i sa p p r o a c hf o rc b w m i d g u tp r o t e i n s s e c o n d l yw e s e p a r a t e da n di d e n t i f i e dc r y la cb i n d i n gp r o t e i ni nc b wm i d g u tb yu s i n gp r o t e o m i ea p p r o a c h t h i r d l y t h eb i n d i n gp r o t e i n si ns u s c e p t i b l ea n dr e s i s t a n ts t r a i no fc b ww e r ec o m p a r e d ，s oa st of m dt h ep o s s i b l e r e s i s t a n tm e c h a n i s mo fb tt o x i n a n df i n a l l yt h eb i n d i n gp r o t e i n so fd i f f e r e n tb ti ns u s c e p t i b l ea n d r e s i s t a n tc b ws t r a i n sw e r ea l s oc o m p a r e d t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 m e t h o d s ：t h ei s o d a l ta n di p g - d a l t2 - d es y s t e mw e r ec o m p a r e d ，r e s u l t ss h o w e dt h a t t h e s et w os y s t e mc o u l db eu s e dt os e p a r a t et h ec r y la cb i n d i n gp r o t e i n s ，t h o u g ht h es e p a r a t i o nr e s u l t s o fi s o d a l tw e r eb e t t e rt h a ni p g d 玉，e s p e c i a l l yf o rt h el a r g e rp r o t e i ns e p a r a t i o n b e c a u s eo ft h e l i m i tp r o t e i nl o a d i n gq u a n t i t y , t h i ss y s t e mw a sa d v e r s ef o rt h em a s ss p e c t r u m t h ei p g - d a l tw a sm o r e e x p e n s i v e ，b u ti tw a sg o o df o rt h ef o l l o w i n gm a s ss p e c t r u mw o r k ，s ow ec h o s ei p g d a l tf o r2 - d e t h et h r e ed i f f e r e n tb b m vp r e p a r a t i o np r o t o c o l s ( e 心a r ea n dw ) d i dn o ta f f e c tt h en u m b e ro rt y p e s o fc b wc r y la cb i n d i n gp r o t e i n sd e t e c t e d ，h o w e v e r , d i f f e r e n tm e t h o d sy i e l d e dd i f f e r e n tp r o t e i n q u a n t i t i e s w ec o n s o l i d a t e dab b m vi s o l a t i o np r o t o c o la c c o r d i n gt oa d v a n t a g eo ft h e s er e p o r t e d p r o t o c o l s ，t h i sp r o t o c o lc o u l dg e th i g hp r o t e i nq u a n t i t i e sa n da l s os u i t a b l ef o r2 - d e 2 b a c i l l u st h u r i n g i e n s i sc r y la cb i n d i n gp r o t e i n si nc b wb b m vw e r ei n v e s t i g a t e d u s i n g p r o t e o m i ca n a l y s i s ，w ei d e n t i f i e df o u ro t h e rc r y l a cb i n d i n gp r o t e i n si nc b wb b m vf o r t h ef i r s tt i m e ： v a c u o l a ra t ps y n t h a s es u b u n i tb ，a c t i n ，ah e a ts h o c kc o g n a t ep r o t e i n ( h s p ) a n dan o v e lp r o t e i n a c t i n a n dv a c u o l a ra t ps y n t h a s es u b u n i tah a db e e nr e p o r t e da sc r y la cb i n d i n gp r o t e i n si nh e l i o t h i s v i r e s c e n s h e a ts h o c kc o g n a t ea n dt h i sn o v e lp r o t e i nw a st h ef i r s tr e p o r ta sc y la cb i n d i n gp r o t e i ni n i n s e c t 3 t h et y p e sa n de x p r e s s i o nq u a n t i t i e so fc r y l a cb i n d i n gp r o t e i n so fs u s c e p t i b l e a n d r e s i s t a n t c b ww e r ec o m p a r e d ，i ts h o w e dt h a tt h et y p e so fb i n d i n gp r o t e i n sw e r et h es a l t l eb e t w e e n s u s c e p t i b l e a n dr e s i s t a n t - s t r a i n ，b u tt h en o v e lp r o t e i ni nt h er e s i s t a n t s t r a i nw e r e6 4 9 一f o l dl o w e r e x p r e s s i o nt h a nt h es u s c e p t i b l e - s t r a i n s t u d i e sb e f o r es a i dt h a tl e s sb i n d i n go f b ti nt h em i d g u to rl e s s n u m b e ro fr e c e p t o r sw e r et h em a mr e s i s t a n tm e c h a n i s mf o rt h i sr e s i s t a n ts t r a i n c o m b i n e ds t u d i e s b e f o r ea n dt h i sp a p e r m u c hl o w e re x p r e s s i o no ft h en o v e lp r o t e i nm i g h tb eo n eo ft h er e s i s t a n tr e a s o n s 4 b i n d i n gp r o t e i n so fc r y l a h ，c r y i a ba n dc r y l a ci ns u s c e p t i b l e - a n dr e s i s t a n t - c b ww e r e c o m p a r e d ，t h eb i n d i n go fc r y l a bt ob i n d i n gp r o t e i n sw a sw e a kt h a nt h eo t h e rt w ot o x i n sw h e t h e ri n s u s c e p t i b l e - o rr e s i s t a n t s t r a i n i ns u s c e p t i b l e - s t r a i n ，c r y l a bb o u n dt on o v e lp r o t e i na n dh s p , d i dn o t b i n dt oa c t i na n dv - a t p a s e ，b u tc r y la ca n dc r y la hb o u n dt ot h e s ef o u rb i n d i n gp r o t e i n s ，m a y b en o v e l p r o t e i na n dh s pa r ee s s e n t i a lf o rt h et o x i na c t i o n ，a c t i na n dv - a t p a s em a yb er e l a t e dt ot o x i c i t y p r e d e c e s s o r sr e s u l t ss h o w e dt h a tc y l a ba n dc r y l a hh a v ec r o s sr e s i s t a n c et oc r y l a c - r e s i s t a n tc b w , t h ed i f f e r e n c eo fd i f f e r e n tb tb i n d i n gp r o t e i n sb e t w e e ns u s c e p t i b l e - a n dr e s i s t a n t c b ww e r el o w e r e x p r e s s i o no fn o v e lp r o t e i n ，m a y b et h i sw a sr e a s o nf o rc r o s sr e s i s t a n c eo ro t h e rr e a s o n sn e e df u r t h e r s t u d y k e y w o r d s ：h e l i c o v e r p aa r m i g e r a ，b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b i n d i n gp r o t e i n ，p r o t e o m i c s ，r e s i s t a n c e i v 独创性l 声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 声杏扫l 皱 时间：劲g 年6 月7日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农 业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用 不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名： 西白l 匆多 时间：硒8 年石月7日 导师签名： 郡争礼 时间：硝年易, p j 罗e 1 裂筝捕 中国农业科学院博十学位论文第一章绪论 第一章绪论 1 1 棉铃虫及昆虫对b t 抗性现状 棉铃虫h e l i c o v e r p aa r m i g e r a ( h t i b n e r ) 属鳞翅目夜蛾科实夜蛾属，是一种世界性分布的重要农 业害虫，多食性。上世纪棉铃虫危害棉花造成了巨大的经济损失( 郭予元，1 9 9 8 ) ，当时棉铃虫的 防治还主要依赖化学药剂，对环境和人畜造成了严重的危害，以及产生了严重的抗药性问题( w u a n dg u o 。2 0 0 5 ) 。随着1 9 9 6 年转基因棉花商业化种植以来，这种局面得到了缓解，同时棉铃虫的 危害也得到了很好的控制。 表j 太_ _ b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ( b t ) c r y l a c 杀虫蛋白的第一代转基因棉花自1 9 9 6 商业化以来，就在 许多国家广泛种植( r o m e i se ta 1 ，2 0 0 6 ) ，我国1 9 9 7 年由河北省开始引种美国b t c r y l a c 抗虫棉，1 9 9 9 年国产抗虫棉开始商业化种植。2 0 0 1 年以前b t 棉花主要种植于黄河流域棉区，种植面积约5 0 万公 顷，至u 2 0 0 6 年已广泛种植于各个棉区，面积达4 0 0 万公顷，占全国棉花种植面积的7 0 ( 吴孔明， 2 0 0 7 ) 。 。 虽然b t 作物的种植时间已经超过了常规神经毒剂农药首次报导到田间产生抗性的时间( b a t e s e t a l ，2 0 0 5 ) ，但许多昆虫在室内已经对b t 毒蛋白产生不同程度的抗性，田问也有抗性报道，而且 由于害虫长期处于转基因作物b t 毒蛋白的高压选择下，所以害虫对b t 作物抗性问题将不容忽视。 1 1 1 昆虫对b t 杀虫剂田间抗性 两种重要的农业昆虫小菜蛾纠“t e l l a x y l o s t e l l a 和粉纹夜蛾t r i c h o p l u s i an i 在田间和商业化的大 棚中对b t 杀虫剂产生了抗药性。 1 ) 小菜蛾px y l o s t e l l a 。t a b a s h n i k 等1 9 9 0 年首次报导小菜蛾在田间对b t 制剂产生抗性，这是 害虫在田间对b t $ f j 齐u 产生抗性的第例报导，通过对采于喷洒商业化b t 杀虫剂地区的田间小菜蛾 种群室内生物测定，结果其l c 5 0 和l c 9 5 比室内敏感品系分别高2 5 至1 j 3 0 倍，田间抗性种群对b t 田 间用量死亡率为3 4 3 5 ，该用量对室内敏感品系的死亡率为1 0 0 。1 9 9 3 年，s h e l t o n 等对1 9 9 0 年采于美国六个洲和印尼的1 1 个小菜蛾品系用两种b t $ l j j = f u 进行生物测定，结果发现，连续七年使 用b t 杀虫剂频繁的佛罗里达地区的l c 5 0 最高，1 9 9 2 年又对佛罗里达不同地区进行b t 杀虫剂对小菜 蛾的田间和室内生物测定试验，结果b t 杀虫剂对小菜蛾的防治失败，小菜蛾对b t 制剂产生抗性 ( s h e l t o ne ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 2 ) 粉纹夜蛾7 = n i 。2 0 0 3 年，j a n m a a t 等报导了在加拿大不列颠哥伦比亚商业化大棚里粉纹夜 蛾对b t $ 1 j 齐u d i p e l 和a b b o u 产生了快速的抗性，达16 0 倍，当杀虫剂的选择压停止后，这种抗性又 会快速的消失。 1 1 2 昆虫对b t 室内抗性 已有许多报导室内经b t 杀虫剂、毒蛋白或转基因作物筛选的许多昆虫对b t 产生了抗性。 第一例报导的对b t 产生抗性的昆虫是印度谷瓤d i ai n t e r p u n c t e l l a ，用d i p e l ( 二种商业化的 b t 制剂) 经室内筛选1 5 代后，产生了1 0 0 倍的抗性，筛选3 6 代后抗性达至u 2 5 0 倍，但该抗性品系对 中国农业科学院博士学位论文第一荦绪论 c r y l a 类以； b b t 毒蛋白敏感( m c g a u g h e y , 1 9 8 5 ；m c g a u g h e y e t a l ，1 9 8 7 ；1 9 8 8 ) ，对c r y l a b 有8 0 0 多 倍的抗性，对c r y l c a 敏感性却增加四倍( v a nr i ee ta 1 ，1 9 9 0 ) 。用d i p e l 筛选的对c r y l a b 有2 0 0 多 倍抗性的品系，对c r y l c a 的敏感性却没有增加( h e r r e r oe ta 1 ，2 0 0 1 ；m c g a u g h e yc ta 1 ，1 9 9 2 ；1 9 9 4 ) 。 此外，m c g a u g h e y 等还筛选了印度谷螟对b ts u b s p e n t o m o c i d u s 陋r e ) 和b ts u b s p a i z a w a i ( b t a ) 的抗性 品系，尽管这两种b t 中都含有对印度谷螟高毒性的c r y l c a ，但这两个抗性品系对c r y l c a 的抗性却 很低，两种b t 含有c r y l a b 不含c r y l a c ，但两种抗性品系对c r y l a c 的抗性水平却高= j ：c r y l a b ( m c g a u g h e ya n dj o h n s o n ，19 9 2 ；19 9 4 ) 。 小菜妣x y l o s t e l l a 是被首例报导的在田间对b t 制剂产生抗性，抗性倍数达3 0 多倍，t a b a s h n i k 等( 1 9 9 0 ，1 9 9 1 。1 9 9 3 ) 从田间采集抗性的小菜蛾在室内继续用d i p e l 继续筛选，抗性增长到1 0 0 0 多倍，这个抗性品系对c r y l a a 、c r y l a b 、c r y l a c 、c r y l f a 和c r y l j a 表现出高水平抗性，对c r y l b a 、 c r y l b b 、c r y l c a 、c r y l d a 、c r y l l a 和c r y 2 a a 抗性不显著( t a b a s h n i k e ta 1 ，1 9 9 3 ；1 9 9 4 a ；1 9 9 6 ) 。 f e nd 等( 1 9 9 1 ) 对菲律宾的田间抗性种群用d i p e l 进行连续筛选，产生了抗性倍数达2 0 0 多倍 的抗性品系，该品系对c r y i b a 和c r y l c a 没有交互抗性。t a n g 等报导从美国佛罗里达田间采集的小 j 察蛾抗性品系，经b t 制剂j a v e l i n 室内两代筛选后抗性倍数达至u 1 5 0 0 倍，但如果停止筛选，抗性将 下降至1 3 0 0 倍，而且在后来几代都会维持在这个水平，该抗性小菜蛾对c r y l a a 、c r y l a b 和c r y l a c 保持2 0 0 多倍的抗性，但对c r y l b a 、c r y l c a 、c r y l d a 和c r y 9 c a 完全敏感( t a n ge ta 1 ，1 9 9 6 ；l a m b e r t e ta 1 1 9 9 6 ) 。z h a o 等( 2 0 0 0 ) 从美国南卡罗莱纳州田间采集到抗c r y l c a 的小菜蛾品系，室内先使 用原毒素c r y l c a 筛选，后来使用表达c r y l c a 的转基因花椰菜，结果抗性倍数增加到1 2 4 0 0 倍。 g o u l d 等( 1 9 9 5 ) 用c r y l a c 原毒素室内筛选烟芽夜蛾肌o t h sh r e s c e n s ，获得高达1 0 0 0 0 多倍 的抗性品系，该品系与c 巧l a b 和c r y l f a 有高度的交互抗性，与c r y 2 a a 有中度交互抗性，与c r y l c a 和c r y l b a 没有交互抗性。酆 c r y l a c 继续筛选该抗性烟芽夜蛾，得到了抗性倍数达至u 7 3 0 0 0 多倍 的抗性品系( y h d 2 一b ) ，y h d 2 一b 界j c r y l a 和c r y l f a 仍然有交互抗性( j u r a t - f u e n t e se ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 m o a r 等( 1 9 9 5 ) 用c r y l c a 连续筛选多代甜菜夜蛾s p o d o p t e r ae x i g u a 后产生了对c r y l c a 有8 5 0 倍抗性的抗性品系，该品系对c r y l a b 、c r y 2 a a 和c r y 9 c a 有不同程度的交互抗性。m f i l l e r - c o h n 等 ( 1 9 9 6 ) 用表达c r y l c a 毒素的工程菌筛选灰翅夜蛾s p o d o p t e r al i t t o r a l i s 幼虫，其对c r y l c a 达到了 5 0 0 多倍的抗性，对c r y l a b 、c r y l d a 和c r y l e a 有不同程度的交互抗性，对c r y l f a 无交互抗性。 用b t 制剂筛选欧洲玉米螟o s t r i n i an u b i l a l i s ，3 代后对d i p e l 的敏感性下降t 3 6 倍，继续筛选4 代，抗性倍数达至t y 7 3 倍，用c r y l a c 筛选其他的欧洲玉米螟品系，8 代后抗性达到最高峰1 6 0 倍， 继续筛选抗性下降( h u a n g e ta 1 ，1 9 9 7 ；b o l i ne ta 1 ，1 9 9 9 ) t a b a s h n i k 等( 2 0 0 0 ) j 稠c r y l a c 原毒素筛选f f f _ d _ r 扛p e c t i n o p h o r ag o s s y i e l l a 产生t 3 0 0 多倍抗性， 该品系与c r y l a b 和c r y l a a 原毒素有高度的交互抗性，与c r y l b b 仅有低水平的交互抗性，与 c r y l c a 、c r y l d a 、c r y l f a 、c r y l j a 、c r y l a a 和c r y 9 c a 原毒素无交互抗性。 事实上目前还没有蚊子在田问或实验室对b t 产生抗性的报导，一些研究表明c y t l a 在延缓蚊 子对b t 产生抗性中起了很大作用，c y t l a 的存在阻止了库蚊对c r y 4 c r y l l 毒素产生抗性( w i r t he ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。 1 9 9 5 年g a h a r d j a 等从喷洒b 伟0 剂( 含c r y 3 a a ) 的田间采集马铃薯甲虬e p t i n o t a r s a d e c e m l i n e a t a ，在室内继续用含c r y 3 a 的b t 制剂进行筛选，2 9 代后产生t 2 9 3 倍的抗性( w h a l o ne ta 1 ， 1 9 9 3 ；r a h a r d j ae ta 1 1 9 9 5 ) 。b a u e r 等( 1 9 9 5 ) 以c r y 3 a a 筛选另一种鞘翅目昆虫棉白杨叶甲 2 中国农业科学院博十学位论文 第一章绪论 c h r y s o m e l as c r i p t a ，产生了高水平抗性，该品系对c r y l b a 有4 0 0 倍的交互抗性，对c r y l a a 无交互抗 性( f e d e r i c ie t a l ，1 9 9 8 ；b a u e r e t a l ，1 9 9 5 ) 。 用b t 对棉铃虫ha r m i g e r a 进行室内筛选国内外均有不少报导。梁革梅等( 2 0 0 0 ) 用b t 杀虫剂、 b t 毒蛋白和转b t 基因棉进行室内筛选棉铃虫的抗性种群，经l6 代筛选，棉铃虫对3 种b t 都可 以产生抗性，抗性上升的快慢顺序是：b t 杀虫剂 b t 毒蛋白 转b t 基因棉，但目前棉铃虫对b t 毒蛋白的抗性达3 0 0 0 多倍，对b t 杀虫剂抗性为2 0 0 0 多倍( l i a n ge ta 1 ，2 0 0 8 ) 。x u 等( 2 0 0 5 ) 从田间 采集棉铃虫品系，室内用c r y l a c f 圣2 8 代筛选后抗性倍数达5 6 4 倍，该品系与c r y l a a 和c r y l a b 有一 定的交互抗性，与c y 2 a a 无交互抗性。a k h u r s t 等( 2 0 0 3 ) 将田间采集的棉铃虫品系与室内敏感品 系杂交，再用c w i a c 原毒素进行筛选，第1 6 代时出现抗性，2 l 代时抗性达到顶峰3 0 0 倍，随后抗 性水平下降，在5 7 1 1 1 倍之间徘徊，该品系对含多种毒素的b t g l j 剂d i p e l 和x e n t a r i 敏感，对只含 c r y l a c m p v $ 1 j 剂有抗性。m e n g 等( 2 0 0 3 ) 用表达c r y l a c 的转基因棉花筛选棉铃虫，1 2 代后产生 了抗性，4 2 代以后对c r y l a c 原毒素、2 1 0 9 k g 的m v pi i 可湿性粉剂和2 0 0 9 l 的m v pi i 液体制剂均 产生高抗性，分别为1 6 8 0 、1 7 8 0 和1 2 0 0 倍。m a h o n 等( 2 0 0 7 ) 发现一个澳大利亚棉铃虫品系对c r y 2 a b 产生高抗性，在第二代转基因棉花种植以前从田间采集的棉铃虫发现存在对c r y 2 a b 产生抗性的个 体，在室内经过特殊的回交和生测，建立了单基因常染色体遗传的抗性品系，抗性为隐性遗传， 纯合子对c r y 2 a b 有高度抗性，用可能的最大浓度的毒素也不能导致一定的死亡率。 1 i 3 昆虫对b t 作物田问抗性 2 0 0 8 年t a b a s h n i k 等分析了澳大利亚、中国、西班牙和美国的近十几年的六种昆虫( 棉铃虫h a r m i g e r a , 美洲棉铃虬l e l i c o v e r p az e a , 烟芽夜蛾hv i r e s c e n s , 玉米螟d n u b i l a l i s , 红铃虫p g o s s y p i e l l a 和西非蛀茎夜蛾s e s a m i an o n a g r i o i d e s ) 对b t 作物的田间抗性监测数据，结果显示美洲棉 铃虫ha r m i g e r a 的一些田间种群的抗性基因频率增加了很多，其他五种昆虫没有增加。2 0 0 3 和 2 0 0 4 年在美国阿肯色州和密西西比州，六个美洲棉铃虫田间种群对c r y l a c 的抗性倍数高于5 0 倍， 其中四个高于1 0 0 倍，两个高于5 0 0 倍。2 0 0 5 和2 0 0 6 年阿肯色州，另外七个田间种群对c r y l a c 的抗 性倍数大于1 0 0 倍，其中两个品系抗性大于1 0 0 0 倍。然而在b t 棉花未商业化之前的1 9 9 2 年和1 9 9 3 年，美洲棉铃虫对c r y l a c 没有抗性。虽然美洲棉铃虫田间种群对b t 棉花产生了抗性，但并没有导 致b t 棉花种植的失败，因为其他策略用于治理该害虫。美洲棉铃虫的田间抗性结果与依赖避难所 策略下的理论模型数据一致，表明避难所策略有助于延缓抗性。 1 2b t 毒蛋白及其作用机制 i 2 ib t 简介 苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b t ) 属革兰氏阳性细菌，能产生多种类型的伴孢晶体蛋 白，即6 一内毒素或杀虫晶体蛋白( i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n ，i c p s ) ，对鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 、双翅 目( di p t e r a ) 、鞘翅目( c o l e o p t e r a ) 、膜翅目( h y m e n o p t e r a ) 、同翅目( h o m o p t e m ) 、直翅目( o r t h o p t e r a ) 、 食毛目( ma u o p h a g a ) 等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等具有特异性的杀虫活性( s c h n e p f e t a 1 ，1 9 9 8 ；黄大防和林敏，2 0 0 1 ) 。 3 十目女n 科￥* 学位论文 * 一章镕t 1 9 8 9 年h o f t e 等根据从克隆基因推导的杀虫蛋白质氩基酸序列的相似性，e 【】蛋白的杀虫活性， 将杀虫基州分成数个类型统称为c r y 基田，川罗马数字i 、i i 、i i i 、i v 等米命名这些数字分别 代表儿种杀虫范围( 如1 类对鳞翅目昆虫有高毒性，i i 代表了埘鳞翅口和双翅日昆虫的毒性，i i i 对鞘翅目昆虫高毒，i v 对取翅目昆虫冉毒性v 类对鳞翅目和鞘翅日都有毒性) 。在每一类型f 根据氪基酸序列的同源性，x 分为a 。b ，c 等不同的基因型。在同基闻型f 根据限制性山切 酶的酶普和分子量的太小，又分为a ，b c 等不同的基因型。另外还有一共基因编码的蛋白对 许多细胞自_ 溶解作用，称为溶泡基风( 简称c y t ) 此型蚩白仅j f 烈翅目幼虫有毒性。 22b t 毒蛋白作用机制 发展高效的害虫抗性管理措施需要对抗性机制育十分彻底的了解而理解害虫抗性机制又需 要对b i 的作用模式有全新的认识。 经典的b i 毒蛋白的作用机制包括晶体在昆虫中肠内的溶解，在中肠蛋白酶的作用r 毒素前 体水解为有活性的毒素，有活性的c r y 毒索结合到中肠上的特异性受体上毒素姬基低聚形成孔 洞结构井插八到顶膜上，这些孔洞允许离子和水分自由出入细胞，导致造成离子通道或孔洞，导 致膨胀和裂解，以及最后昆虫# e i ：s ( s c h n e p f c ta l ，1 9 9 8 ；k n o w l e se ta l ，1 9 8 7 ) 。随着人们认识的深入， 又提出了另外一种假设认为c r y 的毒性与毒素的低聚化无关( z h a n ge ta l ，2 0 0 5 ；2 0 0 6 ) 。目前 对b t 毒素的作用机制己形成了三种模型，详细介绍如下。 b i a v 0 模型。b r a v o 模型是k n o w l e s 和e l l ( 1 9 8 7 ) 胶体渗透裂解模型的进一步升华。该模 型认为钙耕蛋白和a p n 在烟草天蛾m a n d u c a 弛椭中对所有的c r y l a 作用来说都是必需的( b r a v o e i a ti2 0 0 4 ) ，受体的结合是连续的顺序进行的( 幽1 1 ) ：话化的毒索首先与钙粘蛋白b t r i 结 台，然后与a p n 结合，毒索与b t r ，结舍后，在膜结合的蛋白酶的作用下构象发生了变化使 a 螺旋更窑易分离这时毒秉聚集起米形成一个四聚体的预穿孔结构，田为亲和力的芙系，该结 构优先与g p i 锚定的受体a l p 和a p n 结合：g p i 锚定受体直接引向抗占垢剂膜或脂筏，使穿膜 过程更加择易：毒素穿膜后在顶膜导致迅速的膜电压、离子平衡的改变，水流 细胞细胞膨胀 最终导致整个细胞裂解( g 6 m e ze ta l ，2 0 0 7 ；b r a v oe ta l ，2 0 0 4 ) 。 c a d h e r i n a l p a p n 避参攀辫 圈ic r y 毒素m 鳞翅目幼虫中的怍用模式( b 摸! ) ( g 6 】，2 0 0 7 ；b r a v oe ia l ，2 0 0 4 ) f i g l im o d e lo f t h e m o d eo f a c l o no f f t 3 t o x l n s i n l e p i d o p t e r a r _ f l r v a e z h a n g 模型。z h a n g 等( 2 0 0 5 ) 认为孔洞的形成与细胞毒性的关联性没有足够的证据，并提出 了新的b t 毒素作辟j 模式：c r y l a b 单体与b tr 】结台后激发了m 9 2 + 依赖的信号传导，虽终0 起了细 胞死亡( 图12 ) 。该模型的提出对c r y l a b 仅通过渗透裂解的方式杀，e 细胞的观点产生了很大的 挑战。从圈1 2 模型中我们可以看到