（作物遗传育种专业论文）睾丸酮丛毛单胞菌关键酶基因转水稻后代的遗传分析.pdf

福建农林人学2 0 0 9 届硕十毕业论文 摘要 以转入3 a h s d 基因的水稻为试验材料，进行分子检测、农艺形状及品质性 状考察，以及对种植土壤中甾体化合物含量的影响，得出主要结果如下： 1 p c r 和p c r s o u t h e r n 杂交证明，供试材料的明恢8 6 基因组中整合有3 a - h s d 基因。试验结果表明，微生物基因导入植物体内是完全可行的，且能够稳定遗传。 对转基因水稻不同世代的遗传规律进行追踪，试验结果表明：转3 a h s d 基 因水稻t l 代的遗传分离比率为2 ：1 ，1 2 代的遗传分离比率为3 ：1 ，t 3 代的遗传分离 比率为4 ：1 ，说明转基因水稻在不同世代的遗传稳定性不同，且不同株系在不同世 代的遗传比率也存在差异，随着世代数的增加，遗传稳定性逐渐提高。 2 本试验通过对转基因水稻及其后代农艺性状的研究表明，转基因水稻与对 照相比，农艺性状经常有一定变化，且株系间也会存在一定的差异。转基因植株 早代经常变矮，生长势减弱，穗长、穗总粒数、结实率和千粒重降低。但本试验 中的t l 代转基因水稻大多数生长势已较好，除结实率还存在差异外，其他综合性 状开始接近对照。t 2 代转基因水稻的农艺性状基本与对照无显著差异。t 3 代转基 因水稻的6 个株系在农艺性状方面已与对照无显著差异。表明随着世代的增加转 3 a - h s d 基因水稻在农艺性状上可以恢复到对照水平。因此，可以从中选出转 3 a - h s d 基因的纯合株系。 3 品质性状考察结果表明：3 a h s d 转基因水稻中稻米的可溶性蛋白和可溶性 淀粉含量虽然在早期世代发生了变化，转基因水稻的营养成分含量有所下降，但 随着世代的增加，籽粒中的可溶性蛋白和可溶性淀粉含量逐渐恢复与对照相同。 同时，稻米中的谷甾醇含量较低，6 个株系都与对照达到了显著或极显著差异。这 些结果表明转3 a - h s d 基因水稻在品质性状上可以达到本试验的预期效果。 4 对土壤的影响结果表明：不同世代转基因水稻对土壤中的甾体化合物都有 较强的降解能力，但随着世代的变化期降解能力也有差异。试验结果发现3 个世 代的转3 a - h s d 基因水稻都在成熟期具有最强的降解能力。 关键词：转基因水稻，3 a h s d ，遗传分析 祸建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , t h e3 a - h s dt r a n s g e n i cr i c ew a su s e da se x p e r i m e n t a lm a t e r i a lt o i n v e s t i g a t eq u a l i t yt r a i t sa n da g r o n o m i ct r a i t s t h em o l e c u l a ra n a l y s i so ft h et r a n s g e n i c r i c ea n di t si m p a c t so ns t e r o i d si ns o i lw e r ea l s oc o n d u c t e d t h er e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： 1 p c ra n dp c r s o u t h e r nb l o ta n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e3 a h s dg e n ew a s s u c c e s s f u l l yi n t e g r a t e di n t og e n o m i cd n a o fm i n g h u i8 6 i tw a sc o m p l e t e l yf e a s i b l e a n ds t a b l yi n h e r i t e dt ot r a n s d u c tm i c r o b i a lg e n e si n t op l a n t s t h ei n h e r i t a n c eo ft r a n s g e n i cr i c ew a sa n a l y s e di nd i f f e r e n tg e n e r a t i o n s t h e g e n e t i cs e p a r a t i o nr a t i oi nd i f f e r e n tg e n e r a t i o n so ri nd i f f e r e n ts t r a i n sw a sn o tt h es a m e ， b u tm o r ea n dm o r es t a b l ei nt h eh i 曲g e n e r a t i o n n l eg e n e t i cs e p a r a t i o nr a t i oo ft l g e n e r a t i o nw a s2 ：1 ，3 ：1i nt 2g e n e r a t i o na n d4 ：1i nt 3g e n e r a t i o n 2 t h ea g r o n o m i ct r a i t sa n a l y s i ss h o w e dt h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h e t r a n s g e n i cr i c e a n dt h ec o n t r o l ，a n dt h ed i f f e r e n c ew a sa l s oe x i s t e di nd i f f e r e n tt r a n s g e n i cs t r a i n s l o w e ra n dw e a k e rg r o w t h ，f e w e rt i l l e ra n dp a n i c l e sn u m b e r s ，s h o t e rt a s s e la n d p a n i c l e s l e n g t h ，l o w e rs e e ds e t t i n gr a t ea n dw e i g h to f10 0 0 一g r a i n sw e r eo f t e nf o u n di nt o t r a n s g e n i cr i c e t lt r a n s g e n i cr i c eg r o w e db e t t e rt h a nt og e n e r a t i o n ，a n di t sa g r o n o m i c t r a i t sw e r ea l m o s tt h es a m et ot h ec o n t r o le x c e p tt h es e e ds e t t i n gr a t e t 2a g r o n o m i c t r a i t sw e r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew i t ht h ec o n t r 0 1 t 3a g r o n o m i ct r a i t sw e r et h es a m e t ot h ec o n t r 0 1 t h e r e f o r e ，i tw a sa b l et oc u l t i v a t e3 a h s dt r a n s g e n i cp u r el i n e s 3 n er e s u l t so ft h eq u a l i t yc h a r a c t e r ss h o w e dt h a tt h es o l u b l ep r o t e i n ，s t a r c h c o n t e n ta n do t h e rn u t r i e n tc o n t e n ti nt r a n s g e n i cr i c er e d u c e di ne a r l yg e n e r a t i o n s ，b u t r e c o v e r e dg r a d u a l l yt ot h el e v e lo ft h ec o n t r 0 1 t h es i t o s t e r o lc o n t e n to fs i xt r a n s g e n i c s t r a i n sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dt ot h ec o n t r 0 1 t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e 3 a - h s dt r a n s g e n i cr i c ec o u l da c h i e v et h ee x p e c t e dr e s u l t sc o n s i d e r i n gt h eq u a l i t yt r a i t s o ft h et r a n s g e n i cr i c e 4 t h ei m p a c t so ft r a n s g e n i cr i c eo ns o i ls h o w e dt h a tt r a n s g e n i cr i c eh a db e t t e r s t e r o i d sd e g r a d a t i o na b i l i t y , b u tt h ea b i l i t yc h a n g e di nd i f f e r e n tg e n e r a t i o n s t h er e s u l t s f u r t h e ri l l u s t r a t e dt h a tt h et r a n s g e n i cr i c eh a dt h es t r o n g e s td e g r a d a t i o na b i l i t ya t m a t u r i t yp e r i o dt h a na n yo t h e rp e r i o d s k e yw o r d s ：t r a n s g e n i cr i c e ，3 a - h s d ，i n h e r i t a n c ea n a l y s i s 2 福建农林大学2 0 0 9 届硕1 ：毕业论文 本文缩略词 缩写名 英文名中文名 3 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独 立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致 谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。 与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢 意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 弛咄 论文使用授权的说明 日期： o 。i f ， 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。留 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 指导教师亲笔签名：j 7 弛磷b 强：口。占 日期：形 福建农林人学2 0 0 9 届硕上毕业论文 第一章文献综述 l 睾丸酮丛毛单胞菌研究进展 睾丸酮丛毛单胞菌( c o m a m o n a st e s t o s t e r o n i ) 是一种严格需氧，非发酵的革兰氏阴性杆 菌，在自然界中分布广泛。据报道，已经从土壤、泥浆、水、罐装牛奶、人的血液、唾液和 尿液以及医院周边环境等的多种样品中分离得到该菌。它是一种非发酵的化能有机营养菌， 能够以有机酸和氨基酸为碳源生长，但很少利用糖类。而且，c t e s t o s t e r o n i 可以以类围醇( 如 睾丸酮、孕酮和胆汁酸等) 为唯一碳源和能源，通过包含许多酶的氧化甾核的复杂代谢途径， 完全消化这类底物n 瑚。因此，c t e s t o s t e r o n i 在这些稳定化合物的降解过程中起到了重要作用。 c t e s t o s t e r o n i 在存在类同醇化合物时能够产生多种类l 芒4 醇脱氢酶，其中之一是3 祥奎类固醇脱 氢酶羧基还原酶( 3 a 。h s d c r ) 。3 0 t - h s d 可作用于多种机制，可逆地催化c 1 9 - 2 7 类固醇3 位 羟基酮基的氧化还原反应【l 】。 此外，c t e s t o s t e r o n i 还能降解非类同醇类的异型生物质( x e n o b i o t i c ，药物、杀虫剂、致癌 物等) 如甲吡酮( m e t y r a p o n e ) 或相当小的对硝基苯甲醛( p - n i t r o b e n z a l d e h y d e ) ，同时，该菌也 能使一些致癌的p a h s 化合物失活 4 ，通过邻裂途径降解苯酚。最近，又有报道c t e s t o s t e r o n i 能够有效降解喹啉类化合物，并对其降解因素、降解途径进行了研究，结果表明：喹啉首先 被降解为1 h - - 2 氧喹啉，然后继续转化为6 习圣基- 2 氧喹啉，5 ，6 二羟基1 h 2 氧喹啉和5 一 羟基6 ( 2 一羧基乙烯基) 1 h - 2 一吡啶酮。还有报道利用c t e s t o s t e r o n i 以对甲基苯甲酸q t o l ) 为唯一碳源，催化其转化生成对苯二甲酸( p 1 a ) 【6 7 1 。 ct e s t o s t e r o n i 在存在类i 矧醇化合物时能够产生多种类固醇脱氢酶，3 昏h s d c r ( 3 a 习弪 类固醇脱氢酶羧基还原酶) 是该过程的一个关键酶。3 a h s d c r 可作用于多种基质，可逆 地催化c 1 9 - 2 7 类同醇3 位羟基酮基的氧化还原反应。3 a - h s d 还可以催化非同醇类的醛及酮中 的氧化还原【引，如杀虫剂n k l 4 2 2 5 5 、美替拉酮、p 硝革苯甲醛、p 硝基苯乙酮等。此外，3 a - h s d 还可作用于类固醇抗生素梭链胞酸，启动梭链酸的降解代谢；还可以使一些致癌的p a l - i s 化 合物失活。因此，睾丸酮丛毛单胞菌3 a - h s d 不仅催化类固醇类物质，将其作为唯一碳源，还 是一种对抗类固醇类抗生素和天然及合成的毒物的物质。由于可以消化多环芳烃类物质，在 清除环境污染上有很大的利用价值。它可以消化雌性激素、肾上皮激素及动植物分泌的难降 解甾类化合物；可以消除环境中塑料等白色污染物。1 9 5 6 年，m a r c u s 和t a l a l a y 首先证实3 弘 h s d c r 是类固醇类化合物、多环芳烃等降解过程中的关键酶。e r i cm o b u sa n de d m u n dm a s e r 唧于1 9 9 8 年从c t e s t o s t e r o n i 中克隆到了3 a h s d c r 基因，并做了表达和鉴定。确定了3 静 h s d c r 基因有7 7 4 b p ，编码2 5 8 个氨基酸残基，分子量约为2 6 4k d a 。c l e m e n sg r i m m ，e d m u n d m a s 一1o 】等于2 0 0 0 年确定了3 弘h s d c r 的晶体结构，表明原核3 洳h s d c r 属于s d r ( 短链 4 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 脱氢酶) 超家族。g u a n g m i n gx i o n g 和e d m u n dm a s e r 1 1 于2 0 0 1 年报道3 a - h s d c r 基因的附 近存在2 个抑制蛋白( r e p a 和r e p b ) 基因，与3 昏h s d c r 基因的方向相反。并于2 0 0 3 年 阐明了r e p a 和r e p b 的作用机理。国内也有许多研究3 a h s d c r 的文章发表。张国华等【1 2 】 于2 0 0 5 年从泥浆和土壤中分离和鉴定了睾丸酮丛毛单胞菌，并在大肠杆菌( e e o l i ) 中克隆 表达了3 昏h s d 。c h i c h i n gh u a n g ，y i - h s u nc h a n g 等2 0 0 5 年运用动力学( s t e a d y - s t a t ek i n e t i c s ) ， 点突变( s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ) 和p h - p r o f i l e 研究了3 弘h s d c r 催化反应中s e r l1 4 ，t y r l 5 5 和l y s l 5 9 的作用。 2 水稻转基因的应用与研究 2 1 转基冈技术在水稻上的应用 转基因技术在水稻上主要应用于水稻品种的遗传改良。迄今为止，人们己将多种的外源 基因导入水稻，获得了转基因植株。将水稻遗传工程中所用的有用基因可分为三大类：抗虫 性基因、抗病性基因和抗逆性基冈。在过去的几年中，3 类基冈在水稻遗传转化中的应用已取 得了一定的进展。此外，还有抗除草剂基因和品质改良基冈的转导。利用转基因技术进行水 稻品质改良主要是营养品质和食味品质。在食昧品质方面，已知控制水稻淀粉合成的基因主 要为a d g p 焦磷酸化酶基因、颗粒结合淀粉合成酶基因( g b s s ) 、淀粉分支酶基因( s b e ) 和淀粉 去分支酶基因( d b e ) 。这些基因多数已被克隆( 徐军望等，2 0 0 0 ) 。因此，通过对这些基因的遗 传修饰，可以改变淀粉合成的途径，也可改变淀粉主要成分直链淀粉和支链淀粉本身的分 子特征。从而改良稻米的淀粉品质特征。迄今这方面的工作主要集中在用反义技术对蜡质基 因( 胍) 的遗传操作上。该基因编码、x 蛋白，也就是g b s s ，利用反义r n a 技术，特异性地 抑制w x 基因的表达，降低w x 蛋白( g b s s ) 的含量，从而使转基因植株籽粒( 花粉) 中直链淀粉 下降。s h i m a d a 等( 1 9 9 3 ) 、i t o c h 等( 1 9 9 7 ) 用原生质体电激法分别将一个w x 反义r n a 和助c 基因片段导入水稻，都获得了水稻内源w x 基因被沉默，从而导致直链淀粉下降的转基因植株。 刘巧泉等( 1 9 9 9 ) 用杆菌介导法将反义脓7 基因导入水稻，也使t i 植株种子胚乳的直链淀粉下降。 李建粤等【1 3 】将大豆d n a 导入水稻后，也可降低稻米的直链淀粉含量。 2 2 转基因水稻的遗传分析 山西农业大学的李志岗博十研究了转基因小麦抗穗发芽特性的分子鉴定、遗传分析，结 果表明：t l 代是经过筛选得到的，是一个完全群体，用传统的遗传学方法分析是比较适用的。 从t 2 代到t 4 代，所有植株都是p c r 检测呈阳性植株的后代，分析起来较为复杂。在以前的 研究中，t 2 代早典型的孟德尔基因遗传，t 3 代事实上是减掉了t 2 代p c r 阴性的植株，因此分 离比应该是5 ：l ，同样，t 4 代的分离比应该是9 ：l 。温孚江i l 卅利用s o u t h e r nb l o t 分析及g u s 、 n p t i i 活性测定等方法，系统研究了这两个外源基冈在转基因水稻a r 2 中t o t 3 代的遗传及 5 祸建农林人学2 0 0 9 届硕上毕业论文 表达稳定性。a r 2 是用原生质体经p g e 直接转化( 共转化) 而获得的转基冈水稻。结果表明， 尽管g u s a 和? l e o 基冈在转化前分别位于不同的质粒上，但这两个基因在转基因水稻内的遗传 表现了完全连锁现象，在所测定的三代中，二者无分离现象。对g u s 和n p t i i 活性测定的结 果表明，g u s a 和? l e o 基囚连锁的结果，使得这两个外源基因的表达遵循孟德尔单显性基因的 遗传分离规律进行稳定遗传。 简玉瑜等研究了转入基囚的水稻t n l ，对t l t 5 这5 个世代不同株系的b a r 基因、抗 菌肽基因的遗传和表达进行初步研究。结果表明：转基因后代株系b a r r ：b a r s 大部分符合 3 ：1 分离比率。t l 、t 4 转基因株系p c r 、s o u t h e r n 印迹分析表明：t l 代8 株有抗菌肽b 基 因；t 4 仍有4 个株系有抗菌肽基因，其他的株系基因丢失。t 3 代1 个株系的n o r t h e r n 印迹证 明抗菌肽基因在r n a 水平有表达；抗菌肽b 转基因水稻对白叶枯病的抗病性有提高，抗性能 传递到高世代。在t 3 得到抗病性提高的株系。朱常香【l6 】等研究了c r yi a ( b ) 基因及其介导的 抗虫性在转基冈水稻自交或回交后代中的遗传规律和遗传稳定性。结果表明：c r y ，么( b ) 基因 及其连锁的b a r 基因作为一个显性遗传位点遵循需德尔遗传分离规律；在t l 代群体中遵循3 ：1 的分离规律，t 2 代稳定纯合：在b c1 b c 4 代群体中遵循l ：l 的分离规律，b c 群体自交的b c f 2 群体中遵循3 ：1 分离规律。c r yi a ( b ) 基因及其介导抗性已稳定地遗传至t 7 代和b c 4 代。室内 及田问抗虫性鉴定显示，不同世代的转基因植株均保持稳定的高度抗虫性。 刘梅【1 刀等用农杆菌介导法将c a m v 3 5 s 启动子调控下的外源基因t h e n 一4 2 转入粳稻 ( o r y z a s a t i v as s p j a p o n i c a ) 品种台北3 0 9 中。对1 0 0 多株再生植株进行了p c r 鉴定，结果表明， 9 0 以上的植株为阳性植株。s o u t h e r n 检测的结果进一步证实，外源基因已经整合到水稻基因 组中。对t l 代植株也进行了p c r 鉴定和潮霉素抗性鉴定，结果表明，大约7 0 的t 1 代转基 因株系符合3 ：l ( 阳性：阴性) 的分离比，表明t h e n 一4 2 基冈在这些株系中有单个插入位点；大约 2 0 的t l 代株系分离比符合1 5 ：1 ，表明这些株系含有2 个整合位点。选择部分t l 代潮霉素抗 性植株进行s o u t h e r n 杂交鉴定，结果证实，源基因已经稳定遗传给t l 代。检测了t o 代和t l 代转基冈植株对水稻纹枯病( r h i z o c t o n i a s o l a n i ) 和两个分别属于a 群和b 群的稻瘟病 ( m a g n a p o r t h e g r i s e a ) d , 种的抗性，结果表明，3 0 株系表现了对这两种病害抗性水平不同程度 的提高。有7 个株系的抗性与对照相比有显著的提高，其中t p 6 4 表现对两个稻瘟病小种完全 免疫。这些结果表明内切几丁质酶基因t h e n - 4 2 已经在受体植物中准确表达。 杨龙等1 8 1 以辐射南特号干种子的m 2 群体中得到的半矮秆品系南特矮2 作为研究材料。 对南特矮2 的性状分析表明：同南特号自然突变的矮脚南特相比，南特矮_ 2 是全闭颖授粉；株 高略高，各节问均有所增长：叶片较窄长，分蘖较少，茎秆较粗；穗长减小，结实率下降， 千粒重较小。南特矮- 2 对g a 3 的敏感度明显比矮脚南特低，同时随g a 3 浓度的增大，增长幅 6 福建农林大学2 0 0 9 届硕上毕业论文 度也明显比矮脚南特低。遗传分析表明：南特矮- 2 半矮秆性状由一对隐性单基冈控制，暂命 名为s d n ( t ) 基因。同部分已经报道的j 卜矮秆种质的等位性测验表明：南特矮2 的半矮秆基冈与 已知的、卜矮秆基因s d l 、s d - g 、s a t ( t ) 均不等位。 马炳田，王玲霞等1 9 摘要报道了用基因枪转化法将雪花莲凝集素基冈圆忆) 转移到优良籼 型杂交稻恢复系蜀恢5 中。p c r 、p c r s o u t h e r nb l o t t i n g 和s o u t h e r nb l o t t i n g 等分子检测证明， 外源基冈以多拷贝单位点方式整合到受体基因组中并稳定遗传到转基因第三代( t 2 ) 。转基因第 一代植株，在株高和结实率上相虑的组培、种子实生苗植株相比，发生明显的不可遗传的变 异，随着繁殖代数的增加，转基因植株恢复到与对照植株一致。李永春，孟凡荣，薛庆中2 0 】 通过p c r 检测及正、反交试验对转双价抗虫基因水稻材料的8 个t i 代株系中抗虫基因的遗传 特性进行了分析。结果表明：6 个株系中抗虫基因的分离符合3 ：1 的孟德尔单基因分离规律； 1 个株系中阳性和阴性植株之比接近于1 5 ：1 。该株系中抗虫基因可能以双拷贝插入到基因组中 的两个非连锁位点：1 个株系中阳性和阴性植株之比极显著偏离3 ：l ( 接近于l ：1 ) ，进一步分析 表明该偏分离现象可能与转基因花粉竞争能力下降有关。赵昕、徐香玲口1 1 采用分子检钡l l j ( p c r 扩增、p c r - s o u t h e r n 杂交) 与表型检测( 接真菌实验、酶活力测定) 相结合的手段，对花粉管通 道法及载体法导入几丁质酶基因烟草后代的遗传表现进行研究，结果证明通过不同方法导入 受体细胞基因组中的外源基因均能遗传给后代，并能在转化受体当代及后代中高效表达。但 采用花粉管通道法导入的外源基因虽然能够遗传给后代，但分离比复杂，遗传规律性较差。 而载体法导入的外源基因t l 代的卡方检测符合3 ：1 的遗传分离比率，遗传稳定性要好于d n a 直接导入。因此，建立良好的遗传转化系统是外源基因稳定遗传和表达的前提。王占斌等2 2 】 利用载体p b l g c 通过发根农杆菌( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g i n e s ) 叶盘法转化烟草，对烟草转基 因植株后代从d n a 水平、r n a 水平以及几丁质酶基因和p 1 ，3 葡聚糖酶基冈表达效率方面进 行系统的研究。 2 - 3 转基因水稻的检测 2 3 1 个体或细胞水平的检测 2 3 1 1 选择标记基因与报告基因 在构建载体时，人们常将选择标记基因( s e l e c t a b l em a r k e rg e n e ) 与报告基因份( r e p o r t e rg e n e ) 和启动子、目的基因重组在同一个载体上，共转化受体细胞，以便筛选转化的细胞。由于选 择标记基因与报告基因和目的基因紧密连锁，如果检测山选择标记基因与报告基因在植物体 内表达，那么目的基囚也很可能整合到了植物基因组内。 选择标记基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基冈，如新霉素磷酸转 移酶基冈0 叩) ，潮霉素磷酸转移酶基因( 助d ，二氢叶酸还原酶( d h f r ) ，磷丝菌素乙酰转移酶 7 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 基l 因( b a r ) ，草丁酸乙酰转移酶( p a o ，5 一烯醇丙酮酰草莽酸一3 一磷酸合成酶基因( 印置筘) 等。当在 幼苗培养基内加入选择试剂或在叶片上涂有选择试剂后，能正常生长的为转基因植株，不能 正常生长或死亡的为未转基因植株。报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，如 一葡萄糖苷酸酶基因( g z 岱) 可发生颜色反应，绿色荧光蚩白基因f g f p ) ，荧光素酶基因( ，z 岱) 可发 光，胭脂碱合成酶基因( n o s ) 、章鱼碱合成酶基因( o c s ) 可用o a e n 法快速测定。 李宝健等将人生长激素( h g h ) 基因、朋d r 口基冈与t i 质粒重组成p g l l 9 8 ( h g h ) t i 质粒。 用叶盘共培养法，转化花叶芋( c a l a d i u mb i c o l o r ) ，获得转基因植株。经n o s , n - p t1 1 分析，证 实h g h 基因己整合到花叶芋d n a 中口3 1 。殷丽青等以h p t 为选择标记基因，用携带p b w 4 质 粒的根癌农杆菌感染釉稻品种龙特普的幼胚愈伤组织，获得抗h p t 的愈伤组织，再将抗性愈 伤组织分化成植株。经g u s 活性测定和p c r 检测，结果证明外源基冈确已导入这些植株中2 4 1 。 姚方印等利用b a r 基因和断基因、g u s 基因和x a 2 1 基因紧密连锁的关系，对抗虫和抗病转基 因水稻及与常规水稻杂交的后代进行了抗病虫鉴定，证明标记基因阳性株与抗病虫性状是高 度一致的【2 卯。 2 3 1 2 原位杂交 原位杂交( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 是指通过杂交确定被检物在样本中的原本位置，最早由g a l l 和p a r d u e 及j o h n 等1 9 6 9 年建立，其基本原理是用标记的探针与组织细胞中的染色体d n a 2 8 1 2 9 1 ( m r n a 、蛋白质) 杂交，然后检测标记物，以确定细胞中目的d n a ( m r n a 、蛋白质) 的位 置。原位杂交技术方法有基因组原位杂交、荧光原位杂交、引物原位杂交、原位p c r 、原位 杂交结合荧光显带标记技术等2 8 1 。其基本技术包括：探针标记、组织固定、包埋、切片、粘 片、脱蜡、蛋白酶消化、乙酰化、预杂交、杂交、洗片、免疫检测、封片、照相等步骤【2 9 1 。 目前，原位杂交已成为研究转基因植株中外源基因在染色体上的定位及外源基因在组织细胞 内表达定位的主要方法【3 0 1 。 2 3 2d n a 水平的检测 2 3 2 1p c r 检测 p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 斟聚合酶链式反应，是指在d n a 聚合酶催化下，以母链 d n a 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模 板d n a 互补的子链d n a 的过程。是一项d n a 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩 增任何目的d n a 。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多 方面。 p c r 检测在转基冈植株的检测中运用得十分广泛，几乎所有的转基因实验都用p c r 检测 转化植株。巩振辉【3 1 1 、邓晓东口2 1 、李荣田【3 3 1 等运用p c r 为外源基因整合在转基因植株基因组 8 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 提供了证据。p c r 检测十分灵敏，p c r 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克( p g = 1 0 - 1 2 曲 量级的起始待测模板扩增到微克( p g = 1 0 一g ) 水平。能从1 0 0 万个细胞中检出一个靶细胞；在病 毒的检测中，p c r 的灵敏度可达3 个r f u ( 空斑形成单位) ；在细菌学中最小检出率为3 个细 菌。p c r 检测也十分快捷，短短的几小时便可检测几十个样品。因此，p c r 深受广大植物基 因工程技术人员的喜爱。但是，p c r 检测易出现假阳性，故只能作初筛，阳性植株需做s o u t h e r n 杂交进一步验证。 2 3 2 2 s o u t h e r n 杂交 s o u t h e r n 杂交( s o u t h e r nb l o t t i n g ) 是模板d n a 经酶切、凝胶电泳分离、转膜等步骤后，再 用标记的单链d n a 探针杂交检测的一种技术，可用来检测经限制性内切酶切割后的d n a 片 段中是否存在与探针同源的序列，其基本理论基础是碱基互补配对原则。s o u t h e r n 杂交同样 在转基因植株的检测中应用得十分广泛。陈秀花3 4 1 、高越峰3 5 1 、安韩冰【3 6 】等用s o u t h e r n 杂交 用力地证明了转基因植株基冈组中整合有目的基因。 s o u t h e r n 杂交方法操作简单，结果十分灵敏，在理想条件下，应用放射性同位素标记的 特异性探针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有2 n g 的d n a 也能被清晰地检测出来。 因此，s o u t h e r n 杂交技术在分子生物学及基因克隆试验中的应用极为普遍。 2 3 2 3 s o u t h e r n 点杂交和狭线杂交 s o u t h e r n 点杂交( d o t - s o u t h e r nb l o r i n g ) 和狭线杂交( s l o t s o u t h e r nb l o r i n g ) 都是检测克隆菌 株、动植物细胞株或转基因个体、器官、组织提取的总d n a 或r n a 样品中是否含有目的基 因的技术。它们的基本原理和操作步骤相同，即通过特殊的加样装置将变性的d n a 或r n a 核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中 是否存在特异性d n a 或r n a 。 余迪求等3 7 1 将含g u s 基因的质粒经根癌农杆菌( a g r o b a c t 嘶u mt 啪e 矗l c l e n s ) 介导导入金鱼 草细胞，获得再生植株。s o u t h e r n 点杂交证明，g u s 基冈已整合到转基因金鱼草基因组贺竹梅 等p 8 1 通过子叶与农杆菌共培养，将人促红细胞生成素基因( 甲d ) 导入番茄，获得转基因植株。 经s o u t h e r n 点杂交和s o u t h e r n 杂交，证明部分再生植株染色体中整合了e p o 基因。 s o u t h e r n 点杂交和狭线杂交与s o u t h e r n 杂交相比省掉了酶切、电泳、转膜等步骤，并一 次可转移多个样品，故可快速检测批量样品。但s o u t h e m 点杂交和狭线杂交易出现假阳性， 故只能作为初筛，阳性植株需做s o u t h e r n 杂交进一步验证。 2 3 2 4p c r - s o u t h e m 杂交 p c r s o u t h e r n 杂交( p c r - s o u t h c mb l o t t i n g ) 是指p c r 扩增的目的基因片段经凝胶电泳分离 后，直接转膜，再用标记的探针与膜上的d n a 印迹杂交并检测的技术。p c r s o u t h e r n 杂交将 9 福建农林大学2 0 0 9 届硕上毕业论文 p c r 与s o u t h c m 杂交藕合起来，既保持了p c r 的灵敏性，又保持了s o u t h e r n 杂交的准确可靠 性，故目前应用日趋广泛。李永春3 9 i 、马炳田【删、张彦妮【4 1 】等分别对转基因植株做p c r s o u t h e r n 进行检测。 2 3 2 5i p c r 分析 i p c r ( i n v e r s ep c r ) 即反向p c r ，是最早提出的基于p c r 的染色体步行技术之一。i p c r 的实验程序包括，用限制性内切酶酶切d n a ；酶切后的d n a 片段用t 4 d n a 连接酶进行自 连接，产生环状d n a 片段；以环化产物为底物，用根据已知片段设计的反向引物进行p c r 扩增，从而得到含有未知片段的扩增产物。i p c r 与普通p c r 相同之处是都有一个己知序列 的d n a 片段，引物都分别与已知片段的两末端互补。不同的是对该已知片段来说，普通p c r 两引物的3 一末端是相对的，i p c r 两引物的3 末端是相互反向的。故i p c r 可扩增己知片段旁 侧的未知序列。 韩志勇等4 2 1 以i p c r 为基础建立了适合于处理大量材料的克隆转基因水稻中外源基因旁 侧序称的技术体系。用这种方法，在一周内克隆了3 5 个转基因水稻株系中外源基冈的旁侧序 列，长度在3 0 0 7 5 0 b p 之间，p c r 产物的特异性用s o u t h e r n 杂交进行了证明。表明此方法具 有快速、稳定和高效的优点。 2 3 3 r n a 水平的检测 2 3 3 1n o r t h e r n 杂交和d o t - n o r t h e r n 杂交 n o r t h e m 杂交( n o r t h e r nb l o t t i n g ) 是指r n a 样品经凝胶电泳、转膜、预杂交后，再用标记 的探针与膜上的r n a 杂交，以检测r n a 样品中是否有与探针同源的序列。d o t - n o r t h e r n 杂 交( d o t - n o r t h e r nb l o t t i n g ) 是将总r n a 提取物经多孔过滤进样器直接转移到杂交膜上，其余步 骤与n o r t h e r n 杂交相同。 简玉瑜等 4 3 1 1 市基因枪( p a n i c l eb o m b a r d m e n t ) 将天蚕抗菌肽b 基因导入水稻发芽种胚， 获得转基因植株，t 3 抗白叶枯病株系经n o r t h e r n 杂交证明抗菌肽b 基因在r n a 水平有表达。 许新萍等4 4 1 将水稻碱性几丁质酶基因职c 2 力导入优良籼稻品种竹籼b ，n o r t h e r n 杂交表明在 部分转基因水稻基因组中的外源r c 2 4 基冈能在r n a 水平得到表达。d e w a lj a n i 等4 5 1 用农杆 菌介导法将霍乱毒素蛋白b 基基因( c t x b ) 导入番茄，n o r t h e r n 杂交表明转基因番茄内有c t x b 特异性的转录出现。 2 3 3 2i u p c r r t - p c r ( r e v e r s et r a n s e r i p t i o n - p c r ) 耳p 反转录p c r ，其原理是以植物总r n a 或m r n a 为模 板进行反转录，然后再经p c r 扩增，如果从细胞总r n a 提取物中得到特异的e d n a 扩增带， 则表明外源基冈实现了转录。r t - p c r 可检测转基因植株的目的基因在m r n a 水平是否有表 1 0 福建农林人学2 0 0 9 届硕： ：毕业论文 达。 张荃等4 6 1 从啤酒酵母中克隆了可调节植物细胞离子均衡的基因h a l l ，然后将h a l l 经农杆 菌介导的叶圆盘法导入番茄。经r t - p c r 检测，h a l l 在转基因番茄l ：代体内r n a 水平有表达。 s a m i ao j e l l n a n e 等h 刀将烟草硝酸还原酶基因n i a 2 经农杆菌介导导入马铃薯。经r t - p c r 分析， n i a 2 基冈在转基因马铃薯体内r n a 水平得到表达。 n o r t h e r n 杂交是检测基因在r n a 水平表达的权威方法。但n o r t h e r n 杂交的灵敏度有限， 对细胞中低丰度的m r n a 检出率较低。r t - p c r 则非常灵敏，如外源基因以单拷贝方式整合， 其m r n a 的检出常用r t - p c r 。 2 3 4 蛋白质水平的检测 2 3 4 1w e s t e r n 杂交 w e s t e r n 杂交( w e s t e r nb l o w i n g ) 的基本原理是转化的外源基因正常表达时，转基因植株细 胞中含有一定量的目的蛋白。从植物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，经s d s 聚丙烯酰胺凝胶 电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位转移到同相膜上，同抗体进行杂 交。根据检出结果，可得知被检植物细胞内目的蛋白表达与否，表达量的高低，及大致的分 子量。 王莉江等4 8 1 利用基因枪辅助的土壤农杆菌转化法将天花粉蛋白( t c s ) 基因转入籼稻明恢 6 3 的愈伤组织，并通过再生获得转基因植株。经w e s t e r n 杂交检测，舾基网在t o 代明恢6 3 中蛋白质水平有表达。吴刚掣4 9 1 以田间环境释放条件下农杆菌介导法转化而成的转c r y l a b 基 因水稻为研究对象，利用g u s 组织化学染色法、w e s t e r n 杂交筛选到一个c r y l a b 基因的沉默 株系，利用去甲基化试剂5 氮胞苷处理转基因沉默株系种子后，灌浆期用w e s t e r n 点杂交检 测，c r y l a b 基因恢复了表达活性。 2 3 4 2e l i s a e l i s a 为酶联免疫吸附法( e n z y m e l i n k e di m m u n os o r b e n ta s s a y ) 的简称，是以免疫学反应 为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很 高的试验技术。与w e s t e r n 杂交相似，但操作步骤不同。w e s t e r n 杂交是抽提总蛋白质后，经 s d s 聚丙烯酞胺凝胶电泳分离蛋白质，然后再转膜、杂交、检测。而e l i s a 是将抗体或抗原 包被在固相载体上后，再用免疫反应检测。 曾千春等5 0 1 应用基因枪法成功地将经过修饰的c r y l a c 基因导入到优良杂交籼稻恢复系明 恢8 1 中。e l i s a 分析证实，修饰的c r y l a c 基因在受体植株中得到表达。g e n gs a 等川将异戊 烯基转移酶基因( 勿d 经农杆菌介导法导入番茄。e l