（作物遗传育种专业论文）红麻雄性不育系的选育和不育基因的ISSR标记.pdf

摘要 红麻不育系的选育为红麻杂种优势的利用提供了新的途径。红麻雄性不育基因的分子标记， 可用于优良不育系或保持系的选择。采用单株选择回交的方法进行不育系的选择，用b s a 法进行 i s s r 引物的筛选。利用中国农业科学院麻类研究所红麻育种课题组在海南三亚发现的红麻不育株 a t 一1 做母本分别与1 5 - 4 ，0 4 k i 做杂交，再用父本回交4 次，确定了四个育性稳定的不育系和保 持系组合。 通过对红麻回交群体，f 2 分离群体育性的调查表明红麻雄性不育是由主效基因和微效基因共 同控制，在回交群体中发现了一些红麻具有部分不育现象说明了红麻存在多个位点对主效基因的 修饰作用。对f 2 分离群体的育性调查表明红麻雄性不育的分离比例为3 ：l ，符合盂德尔遗传规 律。 用c t a b 法提取红麻单株d n a ，利用b s a 法构建近等基因池一不育池和可育池，以近等基因池 d n a 为模板，进行i s s r 引物的筛选，筛选出一条能在不育池和可育池间产生稳定差异带的i s s r 引物u 8 5 9 。对不育系鉴定表明，不育系为质核互作型雄性不育，且不育性稳定。通过不育和可育 单株对i s s r 引物的鉴定表明，u 8 5 9 是与雄性不育基因连锁的i s s r 分子标记。 关键词：红麻；雄性不育；i s s r 分子标记 a b s t r a c t k e n a fm a l es t e r i l i t yb r e e d i n gg a v ean e wm e t h o df o rt h eu s eo fk e n a fh e t e r o s i s t h em a k e ro f g e n i e m a l es t e r i l i t yg e n e smk e n a fi su s e di nt h ec h o s e no fg o o ds t e r i l el i n eo rm a i n t a i n e rl i n e u s i n g p e r - p l a n tb a c kc r o s s i n gt oc h o o s es t e r i l e l i n ea n du s i n gb s at os c r e e ni s s rp r i m e r u s i n gp l a n t a t - l f o u n db yk e n a fb r e e d i n gr e s e a r c hg r o u po fi n s t i t u t eo fb a s tf i b e rc r o p sc h i n e s ea c a d e m yo f a g r i c u l t u r a ls c i e n c e s 协s a ny ao fh a i 彻np r o v i n c ew e t eu s e d a sf e m a l ep a r e n ti nc r o s s i n gw i t h15 4 ， 0 4 k 1a n dt h e nb a c k c r o s s c df o u rt i m e sw i t hm a l ep a r e n tt os e l e c tf o u rs t e a d ys t e r i l em a l es t e r i l i t ya n d m a i n t a i n e rl i n e t h r o u g hs u r v e y i n gt h ek e n a fb a c k c r o s sg r o u p sa n df 2s e p a r a t eg r o u pf o u n dt h a tt h ek e n a fm a l e s t e r i l i t yi sc o n t r o l l e db ym a j o rg e n ea n dt h ec o m n l o ng e n e i nt h eb a c k c r o s s i n gg r o u p sw ef o u n ds o m e k e n a fi sp a r to ft h ep h e n o m e n o ni n f e r t i l i t y i tw a si n d i c a t e dm a j o rg e n ei sm o d i f i c a t e db ym u l t i p l es i t e s f 2i s o l a t e dg r o u p so ff e r t i l i t ys u r v e ys h o w e dt h a tt h es e p a r a t i o no fm a l es t e r i l i t yk e n a fi s3 ：1 ，w i t h m e n d e l i a n t h ed n ao fe v e r yp l a n tw a se x t r a c t e db yc t a bt oc o n s t i t u t et h eg o n ep o o lb yb s a a p p l y i n gt h e i s s rt e c h n i q u ew ea n a l y s i s e dt h et w og e n ep 0 0 1 f i n a l l yw ef o u n dap r i m e rw h i c hc a r ls h o wt h e d i f f e r e n c eb e t w e e nt h es t e r i l eg e n ep o o la n df e r t i l eg e n ep 0 0 1 t h ei s s rp r i m e ri su 8 5 9 n l er e s u l t s h o w e dt h em a l es t e r i l i t yi sc y t o p l a s m in u c l e a ri n t e r a c t i o nm a l es t e r i l e ，m a l es t e r i l i t ys t e a d y ，a n dt h e i s s rp r i m e ru 8 5 9i sl i n k e dw i t hg e n i c - m a l es t e r i l i t y k e yw o r d s ：k e n a f ； m a l es t e r i l e ；i s s rm o l e c u l a r i i 缩略词中英文对照 t g o m p a r l s o no ta b b r e v l v a t l o nw i t he n r h s ha n d 乙h l n e s e ，1 。 ，一、 。 缩写英文名中文名 a f l p ： a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m扩增片段长度多态性 b s a ：b u l k e ds e g r e g a n ta n a n l y s i s 集团分离分析 c t a b ： c e t y lt r i r n e t h y la m m o n i u mb r o m i d十六烷基三甲基溴化胺 d d w ：d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 双蒸水 e b ：e t h i d i u mb r o m i d 溴化乙锭 e d t a ： e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 m a s ：m o l e c u l a ra s s i s t a n ts e l e c t 分子标记辅助选择 m i n ： m i n u t e 分钟 n i l ：n e a ri s o g e n e i cl i n e 近等基因系 p c r ：p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p v p p o l y v m y l p y r r o l i d o n e 磷酸吡哆醛 r a p d ：r a d o ma m p l i f i e dp l y m o r p h i s md n a 随机扩增多态性d n a r f l p ： r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 限制性片段长度多态性 s c a ： s p e c i f i cc o m b i n i n ga b i l i t y 特殊配合力 s e c ：s e c o n d 秒 s s r ： s i m p l es e q u e n c er e p e a t 简单重复序列 n 垣：t r i sa c e t a t i ca c i de d t ab u f f e r t r i s - 乙酸一e d t a 缓冲液 t e ：t r i s e d t a t e 缓冲液 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均在论 文中作了明确的说明并表示了谢意。 研糊名：乃驾 ，、 时间：砂夕r ，年月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业 科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签 导师签名： 时间：计年 6 月 日 一 帆魄年月 中国农业科学院硕上学位论文第一章文献综述 i i i_ii ：i ii iii i i i i 曼曼曼 己i 言 ji 口 红麻( k e n a f ) 是锦葵科木槿属一年生草本韧皮纤维植物，原产于非洲。红麻传统上主要作 为生产麻绳、麻袋、地毯等的原料( d e m p s y , j ，m 1 9 7 5 ；李宗道，1 9 8 8 ) 。我国红麻栽培从1 9 0 8 年 台湾省引进印度品种“马达拉斯红”( m a d r a sr e d ) 开始，已有近百年的历史，由于各种原因，红 麻生产几经大起大落，8 0 年代左右我国红麻生产进入高峰期，种植面积及总产均居世界首位( 李 德芳，1 9 9 3 ) ，但随着化纤工业的迅猛发展，红麻纺织业受到巨大冲击，红麻生产面临巨大挑战， 进入9 0 年代，随着森林资源的大量砍伐，带来了一系列的环境问题，入们开始关注其替代资源， 红麻作为其中之一，红麻的生产也得到了一定的恢复。 红麻有很多优良的生物特性，如生长速度快，抗逆性强，适应性广，可在全国大部分地区种 植；生物质产量高( 为树木的3 4 倍) ，二氧化碳吸收能力强( 为树木的4 5 倍) ；全杆可用于造 纸且品质可与针叶林木相媲美，因而可节约木材，保护森林：可用于制造麻地膜，减少白色污染； 可用于生产酒精、生物柴油，缓解能源危机：可在贫瘠的、盐碱地上生长，可做到不与其它作物 争良田，提高土地的利用率。由于以上优点红麻在日本，美国等发达国家备受关注，被看作2 1 世纪未来派优势作物，并在其多用途开发利用方面进行系统的研究和应用，涉及到麻纺、造纸、 装饰材料、土工布、板材、动物饲料、吸油材料、可降解纸地膜、食用，药用等许多领域( 程舟 等，2 0 0 1 ) 。而在我国对红麻的重视程度远远不够，因此必须抓住机遇，加大对红麻的研究，从 而促进红麻在我国的综合利用研究，改善环境，促进农业的可持续发展。 1 1 杂种优势 1 1 1 杂种优势的概念 第一章文献综述 杂种优势( h e t e r o s i s ) 是生物界种普遍现象，杂种优势是两个遗传组成不同的亲本杂交产生 的f l 比双亲具有较强的生活力、生长势、适应性、抗逆性和丰产性等表现的现象( 胡延吉，2 0 0 3 ， 刘宜柏，1 9 9 9 ) 。在作物杂种优势利用实践中，以杂种一代( f 1 ) 表现的杂种优势较为常见。 农作物杂种一代在生产中的应用对增强作物的抗病、抗逆性，提高作物的产量等方面发挥着 重要的作用。不同种类的作物其杂种一代种子的生产存在着不同的方法，在雌雄同花作物中，雄 性不育系对提高杂交种质量、降低制种成本等方面有很高的实用价值。同时，对雄性不育的形态、 遗传、细胞、生化、分子等方面的深入研究也有很高的学术价值。所以，对农作物雄性不育的研 究受到科学家的广泛关注。在很多的农作物中发现了雄性不育现象，红麻的雄性不育也是其中之 中国农业科学院硕士学位论文第一章文献综述 1 1 2 杂种优势利用概况 我国早在1 4 0 0 年以前，贾思勰著的齐民要术中就记载了雌马和雄驴杂交产生骡的现象， 骡比双亲更强壮、更富有耐力，这一记载可视为人类历史上最早利用杂种优势的先例。孟德尔 ( 1 8 6 5 ) 从事豌豆杂交试验，也观察到杂种优势现象并首先提出杂种活力( ( h y b r i dv i g o r ) 这个术 语。s h u l l ( 1 9 0 8 ) 首次提出了“杂种优势”这一术语( 胡延吉，2 0 0 3 ) 。其后，许多学者对玉米进 行大量的研究，玉米终于成为大规模利用杂种优势的第一个代表性作物。玉米杂交种的广泛成功 应用，对作物杂种优势利用的研究起到了很大的推动和促进作用。s t e r p h e n s ( 1 9 5 4 ) 报道了高粱 利用雄性不育系配制杂交种并在生产上得到了应用，开创了常异花授粉作物利用杂种优势的先 例。我国从上世纪3 0 年代开始对玉米杂种优势利用的研究，5 0 年代推广品种间杂交种，6 0 年代 推广双交种，7 0 年代推广单交种均获得了良好的经济效益和社会效益。我国杂交水稻的研究始于 1 9 6 4 年，经多年攻关，在1 9 7 3 年代实现了籼稻和粳稻的三系配套，并开始大面积投入生产，突 破了自花授粉作物杂种优势利用的禁区( 刘宜柏，1 9 9 9 ) ，到1 9 9 0 年杂交水稻种植面积占全国水 稻面积的一半。另在杂交小麦和杂交高粱研究方面也获得了重大进展。我国从1 9 7 0 年代末开始 从事红麻杂种优势利用的研究，已经取得重大进展。在1 9 9 0 年代以前s r i v a s t a r a t s e t a l 、 p a t i l e t a l 和祁建民等、汤永海先后报道了红麻产量性状的配合力与杂种优势表现，均认为其有 较强的杂种优势，优势组合可比对照增产3 0 - 4 0 。中国农科院麻类研究所经过多年的努力，研 究出了一套红麻杂优化学杀雄制种技术，采用化学药剂杀雄，人工授粉的方法，杀雄效果在9 0 以上，杂种纯度可达9 0 以上。并在生产上率先开展了红麻杂种优势f l 、f 2 的利用研究和推广， 取得了可喜的成果 陈安国，2 0 0 0 3 。特别是近十年来在优良杂交组合选育、杂交红麻制种方法、 杂交红麻利用和推广上形成了一套较为系统的研究体系和应用模式，加之近几年发现的红麻雄性 不育材料，更进一步促进了红麻杂种优势的利用。尤其是李德芳等( 2 0 0 0 ) 从数十个组合中筛选 出杂种f l 、f 2 代均可利用的超高产型抗病优质杂交组合中杂红h 3 0 5 ，红麻超高产型杂种二代 的利用可大大降低种子成本，不仅使红麻杂种优势的利用在生产上大面积推广应用成为可能，而 且可显著提高麻农的经济效益和社会效益，其前景非常广阔。 1 2 雄性不育 1 2 1 雄性不育的概念 雄性不育是指雄性器官发育不良，失去生殖能力，导致不育的特性。 张天真 雄性不育性可 分为能遗传的和不能遗传的，遗传的雄性不育分为核不育和质核互作不育两种类型。 细胞核雄性不育是受细胞核不育基因控制的，核不育基因一般是隐性的，正常品种具有的可 育基因是显性的，所以细胞核雄性不育材料般只有恢复系。它和正常可育材料的杂交后代为可 育的，其f 2 代发生分离，并符合3 ：1 的分离比例。由于细胞核雄性不育无法找到稳定的保持系， 实际应用中采用了“两系法”的方法，经过测交选择，选育出不育株和可育株各占5 0 的群体， 前者相当于不育系，后者相当于保持系，不育株和可育株杂交产生下一代的“两系”。 2 中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 质核互作雄性不育( c m s ) 一般认为是受细胞质基因和核内隐性不育基因共同控制的不育类 型。当细胞质为不育，细胞核为纯合的不育基因型时植株表现为不育( s ( r f r f ) ) 。当细胞质为可 育细胞质，不管核内基因型如何，植株均表现为可育。通过测交选择或选育，可选育出保持系和 恢复系。保持系的基因型为( n ( r f r f ) ) ，它是除细胞质外，相同于不育系的等基因系。恢复系的 基因型为( n s ( r f r f ) ) ，同不育系的杂交后代是1 0 0 可育的。 1 2 2 雄性不育材料的获得 获得雄性不育材料是选育不育系的前提，其主要途径是远缘杂交。通过自然突变株的转育也 可以获得不育系，通过入工诱变，在一定的条件下也可以获得不育株，从而转育出不育系。 1 2 3 不育系和保持系的选育方法 ( 1 ) 远缘杂交核置换 不同物种或类型，由于亲缘关系较远，遗传差异较大，质核之间会有一定分化，杂交后代常 常会产生不育株，将此不育株做母本与原父本或类似品种回交，后代若能保持不育，则表示此乃 质核互作产生的不育，继续回交多代，就可育成不育系和保持系。 ( 2 ) 回交转育 在有不育系或不育材料的基础上，为了丰富不育系的类型，可用回交转育的方法选育同质异 核的新不育系。 ( 3 ) 保持系的选育 利用大田发现的不育株或人工诱变获得的不育株，可以通过杂交、项交、自交，测定进行保 持系的选育。 雄性不育系必须在大群体下通过鉴定，且不育性稳定彻底，自交不结实：不育性能够稳定遗 传，不因环境变化和多代回交而改变：群体的农艺性状整齐一致，与它的保持系相似；雌性器官 发育正常，能接受可育花粉而正常结实。不育系还要具有配合力好，优良性状多；恢保面广可 恢复性好；具有良好的花器结构和开花习性，异交率高；品质好，抗逆性好。 1 2 4 恢复系的选育 恢复系选育一般采用测交筛选、杂交、回交转育等方法。 3 中国农业科学院硕上学位论文第一章文献综述 曼皇曼i i _ i i ；一_ 一一一一一ii 一一i _ ；m = - - 一 基 1 3 ，红麻雄性不育的研究进展 红麻是耐逆性强，适应性广，生长周期短的一年速生纤维作物。红麻可以用于制作纸浆， 还可以用于生产无纺布，装饰布，水面排污的吸附材料等。随着人们环保意识的加强，红麻的经 济价值越来越受到重视。在对红麻杂种优势的利用和研究中，科研工作者从未间断过对红麻不育 材料的寻找。最早报道红麻雄性不育的是p a t e ，j b ，j o y n e r ，j f ( 1 9 5 8 年) ，在1 9 7 6 年u g a l e ，s p ， k h u s p e ，s s 发现了红麻细胞质雄性不育材料，但未见其利用。其后在2 0 0 2 年我国的周瑞阳报道 发现了称之为“营养亏缺型雄性不育”红麻雄性不育材料。2 0 0 7 年1 1 月，周瑞阳课题组进一步选 育出了福3 a 、p 3 a 、7 6 3 a 、9 1 7 a 、7 2 2 a 和l 2 3 a 等六个细胞质雄性不育系。( 周瑞阳，2 0 0 8 ) 2 0 0 3 年中国农业科学院麻类研究所红麻育种课题组发现的红麻雄性不育材料，2 0 0 3 - 2 0 0 4 年 在海南三亚南繁基地的育种材料中发现了新的质核互作雄性不育材料( 李德芳，2 0 0 7 ) 。这是在红 麻雄性不育研究领域的一个突破。红麻不育系的选育将为红麻杂种优势的利用和大面积的进行红 麻杂交制种提供了新的途径。 1 4 红麻的开发利用 红麻是麻纺和造纸工业的重要原料，其传统用途是加工麻绳、麻袋、地毯等。近年来由于受 到廉价化纤产品的冲击，红麻工业开发的形势日益严峻，针对红麻纤维的吸湿性强，散水、散热 快，耐腐蚀，拉力强等特性( f r a n k ，1 9 8 8 ) ，人们从传统的纺织利用中走出来，避开与化纤产品 争夺市场的矛盾，利用其天然纤维和特殊用途的优势，拓宽红麻的应用领域。目前，我国和美国、 日本、欧盟诸国等对红麻表现出浓厚的兴趣，把红麻列为2 1 世纪“未来派”的优势作物，开展了 红麻多用途利用的基础及开发研究( 粟建光等，2 0 0 4 ) 。 1 4 。1 棉麻混纺中高档面料的开发 红麻是很好的纺织原料，其纤维中纤维素含量一般为7 0 - 7 5 ，木质素为1 3 - 2 0 ，果 胶为7 - 8 ，灰分为2 。郑来久等( 2 0 0 2 ) 对黄红麻进行了化学处理，结果发现经碱处理后的 变性黄红麻能够改善伸长、柔软度和卷曲，有利于提高黄红麻纤维的可纺性和成纱质量。东华大 学纺织学院在黄、红麻混纺纱工艺与设备方面做了初步的探索研究，并取得了一定成果。我国江 苏紫荆花纺织有限公司在国内已成功研发利用黄麻、红麻纤维与棉花混纺，开发出纯天然的纺织 材料摩维纤维，因其具有良好的通透性，吸湿性强、重量轻等特性受到消费者青睐。 1 4 。2 红麻饲料的开发 红麻蛋白质含量较高，叶片蛋白质含量在3 0 4 0 之间，种子油粕粗蛋白含量高达3 2 。红 麻有效青贮后，可消化蛋白含量较高，因而有很好的消化性。早在2 0 世纪6 0 年代中期，美国就 进行过研究，收获生长6 - 8 周的红麻作为一种高蛋白饲料源，特别适合反刍动物( w e b b e ra n d b l e d s o e ，2 0 0 2 ) 。马来西亚采用红麻作为反刍动物的饲料，饲喂试验表明，牛饲料中红麻的比例为 4 中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 2 0 - 3 0 时，最佳生长速度为日增重0 6 6 - 0 7 k g ；在反刍动物幼期，红麻具有控制寄生病的作用， 是一种非常有前景的动物饲料蛋白源，并具有商品化生产的潜力。 1 4 3 红麻种子油脂的利用 红麻种子含油分2 0 - 2 5 ，其中亚油酸含量为2 5 - 5 2 ，油酸含量在2 5 左右。红麻 红麻种子油脂可用作潜在保健食用油。m o h a m e d 等研究表明，红麻种子有较高的含油量，并且红 麻种子含有独特的脂肪酸组分( 高油酸、亚油酸和棕榈酸) ，这表明红麻油可作为食用油资源。 红麻种子中的亚油酸，其共轭亚油酸具有提高免疫力、抑制脂肪积累、降低胆固醇、调节血糖等 功效。祁建民等( 2 0 0 3 ) 用生物技术方法育成了亚油酸含量较高的红麻新型品种金光1 号，并初 步建立了由富集亚油酸转化为共轭亚油酸及其纯化的技术体系。 1 ，4 4 轻型阻燃板材的研发 我国目前生产的人造板材大多未经阻燃处理，具有重大的安全隐患。近年来，我国每年发生 火灾4 万多起，其中约2 1 火灾由木材等纤维材料引起，而住房火灾的7 0 是因木材缺乏耐火 性引起的。因此对木材及人造板进行阻燃处理十分必要。福建农林大学利用红麻茎杆为原料，采 用有机树脂型阻燃剂处理，成功开发出阻燃性能良好，阻燃效果显著的轻型板材，对补充木材市 场，保护森林资源具有重大的现实意义。 1 4 。5 红麻杆芯吸附材料的研发 红麻杆芯有极细的微腔结构，具有很强的吸收性能，因此可用作吸附剂。市场上的红麻杆芯 产品主要用于清除水中油污及土壤中化学污染。以红麻杆芯为原料制各吸附剂具有以下优点：可 完全生物降解，没有二次污染：具有疏水亲油性，吸油速度快，吸油量可达自重1 0 倍以上：持 油性好，吸油后不易外溢；可长时间浮于水面，不下沉，不松散；性价比高，使用费用较低，可 重复利用。总而言之，以红麻芯为原料制备的环境友好型吸附材料，克服了传统吸油材料的缺点， 在环保方面有广阔的发展前景，在清除水体油类污染、改善人类生存环境等方面有重要意义。 1 。4 6 生物能源的开发 严峻的能源枯竭问题成为世界关注的焦点，新的替代能源研发已成为各国科研生产的战略 重点之一。油纤兼用能源红麻耐旱、耐盐碱、生长速度快、种子产量高，是生物能源高效利用的 首选种质资源之一。红麻作为碳源，利用现有的技术可以生产出大量的甲醇；红麻生物产量巨大， 其茎杆富含纤维素可转化为乙醇，是生产燃料酒精的优良原料；种子富含油脂和粗蛋白，可生产 生物柴油。 1 5 基因标记 分子标记是继形态标记、生化标记等之后一种新的遗传标记，它是指能反映生物个体或群 5 中国农业科学院硕上学位论文 第一章文献综述 体间基因组中某种序列差异特征的d n a 片段，它直接反映了生物d n a 水平上的遗传多态性。d n a 分子标记不受基因表达的影响，可在任何发育阶段进行检测，而大多数分子标记呈共显性，因而 对隐性农艺性状的选择十分有利。此外基因组d n a 的变异极其丰富，而分子标记几乎可以表现基 因组的任何变异，并且分子标记的程序是基本相同的，所以它是方便、快捷的遗传标记手段，可 广泛用于种质资源研究、遗传图谱构建、目的基因定位、起源进化研究、分子标记辅助选择育种 等方面。 1 5 1 标记方法 标记基因就是通过一定的方法找到与目标基因连锁的分子标记，标记基因的常用方法有近等 基因系法和b s a 法。 近等基因系法近等基因系( n i ln e a r - i s o g e n i cl i n e ) 是指通过多次回交筛选到的、品系 间差异主要在于某一目标性状上的品系。理论上，除了目标基因及邻近区域不同外，其他区段应 完全一致。如果在近等基因系中检测出多态性，差异就必定在目标基因及邻近区域中，找到的标 记在这个范围内与目标基因连锁( 胡延吉，2 0 0 3 ) ，另外，近等基因系在理论上可最大限度地降 低遗传背景的差异，避免基因互作的影响( 张毅等，2 0 0 6 ) ，但近等基因系的建立需要多代回 交，周期长，而且许多作物没有或难以创建相应的n i l ，因此近等基因系法的应用受到很大的限制， 应用较少。 b s a 法( 集团分离分析法，又称分离体分组混合分析法或混合分组分析法，b u l k e d s e g r e g a t i o na n a l y s i s ) 首次由m i c h l m o r e 等( 1 9 9 1 ) 提出并成功地在苠苣中筛选出与目的基因 相连锁的标记：该方法首先从一对具有目标基因的表型差异的亲本所产生的任何一种分离群体 ( 如f 2 群体或b c if 1 群体等) 中，根据目标基因的表型分别选取一定数量的植株，构成2 个亚 群或集团。将每群的d n a 等量混合，形成两个相对性状的“基因池”( g e n ep 0 0 1 ) ，然后用合适 的分子标记对两个基因池进行分析，在两群间表现多态性的分子标记遗传上与目标性状基因座位 相连锁。在获得了与目标基因相连锁的分子标记以后，可以利用某一作图群体进行分析以便进一 步检测所得分子标记与目标性状基因的连锁程度，以及其在某已知分子图谱中或染色体上的位 置，这样才能完成真正意义上的对基因的标记定位。由于建池时使用了特定的分离群体，并且在 分组时仅对目标性状进行选择，这样可以保证其他性状的遗传背景基本相同，两个基因池之间理 论上就应主要在目标基因区段存在差异，因此两基因池又被称为近等基因池，这就排除了环境及 人为因素的影响，使研究结果更为准确可靠。b s a 法克服了很多作物难以得到近等基因系的限制， 并且比近等基因系法省时省力，是一种非常实用的基因标记定位的方法，应用非常广泛。 1 5 2 标记基因常用分子标记 1 5 2 1 限制性片段长度多态性( r f l p ) r f l p ( 限制性片段长度多态性，r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h is m ) ，1 9 7 4 年 g r o z d i c k e r 等人首创了r f l p 标记，1 9 8 0 年，首先被美国学者b o t s t e i n 用于遗传图谱的构建，现 仍被广泛使用。基本原理是用限制性内切酶酶切不同个体的基因组d n a ，产生大小不等的d n a 6 中国农业科学院硕士学位论文 第一苹文献绿述 = = m = = ,m ：= ：i ：= 。= i = mi i i i 曼! 曼! 曼曼曼曼! 曼! 曼蔓皇曼曼曼量 片段，通过电泳和s o u t h e r n 印迹转移到支持膜上，利用同位素( 如3 2 p ) 或非同位素( 如地高 辛) 标记的某一片段d n a 作为探针，使酶切片段与探针杂交，从而显示与探针有同源顺序的酶切 片段在长度上的差异。这种差异反映了i ) n a 分子水平上的变异，它可能是限制性内切酶识别位 点的改变，也可能是部分片段的缺失、插入、易位、倒位，显示出丰富的多态性。 刘玉梅等( 2 0 0 3 ) 采用该技术获得了一个与甘蓝显性雄性不育基因连锁的r f l p 标记p b n l l ， 经检测该标记与雄性不育基因的遗传距离分别为5 1 8 9 c m 和1 7 8 7 c m ，并且将该不育基因定位于 第l 和第8 条染色体上。梁业红等( 2 0 0 0 ) 对玉米的雄性不育基因( m s 3 0 ) 进行了r f l p 作图分 析，选用已知的1 8 个探针利用b s a 法进行标记筛选，利用s i b 5 群体找到了两个与m s 3 0 基因连 锁的位点，利用b c i 群体筛选到了4 个与m s 3 0 基因连锁的探针位点。 樊颖伦等用水稻抗白叶枯病基因物刀的近等基因系c b b 2 3 与其感病轮回亲本金刚( j g 3 0 ) 杂 交，构建了包含2 5 6 2 个单株的f 2 作图群体。根据日本水稻基因组计划r g p 水稻高密度图谱上的r f l p 探针对群体中的1 4 5 个感病单株进行r f l p 检测和连锁分析，获得了6 个与屁z z 紧密连锁的r f l p 分子 标记。其中r f l p 标记c 1 0 0 3 a 靠着丝粒一侧，与妇船的遗传图距为0 4 c m ，为物2 殆勺图位克隆奠定 了重要基础，并将标记c 1 0 0 3 a 成功地转化为s t s 标记。 r f l p 标记的优点是：呈孟德尔式共显性遗传，可以区分纯合体和杂合体：稳定性高，重 复性好；不存在表型效应，不受组织、个体发育阶段和环境条件影响；( 虿) r f l p 标记普遍存在于 各种生物的基因组d n a 中，有丰富的多态性：菲等位的r f l p 标记之间无上位互作效应。所 以说r f l p 比较适合于与b s a 法结合进行基因标记定位，但是它的缺点也是非常明显的，如需要 定数量的已知d n a 探针，多态位点信息含量低，操作过程复杂，需要的d n a 质量高，数量也大， 实验成本高，这些都使r f l p 的实际使用受到了很大的限制，应用较少。 1 5 2 2 简单重复序列区间标记( i s s r ) i s s r 标记技术由加拿大蒙特利尔大学z i e t k i e w i c z 等于1 9 9 4 年提出。它用锚定的微卫星d n a 为引物，即在s s r 序列的37 端或5 端加上2 - 4 个随机核苷酸，在p c r 反应中，锚定可以引起 特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间d n a 片段进行p c r 扩增。所扩增 的i n t e r s s r 区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳得以分辨，扩增带多为 显性表现。 i s s r 标记在分析和应用上比r f l p 、a f l p 和s s r 更加简便、快捷，而又能揭示出比r a p d 更 多的多态性i s s r 标记为显性标记，符合孟德尔遗传的规律。 在b s a 分析法中有常用到的分子标记还有i s s r ( 简单重复序列间区，i n t e r s i m p l es e q u e n c e r e p e a t ) 标记技术。i s s r 标记技术是一种在p c r 中直接使用微卫星序列进行d n a 扩增的分子标记 技术，该技术结合了r a p d 标记技术和s s r 标记技术的一些优点，如实验操作简单、多态性高、 重复性好等，也是一种较适合于与b s a 分析法结合进行基因标记定位的较好的分子标记技术，如 l i ub a o - s h e n 等( 2 0 0 2 ) 对k 型细胞质雄性不育恢复基因进行了i s s r 标记。 d y c p - 3 4 a 琼脂糖水平电泳槽( 北京六一) ；( 1 0 ) d r a g o n 移液器；( 1 1 ) 其他仪器： 小型高速台式离心机、液氮罐、水浴锅、磁力加热搅拌器、p h 计、微型漩涡混合仪以及其他实验 室常用器材等。 3 1 3 2 试验药品 t r i s 、浓盐酸、e d t a ( 乙二胺四乙酸二钠) 、c t a b 、p v p 、1 3 一巯基乙醇、氯仿、异戊醇、无 水乙醇、n a o h 、n a c i 、溴化乙锭( e b ) 、溴酚蓝、甘油、琼脂糖、核糖核酸酶a 、t a q 酶、d n t p s 、 l o b p 随机引物、双蒸水( d d w ) 、d n am a r k e r 等。( 以上试剂除e b 、8 一琉基乙醇、琼脂糖、t a q 酶、 d n t p s 为国外进口外，其它均为国产) 。 3 1 3 3 药品的配制 ( 1 ) o 5 m o l le d t a ：称取1 8 6 1 9n a 2 e d t a 2 h 2 0 和2 0 9 n a o h 溶解在8 0 0 m ld d w 中，再用i o m 的n a o h 调p h 至8 0 ，最后定容至l l 。 中国农业科学院硕士学位论文第三章红麻雄性不育基因的i s s r 标记 ( 2 ) i m o l lt r i s - c l ：在8 0 0 m ld d w 中溶解1 2 1 9 t r i s 碱，用浓盐酸调p h 至8 0 ，加水定容至1 l 。 ( 3 ) 洗涤缓冲液：0 5m o l ln a c i ，l o o mm o l lt r i s - c l ，5 0 mm o l le d t a ，3 b 一巯基乙醇( 用 前加) ，2 n a 2 c 0 3 ，2 p v p 。 ( 4 ) 2x c t a b 提取缓冲液：2 c t a b ，l o o mm o l lt r i s - c l ( p h 8 。o ) ，2 0 mm o l le d t a ( p h 8 o ) ，1 4 m o l ln a c i ，2 n a 2 c 0 3 ，2 p v p ，3 1 3 一巯基乙醇( 用前加) 。 ( 5 ) 沉淀缓冲液( 1xc t a b ) ：1 c t a b ，5 0m m o l lt r i s - c l ( p h 8 0 ) ，1 0 m o l le d t a ( p h 8 o ) ( 6 ) t e 缓冲液：l o m m o l lt r i s c 1 ( p h 8 0 ) ，i m m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，取i m li m o l lt r i s c 1 ， 0 2 m l o ，5 m o l le d t a ，加d d w 定容至1 0 钿l 。 ( 7 ) 氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ：i r9 6 m i 氯仿和4 m l 异戊醇，二者充分混匀，保存在棕色试剂瓶中。 ( 8 ) 7 0 乙醇：取7 0 m l 无水乙醇，用d i ) w 定容至1 0 0 m i 。 ( 9 ) 5 0 x t a e 电极缓冲液：称取2 4 2 9t r i s 碱溶于适量d d w 中，加5 7 1 m 1 冰乙酸，再加i 0 0 m i 的 0 5 m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，用冰乙酸调p h 至8 0 ，然后加d d w 定容至1 l 。 ( 1 1 ) 加样缓冲液：2 0 ( v v ) 甘油，0 1m o l l 的n a 2 e d t a ( p h 8 0 ) ，0 2 5 溴酚蓝( w v ) 。 ( 1 2 ) 溴化乙锭溶液：在i 0 0 id d w 中溶解1 9 溴化乙锭，充分混匀后避光保存；工作液0 5pg m l 。 注意e b 必须充分溶解。 3 1 4 实验方法 3 1 4 1 建池分离群体的获得 本研究采用b s a 法进行分析。2 0 0 6 年夏在沅江以1 5 5 号为母本，用l 。捌作父本进行杂交，于 2 0 0 7 年春在三亚种植f 1 代，于2 0 0 7 年夏在沅江种植f 2 代，观察其育性分离情况。从分离的群 体中选择完全可育的单株6 株，完全不育的单株6 株。用c t a b 法( 白凤虎，2 0 0 7 ) 提取各单株 的d n a 并将其等量混合，建立不育基因池和可育基因池。用于进行i s s r 引物的筛选。 3 1 4 2 基因组d n a 的提取 用于构建基因池的d n a 可以是先分别提取各建池单株的d n a ，然后等量混合，也可以分别取 等量的叶片混合后再提取d n a ，其中后者较为简便，因此本研究选择的是后一方法。提取方法参 照程舟( 2 0 0 2 ) 、肖璇( 2 0 0 5 ) 等的方法并加以改进。 1 ) 研磨：称取0 4 新鲜叶片放入预冷研钵( 陶瓷研钵，玻璃研钵会破裂) 中，加液氮迅速 充分研磨。 2 ) 洗涤：将粉末转入另一干净研钵，立即加入i 0 0 0l a1 洗涤缓冲液后，迅速研磨使粉末与 洗涤液混合均匀，转入1 5 m 1 离心管，1 6 0 0 0 9 离心5 m i n ( 4 ) ，弃上清，再加入1 0 0 0 i ll 洗涤缓冲液，并将其转入研钵研匀，再离心弃上清。 3 ) 温浴：向沉淀中加入7 0 0l a1 6 5 c 预热2 c t a b ，转入研钵用力充分研磨，重新转入离心 管，放入6 5 水浴中保温3 0 - 6 0 m i n 。 2 1 中国农业科学院硕上学位论文第三章红麻雄性不育基冈的i s s r 标记 4 ) 抽提：1 2 0 0 0 9 离心3 m i n 将上清转入新的离心管，加等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 轻 轻摇动2 m i n ( 可根据具体情况调整摇动时间，摇动时间不可太长，否则将严重影响d n a 的产量) ，室温1 2 0 0 0 9 离心l o - 1 5 m i n ，小心吸取上清，用氯仿异戊醇重复抽提一次。 5 ) 沉淀：加入等体积的l c t a b 室温静置1 h 以上或过夜。 6 ) 溶解：1 2 0 0 0 9 离心5 m i n ，向沉淀中加1 4 mn a c l3 0 0 ul ，轻弹离心管，使沉淀充分溶 解，如果有不溶物，则离心除去不溶物。这一步非常重要，这样既可除去不溶性杂质， 又可除去一部分可溶性的多糖等杂质。 7 ) 再沉淀：加2 3 体积即2 0 0ul 的异丙醇，轻轻混匀，静置l o m i n ，1 2 0 0 0 9 离心5 m i n 。 8 ) 洗涤：7 0 乙醇2 0 0 pl 洗涤沉淀1 次，用以除去d n a 中的n a c l 等杂质。7 0 乙醇中水 的存在利于盐及可溶性小分子物质等杂质的溶解，而乙醇不会溶解d n a 且容易挥发，不 会残留于所提d n a 中。 9 ) 去除r n a ：用灭菌滤纸条将酒精小心吸干，风干片刻，将沉淀溶于2 0 0u1 t e ，加入 4u1 r n a s e ( 1 0 m g m 1 ) 。3 7 保温l h 。加二倍体积的无水乙醇，一2 0 放置2 0 m i n 以上， 离心，用7 0 乙醇洗涤沉淀2 次，用灭菌滤纸条将酒精小心吸干，风干片刻，将沉淀溶 于5 0 u1 t e ，- 2 0 保存备用。 3 1 4 3d n a 质量的检测 1 、电泳检测：取2ul 于o 8 琼脂糖凝胶上，以约5 v c m 电泳1 小时左右，e b 染色2 0 2 5 分钟， 在凝胶成像系统上观察和拍照。 2 、紫外检测：将所得d n a 用超纯水稀释1 0 0 倍，在紫外一可见分光光度计上测定o d z e o 、o d z 8 0 。计 算o d 獬o d ：。以判定d n a 的质量，并计算d n a 的浓度。d n a 浓度计算公式：对于双链d n a 而言，1 o d z = 5 0 ug m l ，d n a 样品浓度( 1 ag m 1 ) = o d 2 即值x 稀释倍数x 5 0 。 3 1 4 4l s s r - p c r 反应体系的优化与建立 首先应建立稳定的、可重复的i s s r 反应体系，才能确保实验结果的准确性和可靠性。在谢 晓美等人建立的i s s r - p c r 反应体系的基础上对影响p e r 反应的各影响因子逐一进行了优化，包 括模板d n a 浓度、m 9 2 + 浓度、t a q 酶量、d n t p s 浓度、引物浓度、退火温度等；实验时严格控制其 它反应参数和反应条件，确保实验的准确性和- - i l l 性。在优化的基础上建立重复性强、准确可靠 的红麻i s s r 反应体系。 3 。1 。4 。5is s r 扩增产物的检测 利用筛选出来的