（劳动卫生与环境卫生学专业论文）美白化妆品功效评价的研究.pdf

复旦大学硕 毕业论文 美白化妆品功效评价的研究 中文摘要 我们采用培养的1 3 _ 1 6 黑素痛细胞，研究u v a 对细胞黑素合成功能的影响，列 几种常用美白剂进行了黑素细胞毒性和黑素合成的功效测试，并初步探讨美白化 妆品的美白功效评价，以期为今后美白化妆品的功效评价和卫生监督提供测试指 标和评价依据。研究表明： b1 6 黑素瘤细胞经u v a 照射后，黑素含量增加，酪氨酸酶活性提高。u v a 促 细胞增殖作用的照刺剂量在1 8 j c m 2 以内，当照射剂量在3 6j c m 2 以上，细胞 增殖率无明显变化。 选用熊果苷、曲酸衍生物、b l 一9 9 和氢醌酯等化学物进行细胞毒性试验。 主要实验方法包括m t t 实验和l d h 释放试验。结果显示，这些化合物均可明显损 伤b 1 6 细胞。在实际使用时建议熊果苷以低于7 0 “g m l 、曲酸衍生物以低于5 0 ug m l 、b l 一9 9 以低于1 0 ug m l 剂量为宜；并在美白化妆品和临床用药中应不使 用或严格限量使用氢醌。 几种美白剂均可抑制b - 1 6 细胞的黑素合成。熊果苷对酪氨酸酶有抑制作用， 但曲酸衍生物、b l 一9 9 和氢醌酯对酪氨酸酶活性抑制不明显。在皮肤美白功效 评价中，应以黑素含量改变的结果为基准。 采用l a b 色度系统评价某种美白化妆品的美白功效。选择1 0 名年轻女性，其 连续使用某品牌美白化妆品9 0 天，观察其使用前及使用后第3 0 、6 0 、9 0 天其额、 颊、颈部肤色的变化；肤色的测量采用光谱光度计。结果表明：颊部色差( ae ) 在使用该品牌美白化妆品9 0 天后变化有显著性。其余各测试部位的变化无显著性。 提示颊部是美白化妆品人体试验合适的观察部位；使用该品牌美白化妆品9 0 天后 颊部肤色变白。 关键词：美白剂u v a 细胞毒性l a b 色度系统功效评价 复旦大学硕十毕业论文 s t u d i e so ne v a l u a t i o no ft h ee f f e c t i v e n e s so f s k i nl i g h t e n i n gc o s m e t i c s ( a b s t r a c t ) i l lo r d e rt o s t u d yt h ee f f e c t i v e n e s so fs k i nl i g h t e n i n gc o s m e t i c sa n dp r o v i d e a t h e o r e t i c a lb a s i sf u rt h ea s s e s s m e n to ns k i nl i g h t e n i n gc o s m e t i cf u n c t i o na n dh y g i e n i c s u p e r v i s i o n ，t h e a s s e s s m e n t so f l c y t o t o x i c i t ya n de f f i c a c yo fs e v e r a l c h e m i c a l sw e r e p e r f o r m e db y av i t r os t u d yi nt h ec u l t u r e db 一16m e l a n o m ac e l l sa s k i ns p r e a dt e s tw a s a l s op e r f o r m e dt oe v a l u a t et h ee f f i c a c yo f l i g h t e n i n gc o s m e t i c s b 16m e l a n o m ac e l l si r r a d i a t e dw i t hu v as h o w e dam a r k e di n c r e a s ei nm e l a n i n c o n t e n ta n dt y r o s i n a s e a c t i v i t y c e l l sp r o l i f e r a t i o n i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y t h e s e i n d i c a t e dt h a tu v ac o u l di n c r e a s eb16m e l a n o m ac e l l s m e l a n o g e n e s i s ，t y r o s i n a s e a c t i v i t ya n di n d u c et h ep r o l i f e r a t i o ni nad o s e d e p e n d e n tm a n d e r h o w e v e r , t h e e f f e c to f u v ai r r a d i a t i o no nt h ei n d u c t i o no f m e l a n o c y t ep r o l i f e r a t i o nw a sl i m i t e d c y t o t o x i c i t i e so fs e v e r a lc h e m i c a l s ，s u c ha sa r b u t i n ，k o j i ca c i dd e r i v a t i v e s ，b l 一 9 9a n dh y d r o q u i n o n ed i p r o p i o n a t ew e r ee x a m i n e du s i n gb 一1 6m e l a n o m ac e l l s t h e m e t h o d su s e di n c l u d e dm t tt e s ta n dl d hr e l e a s ea s s a 矿t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h o s e c h e m i c a l si n d u c e dc y t o t o x i c i t i e so nb 一1 6m e l a n o m ac e l l s i ti ss u g g e s t e dt h a tt h ed o s e o fa r b u t i n ，k o j i ca c i dd e r i v a t i v e s ，a n db l 一9 9s h u l db el e s st h a n7 0pg m l ，5 0ug m l ， 1ol a g m 1 r e s p e c t i v e l y , a n dh y d r o q u i n o n ed i p r o p i o n a t e s h o u l dn o tb eu s e df o r l i g h t e n i n gc o s m e t i c sa n d o rd r u g s ，o r t h ed o s es h o u l db el i m i t e ds t r i c t l y s e v e r a lc h e m i c a l ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h em e l a n o g e n e s i s a r b u t i ni n h i b i t e dt h e t y r o s i n a s ea c t i v i t yo f c u l t u r e db 一1 6m e l a n o m a c e l l s ，b u tk o j i ca c i dd e r i v a t i v e s ，b l 一9 9 a n d h y d r o q u i n o n ed i p r o p i o n a t e c o u l dn o tr e d u c et h ea c t i v i t i e so f t y r o s i n a s e s i g n i f i c a n t l y i nc u l t u r e db 一1 6m e l a n o m ac e l l s t h ec o n t e n to fm e l a n i ni s m o r e i m p o r t a n t f o rt h e e f f i c a c y m e a s u r e m e n to fs k i n l i g h t e n e r s t h a nt h ea c t i v i t i e so f t y r o s i n a s e t h es k i nc o l o rc h a n g e si n d u c e db y s p r e a d i n gt h et e s t e dl i g h t e n i n gc o s m e t i c sw e r e e v a l u a t e dw i t hat r i s t i m u l u sc o l o r i m e t e ri n10c h i n e s ey o u n gw o m e nd u r i n gt h e p e r i o r do f 9 0d a y st h e eo fc h e e ka f t e ru s i n gt h et e s tl i g h t e n i n gc o s m e t i c sf o r3 0 ， 6 0 ，9 0d a y sw e r e4 8 5 ，5 2 1 ，6 7 7 ，r e s p e c t i v e l y t h e r ew e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c ei n t h eaeo fc h e e ka f t e r u s i n g t h et e s t e d l i g h t e n i n g c o s m e t i c sf o r9 0 d a y s b u tn o t s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sf o ro t h e rt e s t e da r e a s i ti ss u g g e s t e dt h a tt h es k i nc o l o ro f c h e e k 2 复旦大学硕十毕业论文 w a s l i g h t e n e da f t e ru s i n gt h et e s t e dl i g h t e n i n ga n d c h e e ki st h em o s t a p p r o p r i a t es i t ef o r e v a l u a t i n ga n dc o s m e t i c sf o r9 0d a y s k e y w o r d s ：s k i n l i g h t e n e r s u v a c y t o t o x i c i t y l a bc o l o rs y s t e ma s s e s s m e n tm e t h o d 3 复旦大学硕士毕业论文 前言 ( i n t r o d u c t i o n ) 人类皮肤的颜色主要取决于黑素( e 1 j i 3 s ) 的含量以及分布，而黑素细胞 ( m e a n i i s ) 的结构和数量直接影响皮肤中黑素的含量，是产生黑素的决定因素。 黑素细胞属于腺细胞，具有树状突起，它起源于胚胎神经嵴，随胚胎发育移行至 表皮基底层，并通过树状突起，以l ：3 6 的比例与角质形成细胞构成一个表皮黑 素单位。在表皮黑素单位中，黑素细胞与角质形成细胞之间互相影响，尤其是角 质形成细胞可通过接触及分泌碱性成纤维细胞牛长因子( h f g f ) 、内皮素( e t i ) 、 神经细胞生长因子( n g f ) 、白介素l ( i l 一1 ) 、白介索6 ( i l 一6 ) 、肿瘤坏死因子( t n f ) 等对黑素细胞的形态、结构和功能产生明显的影响“。黑素细胞的树状突起实际 为一管道，黑素细胞内所产生的黑素由此枝状管运输到角质形成细胞内，在角质 形成细胞溶酶体内降解，随表皮细胞的脱落而排出。皮肤中约有4 0 0 万个黑素细 胞，通过致密斑与基底膜相连。电镜下，黑素细胞核呈圆形，胞质清亮，有形成 黑素的膜性细胞器即黑素小体( m e l a n o s o m e ) 。”。 由于黑素化的程度不同，黑素可呈现黄、红、褐、黑等颜色，人类皮肤及头 发颜色不是取决于黑素细胞的数量，而是取决于黑素小体的数量、大小、分布及 黑素化程度。不同种族的人皮肤中黑素细胞数大体上相同，但黑种人角朊细胞内 的黑素小体数量多、形态大、黑素化程度深、单个散在分布、降解缓慢，而自种 人角朊细胞内的黑素小体量少、形态小、黑素化程度轻、多聚集分布于吞噬溶酶 小体内，易降解”1 。 黑素除可使皮肤呈现一定颜色外，还有防晒、抗衰老及防癌等功能。黑素小 体能过滤日光中的有害光线，消除紫外线引起的自由基，防止弹力纤维变性所致 皮肤老化，还能保护d n a ，使其免受有害因素引起的致突变效应，从而降低皮肤癌 的发生率0 1 。因此黑素对人体具有一定的生理保护功能。 黑素的合成必需有三种基本条件：酪氨酸为制造黑素的主要原料。酪氨 酸酶是酪氨酸转变为黑素的主要限速酶，为铜及蛋白质的组合物。酪氨酸在酪 氨酸酶的作用下氧化为黑素，这一过程需要有氧参与。 目前公认的黑素合成途径：酪氨酸一多巴一多巴醌一多巴色素一二羟基吲哚 一酮式吲哚一黑素，合成的黑素叫优黑素或真黑素，皮肤的色素主要由其组成。 在黑素合成中，多巴醌还可通过另一条途径经谷胱苷肽或半胱氨酸催化生成褐黑 素( p h e o m e l 3 , n in ) ，但褐黑素在皮肤中的功效尚不了解”1 。 复大学硕士毕业论文 以前人们一一商认为酪氨酸酶是黑素合成过程中关键的限速酶，但是通过深入 研究发现，酪氨酸酶不是调控黑素合成的唯一的限速酶。除酪氨酸酶外，多巴色 素瓦变酶( d o p a c h r o m et a u t o m e r a s e ) ( t r p2 ) 和_ 羟基吲哚羧酸( d h i c a ) 氰化酶( t r i ，1 ) 在黑素合成中也起着不容忽视的作用。三酶联合作用的观 点虽能较好地解释黑素细胞合成黑素的机制，但仍不够完善，这就为研究人员提 出了新的课题“。“。 由于黑索合成过程中的酪氨酸酶活性和黑素输送等环节容易受到外界的影响 从而为美白化妆品的研究开发提供了可能。t q 前常用美白化妆品的主要作用靶点 是酪氨酸酶、黑素细胞和黑素的转运代谢，如熊果苷、曲酸及其衍生物、维生素c 衍生物、甘草酸提取物和内皮素拮抗剂等，这些美白剂通过抑制黑素细胞合成黑 素而降低肤色。 美白剂通过作用于皮肤黑素的形成、代谢途径的某个阶段控制或抑制黑素的 生成，从而降低皮肤色度或减轻色素沉着，最终达到美白皮肤的目的。美白剂作 为外来物质，在干预皮肤黑素细胞的黑素合成功能，达到美白皮肤目的的同时， 也干扰了皮肤正常的生理功能，甚至产生皮肤损害”1 。在美白剂的生产、使用过程 中存在许多盲区，这包括常用美白剂的功效和对黑素细胞的毒性不明确。目前我 国还没有颁布实施美白化妆品功效评价程序，使得美白化妆品在投入市场前无肯 定的、科学的功效检测报告，造成消费者选择化妆品的困难，也使各级监督部门 实施监督无据可依。因此我们对几种常用皮肤美白剂的美白功效和黑素细胞毒性 进行检测，并采用l a b 色度系统评价美白化妆品的美白功效，为美白化妆品的生 产、安全使用和卫生监督提供依据。 复旦大学碗上毕业论文 夫 白评 化价 妆的 品研 功究 效 体外试验 技术路线 u v a 照射对b 一1 6 细胞的影响 几种美白剂对b - 1 6 细胞的 细胞毒作用研究 几种美白剂对b - 1 6 细胞 黑素合成功能的影响 人群试验l _ 一采用l a b 色度系统测定皮肤颜色 复旦大学硕士毕业论文 第一部分 u v a _ ! 射对b1 6 细胞的影响 e f k c t so fu l t r a v i o l e tal r r a d i a t i o no nb 1 6m e l a n o m ac e l l s 紫外线( u l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ，u v r ) 是人体长期接触的一个外界环境因 素，在人皮肤老化过程中起着显著的作用一，人体暴露部位皮肤的衰老表现8 0 以 上的原因是u v r 作用的结果，其中主要是u v a 。过量的u v r 照射可引起皮肤颜色加 深；我国人群皮肤类型大多属于i v 型，型皮肤的特点是容易晒黑而不易晒伤。 因此，如果在美白皮肤的同时不注意防晒，则常常会导致事倍功半甚至毫无效果。 对于u v b 诱导正常黑素细胞和黑素瘤细胞中色素沉着的特性以往有较多的研 究，而对u v a 诱导黑素细胞合成黑素的机制研究甚少。最新实验表明，u v a 可引起 细胞的改变，而且很可能是i i i 型和型皮肤增加色素合成的主要促进剂。我们以 幽际通用的、与j f 常皮肤黑素细胞生理功能近似的b 1 6 黑素瘤细胞株作为受试细 胞，观察了u v a 对体外培养的b 一1 6 黑素瘤细胞的形态、细胞活力及黑素合成功能 的影响，初步探讨u v a 对黑素细胞的作用机理。 材料与方法 1 试剂与仪器 1 1 试剂 1 6 4 0 培养液( 美国，g i b c o ) ；小牛血清；胰蛋白酶( d i f c o ，进口分装) ：四甲 基偶氮唑蓝m t t ( 上海华美生物工程公司) ；0 5 脱氧胆酸钠溶液，蒸馏水配制； 0 1 l - d o p a 溶液( 美国，s i g m a ) ，每次用0 1 m o l l 磷酸钠缓冲液新鲜配制；l m o l l 氢氧化钠溶液；0 1 m o | l 磷酸盐缓冲液( p b s ) 。 1 2 光源 紫外线灯( 上海特种荧光灯管厂) ，波长3 2 0 4 0 0 h m ，波峰值3 6 5 n m ，紫外 灯管预热稳定后用u v a 辐射仪测定( 北京师范大学光学仪器厂) ，功率为l m w c m 2 。 1 3 仪器 3 1 8 m c 型酶标仪( 上海三科仪器有限公司：9 6 孔培养板、培养皿( 美国， c o r n i n g ) ：分光光度计( 尤尼柯上海仪器有限公司：普通离心机( 转速为5 0 0 r m i n 、4 0 0 0 r m i n ：3 7 电热恒温水浴锅；l e i c a 倒置显微镜。 复旦大学硕上毕业论文 2 i 豇、k 2 1 细胞培养 b1 6 小鼠黑素瘤细胞株( 中科院细胞所) 。待细胞生长至弧融合状态，经02 5 腴蛋白酶消化传代，用1 6 4 0 培养液，嚣1 c 0 ，培养箱3 7 。c ，5 c 0 。饱和湿度环境进 行培养。每次实验均取自同一传代细胞。 2 2 细胞形态的观察 在倒置显微镜下观察b 1 6 黑素瘤细胞的形态。 2 3 细胞增殖率检测：m f t 比色法“” 取指数生长期的细胞，0 2 5 胰蛋白酶消化，调节细胞密度为2 1 0 4 m l ，加 入9 6 孔培养板中，每孔1 0 0 1 q 。置3 7 ，5 c 0 。饱和湿度条件下培养2 4 小时后， 吸弃培养液，加入少量d - h a n k s 液，在超净台上用事先消毒好的o v a 光源照射 细胞，照射时间分别为1 0 、2 0 、3 0 、6 0 、7 0 m i n ，相应剂量为0 6 、1 2 、1 8 、3 6 和4 2 j c m 2 ，并设置培养液及未经u v a 照射的细胞作为对照，每组均设8 个平行 样。照射完后。吸弃d - h a n k s 液，加入新鲜培养液，继续置3 7 ，5 c 0 ：饱和湿度 条件下培养7 2 h 。于结束前4h 加入m t t ( 5 m g m 1 ) ，每孔2 0 9 l ，3 7 ，继续孵 育4h ，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入1 5 0 t 1d m s o ，振荡l o m i n ， 使甲替结晶物完全溶解，置酶标仪于5 7 0 h m 测光吸收值。用下列公式计算各组细 胞增殖率：细胞增殖率= ( u v a 照射组a 值一未经1 j v a 照射组a 值一培养液a 值) ( 未经u v a 照射组a 值一培养液a 值) x 1 0 0 。 2 4 黑色素含量的测定“ 取指数生长期的细胞，0 2 5 胰蛋白酶消化，调节细胞密度为2 1 0 4 m l ，每 孔3 m 加入6 孔板中，置3 7 ，5 c 0 。饱和湿度条件下培养2 4 小时后，吸弃培养 液，加入少量d - h a n k s 液，照射方式同前，实验共分为五组，一组为对照组( 未 经紫外线照射) ，另外四组为实验组，在u v a 光源下分别照射5 、1 0 、2 0 和3 0 m i n ， 连续照射两天，即累积剂量分别为0 6 、1 2 、2 4 和3 6j c m 2 。每组重复3 孔， 第四天开始测定。将培养到期的各组细胞经0 2 5 胰蛋白酶消化离心后，用p b s 缓冲液清洗离心2 次，再用p b s 缓冲液将沉淀细胞吹打成悬液计数后备用。 参照h i d e y aa n d o 等报道的方法，经一定改进后进行黑色素含量的测定。取 备用细胞悬液加p b s 缓冲液调节细胞密度至1 0 4 左右，各吸取l m l 细胞悬液分别置 于3 个平行具塞试管中，离心后( 1 0 0 0 r m i n ，5 m i n ) 弃去上清夜，先加入2 0 0 n 蒸馏水使细胞重新悬浮，然后加入1 m 1 乙醇：乙醚液( 体积比为1 ：1 ) 以溶解非 复旦大学硕士毕业论文 黑色素的不透明颗粒，在室温下放置1 5 m i n ，离心( 3 0 0 0 r m i n 。5 m i n ) 并弃去上 清液，加入l m l1 0 二甲基亚砜l m o l ln a o h 溶液，置于8 0 水浴3 0 m i n ，用 分光光度计在4 7 0 n m 波长处测定a 。值，黑色素含量用每个细胞处理组a 。值占 对照组a 。值的百分率来表示。取三个平行样的均数作为结果。 2 5 酪氨酸酶的测定1 取备用细胞悬液加p b s 缓冲液调节细胞密度至1 0 4 左右，各吸取l m l 细胞悬 液分别置于3 个平行试管中，离心后( 1 0 0 0 r m i n ，5 m i n ) 弃去上清液，加入 l m l o 5 脱氧胆酸钠溶液，并充分振摇使细胞溶解，将试管置于o c 1 5 m i n ，再置 于3 7 水浴1 0m i n ，即可加入0 1 l d o p a 溶液，振摇后在分光光度计4 7 5 n m 处，分别于0m i n 和1 0m i n 时读取吸光度值，计算两个时段的吸光度值的差值， 酪氨酸酶活性用每个细胞处理组k 。值占对照组a 。值的百分率来表示。取三个 平行样的均数作为结果。 3 统计分析 实验结果以i s 表示，两组间比较采用t 检验，由s p s s1 1 0 软件完成数 据录入和分析。 结果 1 i n h 照射对b - 1 6 细胞形态的影响 从图卜1 可见，随着u v a 照射剂量的增加，细胞的树突明显增多、延长，细 胞间相互融合成网状结构。但当u v a 照射剂量为3 6j c m 2 时，细胞分布稀疏， 不能相互融合成网状结构。 b 一1 6 细胞( 对照) x 2 0 0b _ 1 6 细胞( u v a0 3j c m 2 ) 2 0 0 9 复旦大学硕士毕业论文 b - 1 6 细胞( u v a0 6j 伽2 ) 2 0 0b - 1 6 细胞( u v 1 2j c m 2 ) x 2 0 0 b - 1 6 细胞( u v a1 8j c m 2 ) x 2 0 0b - 1 6 细胞( u y a3 6j c m 2 ) 2 0 0 图1 - 1 细胞形态的变化 2 2u 、r a 照射对细胞增殖的影响 照射剂量在0 6 、1 2 、1 8j 锄2 时，随着照射剂量的增大，细胞增殖率 逐步上升，与对照组相比，经t 检验，各组差异均有显著性( t 值分别为2 4 9 5 ， 2 6 4 5 ，3 0 8 1 ，p o 0 5 ) 。见表1 - 1 。 1 0 里呈查堂堡! ：兰些堡塞 表1lu v a 照射对细胞增殖的影响( 可s ，) 照剁剂量( ，j c m 2 ) 样本数 细胞增殖率 06 8 1 9 i3 0 2 1 1282 4 8 6 + 0 2 8 1 8 82 6 5 5 + 0 2 4 3 6 81 0 4 3 0 2 2 4 2 89 0 1 0 2 2 注：与对照组相比，+ p 0 0 5 2 3u v a 照射对细胞黑素合成和酪氨酸酶活性的影响 随着u v a 照射剂量的增加，各组b 一1 6 细胞的黑素含量增加、酪氨酸酶活性增 强，与对照组相比，差别均具有显著性( p ( o ，0 5 ) ，说明细胞合成黑素的能力提高。 见表1 2 和图卜2 、图卜3 。 表卜2u v a 照射对b 一1 6 细胞黑素合成和酪氨酸酶活性的影响( i s ) 注：与对照组相比，+ p 0 ，0 5 ，“p 0 0 1 。 复旦大学硕十毕业论文 黝 善2 0 0 梨5 0 | ；i | - o o 5 0 0 00 61 22 43 6 u v a ( j l c m 2 ) 图卜2u v a 照射对b 一1 6 细胞黑素合成的影响 图卜3u v a 照射对b 1 6 细胞酪氨酸酶活性的影响 讨论 皮肤的颜色主要取决于皮肤中黑素的含量与分布，黑素是由黑色素细胞合成 的，成熟的黑色素细胞主要分布在表皮基底层，具有树状突起，每一个黑色素细 胞与其毗邻的约3 6 个角质形成细胞( k e r a t i n o c y t e ，k c ) 在形态和功能上构成。 个“表皮黑素单位”，黑素在黑素细胞内合成后，经黑素细胞的树突分泌到周围的 角质形成细胞内，形成皮肤色素并保护机体免受紫外线损伤。 啪 黝 m m 的 。 一)|掣蜉髓链爵龌 复旦大学硕一：毕业论文 紫外线是人类黑色素细胞增殖和皮肤色素沉着增多的主要生理性刺激。研究 表明，紫外线为一外源性的促细胞分裂剂，能引起黑素细胞的增殖及黑素产生， b 现皮肤色素衫e 着“2 ”1 。邑索沉着是皮肤色素系统对外界环境的保护反应。l i b o w ”4 等认为u v a 照射是体外培养正常人黑素细胞的促分裂剂，紫外线照射后使黑素细 胞数量增加，可能是由于紫外线促进了黑素细胞的有丝分裂。d u v a l 。”等观察了在 不同条件下人黑素细胞对u v a 和u v b 照射的不同反应。发现用u v b 照射与角质形 成细胞同培养的黑素细胞，很低的剂量( 5m j c m 2 ) 也能明显地刺激黑素的合成，但 对单独培养的黑素细胞即使照射剂量增加至5 0m j c m 2 也没有作用。当照射剂量增 大至6 0m j c m 2 时细胞黑素合成出现显著提高，但进一步增大剂量对黑素合成基本 没有影响。这结果说明黑素细胞对u v f l 反应的域值在5 0 。6 0m j c m 2 之间。与 此相反，u v a 照射无论在有无角质形成细胞共培养的情况下均能刺激黑素的合成。 以上结果说明角质形成细胞在介导u v b 造成的色素沉着方面起重要作用，而u v a 直接对黑素细胞起作用，诱导色素沉着。r a m i r e z b o s c a “”研究了不同剂量紫外 线对体外培养黑素细胞的影响。当照射剂量达2 0 0 m j c m 2 时，细胞树突数量增多， 酪氨酸酶活性及细胞黑素总量均明显增加；但随照射剂量增大，细胞增殖呈下降 趋势，直至停止。有人研究发现紫外线照射可使照射部位皮肤黑素细胞增殖，酪 氨酸酶( t y e ) 基因表达增加，黑素细胞表面受体表达增多。紫外线照射刺激角质 形成细胞和脑垂体释放多种刺激因子，诱导黑素细胞分裂增殖，增加黑素生成， 促进黑素细胞树突生长，保护细胞不致程序性死亡。紫外线照射诱导黑素细胞黑 素生成增多可能与对黑素细胞d n a 的破坏及破坏d n a 的修复有关。紫外线对d n a 的破坏可上调酪氨酸酶m r n a 含量，增加细胞受体表达和对黑素细胞刺激素( m s h ) 的反应性- ”3 。 我们以b 1 6 黑素瘤细胞株为受试对象，观察了u v a 照射对细胞黑素生成的影 响。 黑素细胞是一种具有树枝状突起的腺细胞，树枝状突起是黑素细胞输送黑素 颗粒的通道，黑素细胞内所产生的黑素由此树枝状管道运输到角质形成细胞内， 因此细胞形态正常与否，对于黑素细胞功能的发挥具有重要作用。本研究结果显 示，u v a 照射剂量在小于1 8j c m 2 时，随着照射剂量的增加，细胞树突明显增多 延长，细胞增殖率逐步上升，与未经照射组比较，差异均具有显著性。当u v a 照 射剂量大于3 6 i c m 2 时细胞增殖率无显著性变化。同时参照h i d e y aa n d o 等的 方法测定黑素含量和酪氨酸酶活性，随照射剂量的增加，细胞合成黑素的能力逐 渐被激活，黑素含量逐步增加，酪氨酸酶活性也有明显的提高，与对照组相比差 别显著( p o 。0 5 ) 。进一步表明，黑素含量与酪氨酸酶的活性有关。 复旦大学硕士毕业论文 从本研究结果及其它实验研究来看，紫外线作为一外源性刺激物，能明显增 加黑色素细胞产生黑素和提高酪氨酸酶的活性，使黑素体迅速向角质层传递。皮 肤中的黑素通过对紫外线的吸收、散射等效应，起着抵御目光紫外线照射的作用， 但同时使暴露部位的皮肤颜色增深，色素沉着明显，皮肤粗燥，皱纹加深、加粗， 加速皮肤的光老化。凼此，在美白皮肤的同时必须注意防晒，而且要全波段紫外 线防护，否则就会导致事倍功半甚至毫无效果。 小结 u v a 照射可以促使b 一1 6 细胞增殖，u v a 促细胞增殖作用的照射剂量在1 8 j c m 2 以内，当照射剂量在3 6j c m 2 以上，细胞增殖率无明显变化。 u v a 照射能诱导b 一1 6 细胞合成黑素，提高细胞内酪氨酸酶活性。 从本研究结果及其它实验研究来看，紫外线是引起黑色素细胞增殖和皮肤色 素沉着增多的主要的外源性刺激。我国人群皮肤的特点是容易晒黑，因此在 美自皮肤的同时必须注意防晒，而且要全波段紫外线防护，否则就会导致事 倍功半甚至毫无效果。 1 4 复旦人学硕士毕业论文 第二部分 美白剂对b 1 6 细胞的细胞毒作用研究 c y t o t o x i c i t yo f s k i nl i g h t e n e r so i lb 一1 6m e l a n o m ac e l l s 黑素细胞是皮肤的重要组成细胞之一，它以l ：3 6 的比例与角质形成细胞构 成一个表皮黑素单位，存在于表皮基底层，黑素细胞通过合成黑素使皮肤具有一 定的颜色，同时可吸收紫外线，使机体免受紫外辐射的伤害。皮肤颜色的深浅主 要取决于黑素的含量和分布，而皮肤白皙则是女性最为崇尚的美的标准之。由 此，许多化妆品公司生产美白化妆品来满足女性的需要，越来越多的女性使用美 白化妆品来增白皮肤。为满足广大消费者的需求，化妆品研究生产机构投入大量 资金开发美白剂，每年都有新型配方的美白化妆品投入市场。在美白剂的研究开 发过程中，化妆品研究生产机构多注重功效，轻毒性评价。投入市场的美白化妆 品均缺乏细胞毒性检测资料，国内美白化妆品生产单位，主要是通过购买现有、 已知的美白有效成分来生产美白化妆品，未见全面的美白剂毒性研究报道。在美 白化妆品的宣传中只提功效不说副反应和毒性，造成消费者购买美白化妆品的盲 目性，导致时有副作用发生“。为此我们选择四种常用皮肤美白剂，以国际通用 的、与正常皮肤黑素细胞生理功能近似的b 一1 6 黑素瘤细胞株作为受试细胞，进行 细胞毒性测定，以期为美白化妆品的生产、使用和卫生监督提供一些依据。 材料与方法 1 试剂 ( 1 )r p m l l 6 4 0 培养液( 美国，g i b c o 公司) ： ( 2 )小牛血清； ( 3 )胰蛋白酶( d i f c o ，进口分装) ； ( 4 ) 熊果苷、b l 一9 9 、曲酸衍生物、氢醌酯( 北京贝丽莱日用化工厂提供) ( 5 )噻唑蓝( m t t ) ( 上海华美生物工程公司) ； 2 仪器 ( 1 ) 普通离心机( 10 0 0 。i 00 0 0r m i n ) ： ( 2 ) 分光光度计( 尤尼柯上海仪器有限公司) ； ( 3 ) 3 7 电热恒温水浴锅； ( 4 ) 塑料培养瓶( 美国c o r n i n g 公司) 。 复旦火学硕士毕业论文 3 方法 3 1 细胞培养 b 一1 6 黑素瘤细胞株购于卜海市中科院细胞所。待细胞生长至近融合状态，绎 0 2 5 胰蛋白酶消化，h 含有1 0 小牛m 清的r p m i1 6 4 0 培养液传代，置于c q 培养箱3 7 ，5 c o ：饱和湿度环境中进行培养。每一次实验取自同一传代细胞， 初始接种细胞浓度为5 0 0 0 个c m 2 左右。 3 2 试剂配制与实验分组 熊果苷、b i ，一9 9 用生理盐水溶解：曲酸衍生物、氢醌酯用d m s o 溶解，然后均以 新鲜的1 6 4 0 培养液稀释至终浓度。d m s o 终浓度为1 。通过预实验确定b l 一9 9 和 曲酸衍生物的实验终浓度分别为o 5 、1 0 、5 o 、1 0 0 、5 0 0 垤m l ；熊果苷为 1 0 、3 0 、5 0 、7 0 、1 0 0r l g m l ：氢醌酯为0 1 、0 5 、1 0 、5 o 、1 0 0 m l 。空白 对照组仅加入测试美白剂所用相应溶媒( d m s o 或生理盐水) 。 3 3 细胞增殖率检测：m t t 比色法“” 取指数生长期的细胞，0 2 5 胰蛋白酶消化，调节细胞密度为2 x1 0 4 m ，加 入9 6 孔培养板中，每孔1 0 0 “1 。置3 7 ，5 c 0 2 饱和湿度条件下培养2 4 小时后， 吸弃培养液，用添加受试美白剂的新鲜培养基换液1 次。继续置3 7 c ，5 c o , 饱 和湿度条件下培养7 2h 。临测细胞增殖率时，每孔加入0 5 m t t2 0 m 。置c o ： 培养箱中继续培养4 小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入1 8 0 扯1 d m s o ，振荡l o m i n ，使甲替结晶物完全溶解，置酶标仪于5 7 0 r u n 测光吸收值。每一 实验重复4 次，用下列公式计算各组细胞增殖率：细胞增殖率( ) = 实验组a 。 对照组a ；，。1 0 0 。 3 4 细胞乳酸脱氢酶( l d h ) 释放测定“” 当细胞生长至8 0 融合时，弃去原培养液，分别加入含有受试物( 熊果苷、 b l 一9 9 、曲酸衍生物及氢醌酯) 的1 6 4 0 培养液，2 4 小时后测细胞上清夜中l d h 含 量。取上清夜1 0 0 “l ，依次加入如下试剂( 见表卜1 ) ，最后静止3 分钟，用7 2 1 分光光度计，波长4 4 0 h m 处分别测定各管吸光度，计算培养上清夜中l d h 的活力。 复旦大学硕士毕业论文 2 ，4 - 二硝基苯肼溶液( m 1 ) 0 50 5 4 统计分析 实验结果以ii s 表示，两组间比较采用t 检验，由s p s s1 1 0 软件完成数 据录入和分析。 结果 1 美白剂对细胞增殖的影响 由表2 2 和表2 3 显示，四种美白剂均可明显抑制细胞生长，以氢醌酯对细 胞生长抑制作用最大，浓度超过l g g m l 则呈现明显的抑制细胞增殖作用：曲酸 衍生物和b l 一9 9 作用基本相似；熊果苷对细胞生长的抑制作用较其它三种美白 剂弱。 表2 2曲酸衍生物、b l 一9 9 对b 1 6 细胞增殖率的影响( ) 曲酸衍生物5 05 2 o 5 84 l0 3 o 4 13 54 4 _ + 0 3 7 * 4 7 4 3 - - + 0 2 4 3 8 9 0 - + 01 8 b l 一9 95 81 l - + 01 54 2 3 2 02 5 * 4 51 3 04 7 * 3 4 6 7 - + 0 2 2 # 3 16 2 - + 0 1 8 # 复口大学硕士毕业论文 注：细胞增殖率以处理组占列照组a 值的百分率表示；每一实验重复4 次；与对 照组相比， p 0 0 5 ：$ p 0 叭。 表2 3 熊果二 j = 、氢醌酯对b1 6 细胞增殖率的影响( ) 注：细胞增殖率以处理组占对照组a 值的百分率表示；每一实验重复4 次：与对 照组相比，十p 0 0 5 ；料括号内浓度为氢醌酯实验浓度。 2 美白剂对细胞l d h 释放的影响 表2 - 4 和表2 - 5 的结果显示，b l 一9 9 在较低浓度时就使细胞释放l d h 释放 水平升高，氢醌酯在低浓度( 0 1 0 5i x g m 1 ) 时引起b 1 6 细胞l d h 释放水 平明显高于对照组，而浓度超过li j g m l 细胞l d h 释放水平则呈下降趋势。 表2 4 曲酸衍生物、b l 一9 9 对b 1 6 细胞l d h 释放水平( u l ) 的影响 注：与对照组相比$ p 0 0 5 复日大学硕十毕业论文 表2 5 熊果苷、氢醌酯刈b1 6 细胞l d i l 释放水平( u l ) 的影响 注： 与对照组相比，$ p 0 0 5 括号内浓度为氢醌酯实验浓度。 讨论 黑素细胞起源于胚胎神经嵴，具有树状突起，属于腺细胞，合成的黑素经由 树状突起分泌进入角质形成细胞，随角质形成细胞的脱落而排出体外。b 1 6 黑素 瘤细胞株的基本结构，特别是黑素合成功能与人正常的皮肤黑素细胞基本一致， 在人体原代皮肤黑素细胞培养非常困难的情况下，国外化妆品生产企业的科研部 门，在筛选美白剂的过程中，广泛采用该细胞株作为美白剂功效测定的受试细胞。 具有美白功效的化合物通过抑制黑素细胞中酪氨酸酶活性，或通过目前尚不 了解的途径抑制黑素合成，从而达到美白皮肤的目的。在国内，有关美白化学物 对皮肤黑素细胞毒性资料的报道甚少，但在美白化妆品消费者中已有发生副作用 的报道“”2 。”。细胞毒性试验与皮肤刺激试验相比，皮肤刺激试验主要检测 化合物较强的毒性，而细胞毒性试验主要检测化合物的潜在毒性及其远期效应， 非常敏感，因此有必要对目前常用的美白剂进行细胞毒性评价，以供化妆品生产 企业和卫生监督部门参考。 熊果苷和曲酸衍生物( 本次研究用的是曲酸双棕榈酸酯) 是目前国内外常用 于美白化妆品中的美白有效成分，具有一定的美白效果。氢醌酯是氢醌的脂肪酸 酯，它的活性成分是氢醌，氢醌在7 0 年代国外广泛用作皮肤美白剂，效果非常好， 由于其可疑的致癌性及皮肤刺激性，已被国内外限制或禁止用于美白化妆品中， 但是临床上仍在使用氢醌治疗皮肤色素沉着性疾病，有些化妆品生产厂家也在违 规超量添加氢醌于美白化妆品中。 复儿大学硕士毕业论文 m t t 试验是检测细胞存活和生长状况的常用方法。其原理是活细胞线粒体中的 琥珀酸脱氢酶使外源性的m t t ( 噻唑蓝) 还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在 细胞中，而死细胞无此功能，二甲基亚砜( d m s o ) 能溶解细胞中的紫色结晶物， 在一定细胞数量范罔内，m t t 结晶物形成的量与细胞数呈正比，用酶联免疫检测仪 在5 7 0 n m 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，m t t 比色分析法自 m o s m a n n 于1 9 8 2 年首创以来，以其简便、快速、准确和不使用同位素等特点，且 具有与同位素掺入法同样的灵敏度。，因而得到广泛的应用，欧盟国家己将其列 为化妆品毒理学安全程序的检测项目之。本次实验结果显示，熊果苷、曲酸衍 生物、b l 一9 9 和氢醌酯等四种物质可使培养细胞数量明显减少，细胞增殖抑制率 明显上升，表明四种物质均可破坏黑素细胞的增殖功能，抑制细胞的生长。而氢 醌酯的作用尤其明显当剂量达到l o 垤m l 时，己基本阻断细胞的增殖过程， 多数细胞停止分裂，进而死亡。提示四种物质的细胞毒性不容忽视。 乳酸脱氢酶( l d h ) 属于胞浆酶，在细胞膜受损时释放增加，也是反映细胞损 伤较灵敏的指标之一。本实验结果显示( 表2 4 、表2 5 ) ，熊果苷、曲酸衍生物 和b l 一9 9 等三种美白剂均可损伤培养细胞的细胞膜，导致培养细胞释放l d h 水 平明显升高，氢醌酯在低浓度( 0 1 0 5 肛g m 1 ) 时引起b 一1 6 细胞l d h 释放 水平明显高于对照组，而浓度超过l 垤m 1 时细胞l d h 释放水平则呈下降趋势， 结合形态学特征和细胞增殖情况，这可能是由于细胞死亡过多，活细胞数量减少 所致。l d h 是反映细胞膜完整性的重要指标，培养细胞上清夜中l d h 水平升高，表 示该细胞的细胞膜受到破坏。因此本研究结果提示，熊果苷、曲酸衍生物、b l 一9 9 和氢醌酯等四种美白剂所致细胞生长抑制可能与它们直接破坏细胞膜的完整性有 关。由于化学物的毒作用机制是复杂的，目前也缺乏有关该4 种化学物毒性作用 及其机制的研究报道，因此要圆满解释该四种化学物的毒作用机制，有待于今后 进一步研究。 美白化妆品在美白皮肤的同时，可能对人体皮肤也会产生一定的损害。因此， 使用美白剂的剂量应适度抑制黑素细胞增殖和黑素