（动物遗传育种与繁殖专业论文）猪粪好氧堆肥工艺及堆肥微生物的筛选、纯化与发酵的研究.pdf

本研究系 国家自然科学基金( 3 0 4 7 1 2 7 1 ) n a t i o n a ln a t u r a ls c i e n c ef o u n d a t i o np r o j e c t ( 3 0 4 7 1 2 7 1 ) “十一五”国家支撑计划( 2 0 0 6 b a d l 4 8 0 5 - 2 ) l lt hf i v ey e a r n a t i o n a ls c i e n c ea n dt e c h n o l o g yp r o g r a m ( 2 0 0 6 b a d i4 8 0 5 2 ) 湖北省重点项目( 2 0 0 6 a a 2 0 l b l 0 4 ) t h ee m p h a s i ss c i e n c ea n dt e c h n o l o g yp r o g r a m o fh u b e i p r o v i n c e ( 2 0 0 6 a a 2 0 lbl0 4 ) 共同资助 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 薹篓蕞喜l否 如需保密，解密时间 憝否保密f谨 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下避行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人巴经发 表或撰写过的研究成果也不包含为获得华中农生大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材_ 抖，指导教师对此进行了审定与我一佣工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中傲了明确的说明并袭示了谢意 研究生张式既 帆劢矽年月参日 签名日期：劢辟月g 日 签名日期：矽年6 月箩日 华中农业大学2 0 1 0 届博士毕业论文 目录 摘要。i a b s t r a c t i i i 缩略语表v i 第一章文献综述1 1 畜禽场废弃物对环境的污染1 2 猪粪堆肥技术研究进展2 2 1 好氧堆肥的概念2 2 2 好氧堆肥的基本原理2 2 3 好氧堆肥的条件3 2 3 1 碳氮比( c n ) 的调节3 2 3 2p h 值的调节4 2 3 3 水分含量的调节4 2 3 4 温度的调节。4 2 3 5 通风供氧5 2 3 6 微生物接种剂5 2 4 调理剂的选择与应用5 2 4 1 调理剂的种类6 2 4 2 调理剂在堆肥中的应用6 3 堆肥微生物的研究应用6 3 1 堆肥微生物的种类6 3 1 1 细菌7 3 1 2 真菌7 3 1 3 放线菌7 3 2 堆肥外源微生物的接种7 3 3 不同堆肥阶段微生物种类的变化：8 3 4 外源微生物接种在堆肥中应用8 4 研究堆肥微生物的分子生物学方法9 4 11 6 sr r n a 序列分析技术在堆肥微生物研究中的应用9 4 1 1 样品微生物总d n a 的提取与纯化9 猪粪好氧堆肥及堆肥微生物的筛选、纯化与发酵的研究 4 1 2 限制性片段长度多态性分析( i u l p ) 1 l 4 1 3 末端限制性片段长度多态性( t r f l p ) 1 1 4 1 4 变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 技术与温度梯度电泳( t g g e ) 技术1 2 4 2 研究堆肥微生物的其它方法1 3 4 2 1 传统稀释培养分离方法1 3 4 2 2 磷脂脂肪酸甲酯法( p l f a ) 13 第二章不同调理剂对猪粪堆肥过程的影响1 5 1 目的与意义1 5 2 材料与方法1 5 2 1 试验材料15 2 2 仪器设备16 2 3 试验方法16 2 3 1 试验处理及分组1 6 2 3 2 样品的采集、处理与保存17 2 3 3 试剂及配制方法17 2 3 4 各指标测定方法1 8 3 结果与分析2 2 3 1 堆体的物理表观性状2 2 3 2 无害化卫生学2 2 3 - 3 堆体温度的变化2 3 3 4 堆肥含水率的变化2 5 3 5 堆肥p h 值的变化2 6 3 6 堆肥中有机碳的变化2 7 3 7 堆肥中全氮的变化2 8 3 8 发芽指数2 9 4 分析与讨论3 0 4 1 温度对堆肥过程的影响3 0 4 2 堆肥过程中有机碳的损失3 0 4 3 堆肥过程中氮元素的损失3l 4 4 堆肥腐熟的判断3 l 5 本章小结。3 2 华中农业大学2 0 1 0 届博士毕业论文 第三章堆肥中产葡聚糖内切酶菌株的筛选及葡聚糖内切酶基因的外源表达3 3 1 试验目的与意义3 3 2 实验材料3 3 2 1 堆肥样品3 3 2 2 试剂与仪器3 3 2 2 1 实验试剂3 3 2 2 2 实验仪器3 4 2 2 3 缓冲液及常用试剂的配置3 4 2 3 培养基3 7 2 4 载体和菌株3 9 2 5 纤维素降解菌株的分离、纯化与鉴定4 0 2 5 1 菌种的富集、纯化与筛选4 0 2 5 2 分离微生物总基因组d n a 的提取、纯化4 0 2 5 3p c r 反应4 1 2 5 4p c r 产物的回收纯化、克隆和测序4 l 2 5 5 纯化的p c r 产物与载体连接4 l 0 ： 2 5 6 感受态细胞的制备( c a c l 2 法制备感受态) 4 2 2 5 7 连接产物的转化4 2 2 5 8 阳性克隆子鉴定4 2 2 6 纤维素酶活性的测定：4 3 2 6 1 待测酶液的制备：4 3 2 6 2 葡萄糖标准曲线的绘制4 3 2 6 3c m c 酶活性测定方法4 3 2 7 筛选菌株液体发酵条件优化4 4 2 7 1 不同碳源对产酶的影响4 4 2 7 2 不同碳源比例对产酶的影响4 4 2 7 3 不同氮源对产酶的影响4 4 2 7 4 不同的氮源含量对产酶的影响4 5 2 7 5 起始p h 对产酶的影响4 5 2 7 。6 温度对产酶的影响4 5 2 7 7 发酵时间对产酶的影响4 5 猪粪好氧堆肥及堆肥微生物的筛选、纯化与发酵的研究 2 。8 纤维素酶的酶学特性研究4 5 2 9 总d n a 的提取4 6 2 1 0e g l 基因引物的设计与合成4 6 2 1 1 基因e g l 的p c r 扩增4 6 2 1 2 基因序列的生物信息学分析4 7 2 1 3 原核表达载体的构建4 7 2 1 3 1 原核表达引物4 7 2 1 3 2 质粒的提取及酶切鉴定4 7 2 1 3 3 表达蛋白的诱导与s d s p a g e 检测4 8 2 1 3 4 表达蛋白的活性检测4 9 3 结果与分析4 9 3 1 菌株的分离、筛选与鉴定4 9 3 2 发酵培养基的优化5 2 3 2 1 葡萄糖标准曲线的绘制5 2 3 2 2 发酵培养基碳源的选择5 3 3 2 3 培养基中碳源含量对产酶的影响5 4 3 2 4 氮源对产酶的影响5 4 3 2 5 培养基中氮源含量对产酶的影响5 5 3 2 6 培养基中的初始p h 值对产酶的影响5 5 3 2 7 发酵温度对产酶的影响5 6 3 2 7 发酵时间对产酶的影响5 6 3 3c m c 酶的酶学性质研究5 7 3 3 1 不同的p h 值对酶活性的影响5 7 3 3 2 温度对酶活性的影响5 7 3 3 3 金属离子对酶活性的影响5 8 3 3 4 p h 值对酶稳定性的影响5 8 3 3 5 温度对酶稳定性的影响5 9 3 4 枯草芽孢杆菌d n a 的提取5 9 3 5 基因的p c r 扩增与测序6 0 3 6 原核表达载体的构建结果6 2 3 7 表达产物的s d s p a g e 分析6 3 华中农业大学2 0 1 0 届博士毕业论文 3 7 1 最佳诱导时间的确定6 3 3 7 ，2i p t g 最佳诱导浓度的确定6 4 3 7 3 融合表达产物的可溶性分析6 4 3 7 4 融合表达产物的酶活性分析6 5 4 讨论6 5 4 1 产酶菌株的分离与筛选6 5 4 2 测定酶活性时底物的选择6 6 4 3 酶活性的定量分析6 6 4 4 不同的碳源对菌株产酶的影响6 7 4 5 不同的氮源对菌株产酶的影响6 7 4 6 培养基初始p h 值对菌体产酶的影响6 7 4 7 外源表达条件的优化6 8 5 本章小结6 9 第四章堆肥中接种外源微生物对微生物群落的影响7 0 1 目的与意义7 0 2 材料与方法7 0 。蛰 2 1 试验器材7 0 2 2 试验药品7 l 2 3 培养基7 l 2 4 试剂盒7 l 2 5 常用试剂及其配制7 l 2 6 堆肥样品基因组d n a 提取、纯化7 2 2 6 1 细胞裂解方法a 7 2 2 6 2 细胞裂解方法b 7 2 2 6 3 细胞裂解方法c 7 3 2 6 4 细胞计数。：7 3 2 6 5d n a 纯化和回收7 4 2 6 6p c r 扩增和酶切7 4 2 6 7 基因组d n a 的琼脂糖凝胶检测7 4 2 7p c r 反应7 5 2 7 1p c r 引物7 5 猪粪好氧堆肥及堆肥微生物的筛选、纯化与发酵的研究 2 7 2p c r 反应7 5 2 7 3p c r 反应产物的检测7 5 2 8p c r 产物的回收纯化、克隆、f r l p 分析和测序7 6 2 8 1p c r 产物的回收纯化7 6 2 8 2 纯化的p c r 产物与载体连接7 6 2 8 3 感受态细胞的制备( c a c l 2 法制备感受态) 7 6 2 8 4 连接产物的转化7 6 2 8 5 阳性克隆子鉴定7 6 2 8 6r f l p 分析7 6 2 9 序列类型分析7 6 2 1 0 系统进化分析7 6 3 结果与讨论7 7 3 1 不同的裂解方法对堆肥中微生物细胞裂解效率的比较7 7 3 2d n a 提取量与回收效率7 7 3 3d n a 模板的可扩增性与可酶切性7 8 3 4 堆体温度的变化8 0 3 5 堆肥样品微生物总d n a 的提取8 1 3 6p c r 反应81 3 7r f l p 分析8 2 3 7 1 酶切分析8 2 3 7 2 升温期样品微生物群落分析8 3 3 4 3 高温期堆肥样品微生物群落分析8 6 3 7 3 降温期微生物群落分析8 9 4 讨 念9 2 4 1 堆肥微生物d n a 的提取9 2 4 2 堆肥中温度的变化j 9 3 4 3 堆肥微生物群落结构分析方法的选用9 3 4 4 接种外源菌株对堆肥微生物群落的影响9 4 5 本章小结9 4 第五章总结9 6 1 本研究获得的结果9 6 华中农业大学2 0 1 0 届博士毕业论文 2 本研究的创新点9 6 3 下一步值得研究的工作9 7 参考文献9 8 j g 【谢10 8 博士在读期间发表论文及研究成果1 1 0 华中农业大学2 0 1 0 届博士毕业论文 摘要 堆肥是处理畜禽场废弃物的主要手段之一，这种处理方法具有投资小，效益高， 可以使大量有机固体废弃物重复资源化利用等优点，但是同时也存在发酵周期长、 堆肥产品质量不高等缺陷。为了提高堆肥产品的质量、缩短堆肥周期、提高堆肥效 率，本试验主要从堆肥调理剂的选择、堆肥微生物菌种的筛选、筛选菌株的功能及 对堆肥中微生物群落的影响等方面开展了研究，试验结果总结如下： 1 不同调理剂对猪粪好氧堆肥过程的影响 分别以锯末、米糠和木屑为调理剂，调节堆肥原料的碳氮比为2 5 ：1 ，含水率为 6 0 ，通风方式采用人工翻堆的方式进行猪粪好氧堆肥。从各调理剂堆肥的温度、 含水率、p h 值、有机碳含量、发芽指数、全氮含量及碳氮比等方面进行了比较。3 个堆体都经历了快速升温期、持续高温期和缓慢降温期3 个时期，均可以实现好氧 堆肥的腐熟，并使堆肥产品达到国家粪便无害化卫生标准。不同的调理剂对猪粪好 氧堆肥堆体的温度变化影响较大，其中，以锯末为调理剂的堆体升温最快，米糠次 之，木屑升温最慢。以米糠为调理剂的堆体的高温期最长，锯末次之，木屑的高温 期最短。3 个堆体含水率的变化趋势相同，都随着堆肥的进程而不断降低，都从开 始的6 0 左右降低到3 3 左右。使用3 种不同调理剂进行猪粪好氧堆肥的最终产品 中氮元素的相对含量差异显著( p o 0 5 ) ，以锯末和米糠为调理剂的堆肥产品的全氮 含量较高，为2 1 2 和2 1 0 ，以木屑为调理剂的堆肥产品的的全氮含量较低，为 1 9 0 。 2 堆肥中产葡聚糖内切酶微生物的筛选、分离与纯化 通过以c m c - n a 为唯一碳源的筛选培养基进行初筛得到1 7 株不同的微生物，经滤 纸培养基进行复筛后得到一株能够产c m c 酶的菌株。经形态学鉴定发现，该菌株为产 芽孢的革兰氏阳性菌，并通过细菌1 6 sr d n a 的通用引物对该菌株的1 6 sr d n a 扩增测 序，与n c b i 数据库中的序列比对后发现，该菌株的1 6 sr d n a 序列与枯草芽孢杆菌的 1 6 sr d n a 序列相似度达到1 0 0 ，因此该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌，命名为s u b t i l i s b a c i l l u sd c y 1 ，并保藏在中国典型培养物保藏中心( c c t c c ) ，保藏编号为：c c t c cm 2 0 8 1 2 2 。分离菌株的最佳液体产酶培养基为：麸皮1 5 ，豆粕1 5 ，n a c i o 5 ， c a c l 20 0 5 ，m g s 0 40 0 5 ，酵母提取物0 1 ；产酶条件为：发酵温度为3 0 ，培 养基初始p h 值为7 0 ，培养时间为4 0 h 时c m c 酶活达到最大。菌株所产的c m c 酶 的最佳作用温度为5 5 ，最佳p h 值为7 5 ，n a + 、c a 2 + 、n i 2 + 对c m c 酶酶促反应有 猪粪好氧堆肥及堆肥微生物的筛选、纯化与发酵的研究 一定的促进作用，c u 2 + 和m $ 1 2 + 对c m c 酶酶促反应有显著的抑制作用。c m c 酶在低 于6 0 时热稳定性较好，在p h 值为5 8 时比较稳定。 3 分离并鉴定了枯草芽孢杆菌s u b t i l i sb a c i l l u s d c y l 的e g l 基因 通过设计引物获得了完整的c d s 序列，g e n b a n k 数据库登陆号为，h m 0 3 6 0 6 0 ， 通过生物信息学分析软件对基因的结构和性质进行了预测。以枯草芽孢杆菌为出发菌 株，构建t草芽孢杆菌e g l 基因重组原核表达载体p g e x k g ，优化后的最佳条件为 i p t g 诱导3 5 h ，其浓度为0 6 m m o l l ，主要以可溶的形式存在，通过对表达产物活性 的测定发现，葡聚糖内切酶活性可达1 2 1 2 3 u m l 。 4 堆肥中微生物总d n a 提取方法的改进研究 针对堆肥中微生物抗性比较强的特点，设计了通过蛋白酶和蜗牛酶2 次消化的堆肥 样品的d n a 提取方法。分别从对微生物细胞的裂解效率、d n a 产量、d n a 回收效率 及p c r 可扩增性等方面对3 种不同的d n a 提取方法进行了研究比较，结果表明，3 种方法都能够从堆肥样品中成功的提取出微生物的d n a ，但是，双酶裂解法比其他2 种方法效率更高，更加经济实用。本试验中所提出和改进d n a 提取方法可以有效的应 用于堆肥样品中，由于堆肥样品中的杂质和干扰物要比土壤、污水等环境样品中更加 复杂一些，所以，这种方法也可以应用于其他环境样品微生物的提取与纯化。 5 添加外源微生物对堆肥细菌群落的影响 堆体接种外源微生物后能够明显的提高堆体的温度升高速度和堆体的最高温度， 延长了高温期的时问。通过r f l p 技术快速、准确地研究了猪粪好氧堆肥过程中不同 时期的细菌群落的变化。比较了接种外源微生物的堆体和自然堆肥堆体中细菌种类和 数量的差异，结果表明接种外源微生物可以改变堆肥中微生物群落的变化，所接种的 微生物能够适应堆肥的环境，并成为优势菌群。通过与n c b i 数据库中比较，试验中 共发现3 5 条序列与已知微生物序列相似性很低，这些序列有可能是堆肥中尚未发现的 新物种，它们在堆肥中的作用有待进行进一步研究。 关键词：猪粪；堆肥；1 6 sr r n a ；葡聚糖内切酶；d n a 提取：发酵 华中农业大学2 0 1 0 届博： = 毕业论文 a b s t r a c t c o m p o s ti sap r i m a r yt r e a t m e n tf o rt h ew a s t eo fl i v e s t o c k t h i sm e t h o di se f f i c i e n c y a n dr e s o u r c e f u lt od e a lw i t ho r g a n i cs o l i dw s t e ，b u ti ta l s oh a v es o m ed i s a d v a t a g e s ，f o r e x a m p l ，l o n gt i m ef o rf e r m e n t a t i o na n dl o wq u l i t y i no r d e rt oi m p r o v et h eq u a l i t yo f c o m p o s tp r o d u c t s ，s h o r t e nt h ec o m p o s t i n gt i m ea n di m p r o v et h ec o m p o s t i n ge f f i c i e n c y , t h i ss t u d yr e s e r c hi nt h ec h o i c eo fc o m p o s tc o n d i t i o n e r , s c r e e n i n gf o rc o m p o s tm i c r o b i a l s t r a i n sa n dt h ei m p a c to ft h es t r a i n sf o rm i c r o b i a lc o m m u n i t yi nc o m p o s tm a i n l y t h e r e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 d i f f e r e n tc o n d i t i o n so na e r o b i cc o m p o s t i n go fp i gm a n u r e r e s p e c t i v e l y , s a w d u s t ，r i c eb r a na n dw o o dc h i p p e rw e r eu s e da st h ec o n d i t i o n e rf o r s w i nc o m p o s t i n g t h ei n i t i a lc a r b o na n dn i t r o g e nr a t i ow a s2 5 ：1 t h em o i s t u r ec o n t e n to f t h em i x t u r ew a s6 0 a n dt h ev e n t i l a t i o nm e t h o dw a st u r n i n gp i gm a n u r ec o m p o s t i n g w e c o m p a r e dt h ed i f f e r e n c ei nt e m p e r a t u r e ，m o i s t u r e ，p h ，o r g a n i cc a r b o n ，g e r m i n a t i o ni n d e x ， t o t a ln i t r o g e na n dn i t r o g e nr a t i o t h r e ep i l e se x p e r i e n c e dar a p i dw a r m i n gs t a g e ，h i g h j t - 二 t e m p e r a t u r es t a g ea n ds l o wc o o l i n gs t a g e a l lc m p o s tp i l e sm e e t t h en a t i o n a ls t a n d a r df o r f e c a lh a r m l e s s d i f f e r e n tc o n d i t i o n si n f l u e n c e dt h et e m p e r a t u r eo fc o m p o s t i n gp i l e w i t h ；：p ? 、 s a w d u s t 嬲b u l k i n ga g e n t si nt h ep i l eh e a tu pt h ef a s t e s t ，f o l l o w e db yr i c eb r a n w o o d c h i p sw a st h es l o w e s t w i t hr i c eb r a na st h ec o n d i t i o n i n ga g e n te x p e r e n c e dt h el o n g e s t h i g h t e m p e r a t u r es t a g e ，f o l l o w e db ys a w d u s t ，w o o dc h i p si st h es h o r t e s to n e t h e t r e n do f i m o i s t u r ec o n t e n to ft h r e ep i l e sr e d u c e dw i t ht h ec o m p o s t i n gp r o c e s s a l lp i l e sr e d u c e dt o a b o u t3 0 f r o m6 0 u s ed i f f e r e n tc o n d i t i o n i n ga g e n t si nt h ep i gm a n u r ec o m p o s t i n g l e a dt oas i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t ( p 7 5 时，就会 增加氨气的挥发，而导致n 元素的大量损失。 2 3 3 水分含量的调节 堆肥中适宜的水分含量是堆肥的关键因素。各种堆肥原料中的含水率各自不同， 但是最终的堆肥混合物中的水分应该是在5 0 - 6 0 。水分是微生物生长和繁殖的重 要因素，水分含量超过6 0 时，会阻碍氧气在堆体中的运输，阻碍微生物的好氧代 谢，导致堆体的厌氧代谢而产生大量臭气，不利于高温好氧堆肥的进行。水分过少， 不能满足微生物大量繁殖的需求，同时也不能有效溶解堆体中的各种营养物质。 王丽莉等( 王丽莉等，2 0 0 6 ) ，通过鸡粪和秸秆堆肥研究了堆体含水率与腐熟对 堆肥粉碎程度的影响，通过堆肥不同腐熟度和不同含水量下粉碎度的测定，表明堆 肥含水量是影响堆肥粉碎度大小的重要因素，堆肥粉碎度与含水量呈反比关系。粉碎 度的临界含水量为2 0 ，含水量低于2 0 时，含水率的变化对粉碎度的变化的影响较 小。含水量大于2 0 时腐熟度对粉碎度的影响增强。 2 3 4 温度的调节 温度是判断堆肥是否成功和堆肥进度的一个重要指标。同时，温度也是微生物 生长情况及生物活性的间接指标。堆肥温度的变化主要是由于在堆肥初期堆肥中嗜 温微生物对堆肥原料中一些比较简单的有机物质像蛋白质、多糖类物质的降解利用， 增加自身的生长繁殖代谢而产生的热量，随着热量的积累，堆体的温度会越来越高， 有时候可以达到5 0 “5 。堆体的温度也会反过来影响微生物的生长、微生物的 活性、有机质的分解速度。当温度超过堆体中嗜热微生物的忍耐度后将对堆肥微生 4 华中农业大学2 0 1 0 届博士毕业论文 物产生有害的影响。当温度超过6 3 c 时，堆体中微生物的生物活性就会开始降低， 超过7 2 c 时，生物活性达到最低。而过低的温度将会延长堆肥达到腐熟的时间。堆 体的温度在5 5 的条件下保持3 天，或者5 0 以上保持5 7 天，是杀灭堆肥中所含 致病菌，保证堆肥卫生指标合格和腐熟的重要条件。 2 3 5 通风供氧 通风供氧是堆肥能够成功进行的重要因素之一，堆体的需氧量与堆肥材料中有 机物含量及堆肥微生物的活性有关，堆肥材料中的有机碳越多微生物越活跃，所需 氧气就越多( 李国学等，2 0 0 3 ) 。堆肥系统的通风方式主要有以下几种：条垛式人 工翻堆系统、静态强制通风系统和反应器系统。条垛式人工翻堆系统不需要复杂的 机械设备但是占地面积较大需要投入较多的人力：静态通风系统不需要物料的翻堆， 堆体中的氧气通过鼓风机来提供，特点是操作简便省事，但是消耗一定的能源；反 应器系统可以精确的控制通氧量、系统温度及含水率等各种指标，同时系统可以自 动运行，堆肥过程不受外部气候影响等优点，缺点是投资巨大，规模较小。 魏源送等( 魏源送等，2 0 0 1 ) 采用自然通风与强制通风相结合和强制通风2 种不同的通风方式进行污泥堆肥，试验结果表明，采用两种通风方式通风的堆体的 中温层都能达到6 0 c ，并能够维持一段时间，相对来说，采用自然通风与强制通风 相结合的方式堆体升温更快；采用强制通风的堆体的含水率和有机质变化幅度比较 大；在耗能方面，采用自然通风与强制通风相结合的方法的污泥堆肥比强制通风的 堆体的能耗要低。 2 3 6 微生物接种剂 堆肥过程实质上是微生物好氧发酵过程，向堆体中添加外源微生物接种剂可以 加快堆体材料的发酵速度，通过建立有效的菌群菌系加强对堆体有机物的降解。接 种微生物促进堆肥腐熟的机理主要有： 1 提高堆肥初期微生物的群体，增强微生物的降解活性。 2 缩短达到高温期的时间。 2 4 调理剂的选择与应用 在高温好氧堆肥工艺中，堆料通常不能满足堆肥过程所需的理化条件，需要向 物料中加入一定的辅料进行调节，调理剂是快速堆肥中必不可少的调节剂。 猪粪好氧堆肥及堆肥微生物的筛选、纯化与发酵的研究 2 4 1 调理剂的种类 根据调理剂的不同作用，可将其分为调节剂、膨胀剂和金属钝化剂；从调理剂 是否参与发酵过程的角度，可将其分为活性调理剂和惰性调理剂( 张军等，2 0 0 7 ) 。 2 4 2 调理剂在堆肥中的应用 调理剂是堆肥原料重要的组成部分，通过添加调理剂可以调节堆肥原料的物理 化学条件，满足好氧堆肥的中微生物的生长需求。调理剂主要用来调整堆料结构特 性，使堆体保持一定的空隙以利于空气流动，调节堆体的碳氮比、含水率等、堆肥 养份等作用，保证堆肥的快速高效进行。 黄懿梅等( 黄懿梅等，2 0 0 3 ) ，在自动高温堆肥装置中，分别使用草炭、沸石 和过磷酸钙为调理剂进行试验，研究发现不同的调理剂对堆肥的各种指标都有显著 影响，添加调理剂后可以使堆肥过程中氮素的损失率下降6 5 1 ；黄懿梅( 黄懿梅 等，2 0 0 5 ) 还发现，分别在猪粪和玉米秸秆的堆肥中分别添加果园土和炉渣后，堆 肥的有机碳降解率和p h 值的变化幅度比对照组小。于海霞等( 于海霞等，2 0 0 6 ) 分别用玉米秸秆、玉米芯和稻草作为调理剂研究了不同调理剂对牛粪堆肥的影响， 研究发现，不同的调理剂对堆肥温度变化有较大的影响。王卫平等( 王卫平等，2 0 0 5 ) ， 分别用砻糠、木屑、中药渣、香菇渣和茶叶渣作为堆肥的调理剂进行猪粪堆肥发酵 试验，结果发现添加调理剂后能够显著提高堆体的发酵温度，缩短发酵周期。倪姆 娣等( 倪姆娣等，2 0 0 5 ) ，分别用木屑、稻壳和米糠作为猪粪高温好氧堆肥的调理 剂进行堆肥试验，结果发现，添加米糠的堆体的最高温度只有3 8 ，因此得出米糠 不宜作为堆肥调理剂的结论。周文兵( 周文兵等，2 0 0 4 ) 等，分别以木屑、泥炭和 水葫芦为调理剂进行猪粪堆肥，研究发现不同的调理剂对堆肥产品的品质有显著影 响。魏源送等( 魏源送等，2 0 0 2 ) 分别以木片、麦壳、玉米芯、稻壳和回流堆肥微 调理剂进行了中试规模的污泥堆肥试验，结果发现以木片和玉米芯为调理剂的污泥 堆肥比以麦壳和稻壳为调理剂的污泥堆肥水分降低的更多，各试验组堆肥有机质的 降解差异不大。根据大量的试验结果可以发现，堆肥调理剂的选择对堆肥的顺利进 行及堆肥产品质量都有直接的影响。 3 堆肥微生物的研究应用 3 1 堆肥微生物的种类 在堆肥过程中含有大量的微生物菌群，在适当的条件下，堆肥中的微生物能够 6 华中农业大学2 0 1 0 届博士毕业论文 大量生长繁殖，对堆肥原料进行降解和转化。在整个堆肥过程中，各种微生物交替 生长繁殖，演替出现。 3 1 1 细菌 在整个堆肥过程中，细菌是数量最多的一种微生物，在堆肥的初期和高温都有 很多细菌存在。在堆肥的初期，嗜温细菌是堆肥中最主要的微生物。高温期，一些 高抗逆性的细菌成为堆肥中的优势菌，比如芽孢杆菌中的枯草芽孢杆菌b s u b t i l i s 、 地衣芽孢杆菌b 1 i c h e n i f o r m i s 和环状芽孢杆菌b c i r c u l a n s 都是堆肥高温阶段的代表 细菌。 3 1 2 真菌 在堆肥过程中，真菌主要出现在堆肥的降温期，在高温期比较高的堆肥温度会 极大的抑制真菌的生长。其中一些真菌，如白腐菌、担子菌等都具有较强的分解木 质纤维素的能力( 李国学和张福锁，2 0 0 0 ) 。 h 3 1 3 放线菌 放线菌跟真菌类似也可以分解一些纤维素类物质，虽然没有真菌对纤维素的降 解能力强，但是放线菌放线菌可以以孢子的形式存活它们比真菌更加具有抗逆性， 它们可以在较高的温度下存活，因此它们对高温期的纤维素降解有着重要的作用。 诺卡氏菌、链霉菌、高温放线菌和单孢子菌等都是在堆肥中占优势的嗜热性放线菌 ( 朴仁哲等，2 0 0 5 ) 。 3 2 堆肥外源微生物的接种 在堆肥过程中，微生物对物质问的相互转化起着关键的作用，因此接种合适的 外源微生物可以加强对有机物质的降解，促进堆肥腐熟，提高堆肥品质( m i n gl ， 2 0 0 8 ) 。接种外源微生物可以增加堆肥中微生物的群体种类和数量，加快堆肥温度的 升高速度，进而缩短堆肥时间。通常情况下，堆肥原料中纤维素木质素的含量比较 高，因此为了缩短堆肥周期，可以在堆肥接种纤维素降解菌可以加快原料中有机物 的降解，促进堆肥腐熟；为了提高堆肥产品的品质，可以在堆肥中添加固氮、解磷、 解钾微生物。 猪粪好钒堆肥及堆肥微生物的筛选、纯化与发酵的研究 3 3 不同堆肥阶段微生物种类的变化 堆肥主要是微生物对原料中的有机物质的降解转化的过程，是由不同的微生物 群落相互制约相互促进的的动态变化过程，因此，研究堆肥微生物菌群结构，分析 堆肥过程中微生物种类和数量变化的特点对于指导堆肥在实践中的应用及对堆肥微 生物的筛选都有重要的意义。 李国学等( 李国学和张福锁，2 0 0 0 ) 通过传统的分离培养方法研究了堆肥过程 中细菌、真菌和放线菌的变化情况，发现细菌和放线菌的变化呈现高低高的规律， 高温期的细菌种类和数量都低予其它时期，放线菌在数量上比细菌要低两个数量级； 真菌在整个堆肥过程中一直都是呈下降趋势。朴仁哲等( 朴仁哲等，2 0 0 5 ) 也指出， 细菌和放线菌是堆肥过程中的优势菌，在整个堆制过程中，细菌的总数高于放线菌、 酵母菌和霉菌；在堆肥过程中，放线菌的种类较多，霉菌在数量上和种类上都比细 菌、放线菌和酵母菌少，而且种类比较单一。官家发等( 官家发，2 0 0 0 ) 研究发现， 在堆肥初期，微生物主要以中温好气性微生物为主，常见的有细菌和丝状真菌，堆 肥的高温阶段则以耐高温的嗜热微生物为主，常见的有好热真菌和好热放线菌。当 温度上升到6 0 c 以上时，好热的丝状真菌几乎停止了生长，好热放线菌和芽孢杆菌 成为优势菌群。7 0 c 以上时，除了好热芽孢杆菌外，其他大多数微生物都会死亡或 者进入休眠状态。 3 4 外源微生物接种在堆肥中应用 国内外已经有很多学者致力于研究堆肥不同阶段起关键作用的微生物，并进行 了优质高效菌的筛选和接种。 秦莉等( 秦莉等，2 0 0 9 ) ，采用添加具有降解纤维素和金霉素功能的外源复合菌 剂以鸡粪和秸秆为原料进行了堆肥试验，研究了接种外源菌后堆肥的降解效率和对 抗生素类药物的降解效果，结果表明，添加的外源菌系对纤维素降解有明显的促进 作用，接种菌