（动物学专业论文）斜纹夜蛾免疫相关蛋白βgrp的鉴定及免疫功能初探.pdf

斜纹夜蛾免疫相关蛋白 p g r p 的鉴定及免疫功能初探 专业：动物学 硕士生：俞鸣铗 指导老师：张文庆教授 摘要 昆虫在自然界中分布非常广泛，在生物界中占有重要的地位。昆虫无获得性 免疫系统，在长期的进化过程中，昆虫依靠高效的先天免疫系统对付外源微生物 的入侵。昆虫体内的模式识别分子能识别外源微生物体表特有的分子构造，例如 细菌细胞壁的脂多糖、脂磷壁酸、肽聚糖等，及真菌细胞壁的b 1 ，3 一葡聚糖。 这些模式识别分子在结合上外源微生物后，能快速启动昆虫体内的一系列免疫反 应，如：血细胞的噬菌作用、形成结节构造、包囊作用、黑化作用及激活抗菌多 肽基因的表达等。 本文以斜纹夜蛾( s p o d o p t e r al i t u r a ) 为研究对象，鉴定了斜纹夜蛾免疫相关 蛋白一1 3 1 ，3 一葡聚糖识别蛋白，并对其功能做了初步的分析。本实验用大肠杆菌 对斜纹夜蛾进行诱导，可以提高斜纹夜蛾血淋巴中免疫蛋白的含量。提取经大肠 杆菌诱导的斜纹夜蛾血淋巴s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，w e s t e r nb l o t 结果表 明，斜纹夜蛾的血淋巴中含有b 一1 ，3 一葡聚糖识别蛋白，其分子量约为7 0 k d 。用 亲和沉淀法从斜纹夜蛾血淋巴中分离纯化了6 1 ，3 - 葡聚糖识别蛋自，并进行了 初步的生物功能研究。研究发现，纯化的b 一1 ，3 一葡聚糖识别蛋白样品对大肠杆 菌t g l 具有很好的凝聚效果：而在加入昆布多糖后，降低了b 1 ，3 一葡聚糖识别 蛋白对大肠杆菌的凝聚能力。酚氧化酶活性检测结果显示，在1 3 - 1 ，3 - 葡聚糖识 别蛋白和昆布多糖共同存在时，能显著提高血淋巴中酚氧化酶的活性。此结果表 明，b 一1 ，3 一葡聚糖识别蛋白对酚氧化酶原的激活必须有1 3 - 1 ，3 - 葡聚糖的存在。 对p 一1 ，3 一葡聚糖识别蛋白的研究表明b 1 ，3 葡聚糖识别蛋白在斜纹夜蛾的免疫 反应中起着重要的作用，它能识别外源病原体体表的特异分子，并激活斜纹夜蛾 的先天免疫系统。 关键词：斜纹夜蛾先天免疫d l ，3 一葡聚糖识别蛋白亲和沉淀酚氧化酶 i d e n t i f i c a t i o na n df u n c t i o nr e s e a r c ho fa n i m m u n i t y - a s s o c i a t e dp r o t e i n - p g r p i nt h e s p e c i a l i t y ：z o o l o g y n a m e ：y um i n g - j i a s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rz h a n gw e n q i n g a b s t r a c t i n s e c t sh a v en oa d a p t i v ei m m u n i t yr e a c t i o na n dm a i n l yd e p e n do nt h e i ri n n a t e i m m u n i t yt od e f e n s et h ei n v a s i o no fm i c r o o r g a n i s m s ，s ot h e i ri m m u n er e a c t i o n sa r e v e r ye f f e c t i v e i nt h eh e m o l y m p ho ft h ei n s e c t st h e r ea r em a n yp a t t e r nr e c o g n i t i o n r e c e p t o r s ( p r r s ) ，w h i c hc a ns p e c i a l l yr e c o g n i z ep a t h o g e n a s s o c i a t e dm o l e c u l a r p a t t e r n s ( p a m p s ) o nt h es u r f a c eo ft h em i c r o o r g a n i s m s ，i n c l u d i n gl i p o p o l y s a c c h a r i d e ( l p s ) ，l i p o t e i c h o i ca c i d ( l t a ) ，p e p t i d o g l y c a n ( p g n ) ，o nt h es u r f a c eo fb a c t e r i aa n d b l ，3 一g l u c a no nt h es u r f a c eo ff u n g i a f t e rt h ep r r sb o u n dw i t ht h ep a m p s ，t h e i n n a t ei m m u n i t yw a s a c t i v a t e d ，a n dt h ec o m p o u n dc o u l dt r i g g e rd i v e r s er e s p o n s es u c h a sp h a g o c y t o s i s ，n o d u l ef o r m a t i o n ，e n c a p s u l a t i o n ，m e l a n i z a t i o n ，a n ds y n t h e s i so f a n t i - m i c r o b i a lp e p t i d e s p r o t e i n s a f t e ri n d u c e db ye s c h e r i c h i ac o l i ( ec o l i ) ，t h ec o n c e n t r a t i o n so fp r o t e i n sw e r e e n h a n c e di nt h eh e m o l y m p ho fs p o d o p t e r al i t u r a t h et o t a lp r o t e i n sw e r es e p e r a t e d o nas d s p o l y a c r y l a m i d eg e la n dt h e naw e s t e r nb l o ta n a l y s i sw a s p e r f o r m e d t h e a n t i b o d y c o u l dc r o s s r e a c tw i t ha7 0 k dp r o t e i n ，a n dw ep u r i f i e dt h i s7 0 k d 1 1 1 b l ，3 一g l u c a nr e c o g n i t i o np r o t e i n ( b g r p ) f r o mt h eh e m o l y m p hb yt h em e t h o do f i m m u n o p r e c i p i t a t i o n w ef o u n dt h a tt h ep u f f e dp r o t e i nc o u l da g g r e g a t eec o l ii nt h e a b s e n c eo f l a m i n a f f n a s s a y o fp h e n o l o x i d a s e ( p o ) a c t i v i t ys h o w e dt h a ta s i g n i f i c a n t l yh i g h e ra c t i v a t i o nw a so b s e r v e di ft h e1 3 g r pw a si n c u b a t e dw i t hp l a s m a c o n t a i n i n gl a m i n a r i n t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a ti b g r pp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h e i m m u n es y s t e mo fs p o d o p t e r al i t u r a ，a n dt h ef u n c t i o n o ft h e7 0 k d6 g r pi st o r e c o g n i z ep a t h o g e ns u r f a c em o l e c u l e sa sn o n s e l fa n ds u b s e q u e n t l yt oa c t i v a t et h e i n n a t ei m m u n er e s p o n s e so fs p o d o p t e r al i t u r a k e yw o r d s ：s p o d o p t e r al i t u r a ， p h e n o l o x i d a s e ， i n n a t ei m m u n i t y ，b - 1 ，3 g l u c a nr e c o g n i t i o np r o t e i n ， l r n m u n o p r e c l p l t a t l o n 中山大学硕七学位论文 a l p a p b s a d d h 2 0 d t t ec o l i e d t a e p 管 h r k d m m g m l n m l m m o d p a g p a m p p b s p o p p 0 p r r r p m r 一2 5 0 缩写词表 a l k a l i n ep h o s p h a t a s e a m m o n i u mp e r s u l f a t e b o v i n es e r u ma l b u m i n d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 1 4 一d i 山i o t h r e i t o l e s c h e r i c h 胁c o l i e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e p p e n d o r f t u b e g r a m h o u r k i l o d a l t o n m o lp e rl i t e r m i l l i g r a m m i n u t e m i l l i l i t e r m i h i m o i 1 i t e r o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a m i d eg e l p a t h o g e n a s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a t t e r n p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p h e n o l o x i d a s e p r o p h e n o l o x i d a s e p a t t e r nr e c o g n i t i o nr e c e p t o r r e v o l u t i o np e rm i n u t e c o o m a s s i eb r i l l i a n tb 】u e 碱性磷酸酶 过硫酸胺 牛血清白蛋白 双蒸水 二硫苏糖醇 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 e p p e n d o f f 离心管 克 小时 千道尔顿 摩尔每升 毫克 分钟 毫升 毫摩尔每升 光密度 聚丙烯酰胺凝胶 病原体相关模式分 子 磷酸盐缓冲液 酚氧化酶 酚氧化酶原 模式识别受体 每分钟转速 考马斯亮蓝r 2 5 0 斜纹夜蛾免疫相关蛋白bg r p 的箍定及免疫功能初探 只l i t u r a s d s s d s p a g e s e c t e m e d 砀s w v i j g r p s p o d o p t e r al i t u r a s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 斜纹夜蛾 十二烷基硫酸钠 s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i ss d s 一聚丙烯酰胺凝 胶电泳 s e c o n d秒 n ，n ，n ，n t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 四甲基乙二胺 t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) 一a m i n o m e t h a n e三( 羟甲基) 氨基甲 烷 w e i g h v o l u m e 重量体积比 b 一1 ，3 - g l u c a nr e c o g n i t i o np r o t e i np 一1 ，3 - 葡聚糖识别 蛋白 斜纹夜蛾免疫相关蛋白bg r p 的鉴定及免疫功能初探 第1 章前言 无脊椎动物在其短暂的生命周期过程中，要面对为数众多的外源微生物、 寄生生物的威胁，无脊椎动物依靠一套高效的免疫体系来保护自己免受这些威 胁的伤害。 无脊椎动物缺乏获得性免疫系统，它们主要依靠高效的先天免疫系统来抵 御外源微生物的入侵( h o f f m a n n ，1 9 9 9 ) ，但是先天免疫系统缺乏特异性，对外 源微生物的一些特征缺乏记忆能力，因此它的作用方式与脊椎动物的应激反应 很相似( h u l t m a r k ，1 9 9 3 ) ，同时，先天免疫系统在进化过程中是很保守的 ( j a n e w a y m e d z h i t o v ，2 0 0 2 ) 。 昆虫的先天免疫系统又可以分为体液免疫反应和细胞免疫反应两方面。体 液免疫包括抗菌肽( l o w e n b e r g e r ，2 0 0 1 ) 、氮和氧的活性中间产物的产生( b o g d a n e ta 1 ，2 0 0 0 ) 和调控血淋巴凝集和黑化的酶联反应( g i l l e s p i ee ta 1 ，1 9 9 7 ) ；细 胞免疫指血细胞介导的免疫反应，如吞噬、结节和包囊作用等( s c h m i d te t a l ， 2 0 0 1 ) 。昆虫血细胞是昆虫细胞免疫的主要执行者，它们可以将外源入侵物吞 噬、形成结节或包囊杀死，在昆虫抵抗外源微生物的侵染时起着重要作用( 胡 建& 符文俊，2 0 0 3 ) 。 外源微生物侵入无脊椎动物后，首先要面对类被称为模式识别受体 ( p r r ) 的蛋白，这类蛋白能够识别外源微生物表面保守的病原体相关模式分 子( p a m p s ) ( 张嵘等，2 0 0 4 ) ，这些病原体相关模式分子在绝大部分微生物表 面都存在，比如脂多糖( l p s ) 、肽聚糖( p g n ) 、b 一1 ，3 - 葡聚糖、脂磷擘酸( l t a ) 等( g i l l e s p i ee t a l ，1 9 9 7 ) 。 模式识别受体识别外源微生物后能激活不同的信号通路，来调控一些特殊 基因的表达。它们在识别外源微生物表面的脂多糖、肽聚糖和b l ，3 葡聚糖等 病原体相关模式分子后最终会激活昆虫体内的酚氧化酶( p o ) 活性，酚氧化酶 在昆虫体内以酚氧化酶原的形式存在，其活性的激活是一个蛋白水解酶级联反 应，该级联反应有几种丝氨酸蛋白酶及其抑制因子参与( l e ee ta 1 ，2 0 0 0 ：o c h i a i & a s h i d a ，2 0 0 0 ) 。这个过程大致可以表述如下：无脊椎动物体内的模式识别受 中山大学硕上学位论文 体识别并结合外源微生物( 如细菌) 表面的病原体相关模式分子，随后结合复 合物激活一系列丝氨酸蛋白酶的活性，其中的一种丝氨酸蛋白能切割酚氧化酶 原( p p o ) 产生有活性的酚氧化酶( p o ) ( j i a n g e la 1 ，1 9 9 8 ) ，酚氧化酶能将酪 氨酸氧化成对微生物具有毒性的醌( a s h i d a & y a m a z a k i ，1 9 9 0 ) ，产生的醌能转 移并沉积到外源微生物上，杀死外源微生物( s u g u m a r a n ，2 0 0 1 ) 。无脊椎动物 利用这些数量相对较少的模式识别受体来识别为数众多的外源微生物，这样的 免疫系统对于结构较为简单的无脊椎动物来说，无疑是较为经济的。 本文拟对昆虫幼虫体内的一种模式识别蛋白b 一1 ，3 一葡聚糖识别蛋白进行研 究。1 3 - 1 ，3 一葡聚糖识别蛋白是广泛存在于昆虫等无脊椎动物体内的一类模式识别 受体，b 1 ，3 葡聚糖识别蛋白在昆虫体内呈组成型表达，在有外源微生物( 如 ec o l i ) 诱导的条件下，其表达量会迅速上升( w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) ，表达的主 要位置是昆虫体内的脂肪体，也有的主要在血淋巴中表达( w a n ge t a l ，2 0 05 ) 。 目前利用分子生物学手段已经克隆出了一些昆虫编码b 一1 ，3 一葡聚糖识别蛋白的 基因( z h a n ge t a l ，2 0 0 3 ：f a b r i c ke t a l ，2 0 0 3 ：f a b r i c ke t a l ，2 0 0 4 o c h i a i a s h i d a ，1 9 9 9 ；m a & k a n o s t ，1 9 9 9 ；w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 。1 3 - 1 ，3 - 葡聚糖识别蛋 白包括两个结构域：c 端结构域和n 端结构域，c 端结构域与从细菌及海胆中 分离得到的b 一1 ，3 一葡聚糖酶的结构非常相似，但是由于几个催化反应关键位置 上的氨基酸残基被替换，导致其缺乏葡聚糖酶的活性( o c h i a i & a s h i d a ，1 9 8 8 ) 。 6 1 ，3 一葡聚糖识别蛋白不能如同抗菌肽那样直接杀死外源微生物( r a t c l i f f ee t a 1 ，1 9 8 5 ) ，它们主要负责识别那些入侵的微生物，随后启动蛋白水解酶级联反 应，激活酚氧化酶的活性，再产生对外源微生物有毒性的醌，醌能沉积到外源 微生物上将其杀死。 本实验的主要内容是：1 ) 确定诱导条件。确定ec o l i 对斜纹夜蛾是否有诱 导作用，同时确定诱导的最适条件，包括ec o l i 的注射浓度及诱导时间：2 ) 鉴 定斜纹夜蛾体内是否存在b 一1 ，3 一葡聚糖识别蛋白。对诱导斜纹夜蛾后得到的血 淋巴进行s d s p a g e ，再用抗b 一1 ，3 葡聚糖识别蛋白的多克隆抗体做w e s t e r n b l o t 来检测斜纹夜蛾体内是否存在1 3 - 1 ，3 葡聚糖识别蛋白；3 ) 纯化1 3 - 1 ，3 一葡聚 糖识别蛋白。利用亲和沉淀的原理，将能与6 1 ，3 一葡聚糖识别蛋白特异结合的 不溶性多糖一凝胶多糖( c u r d l a n ) 或可溶性多糖一昆布多糖( l a m i n a r i n ) 加入血 斜纹夜蛾免疫相关蛋白bg r p 的箍定及免疫功能初探 淋巴中，经过孵育、洗脱步骤，得到初步纯化的蛋白样品；4 ) 凝聚实验。将初 步纯化的p 一1 ，3 一葡聚糖识别蛋白加入ec o l i 菌液中，与对照比较，观察加入p l ，3 一 葡聚糖识别蛋白后，菌体的凝聚情况：5 ) 酚氧化酶活性检测。往血淋巴里加入 多巴胺底物、l a m i n a r i n 等物质，与对照比较，观察其酚氧化酶活性的变化。 中山人学硕上学位论文 第2 章诱导条件的确定 斜纹夜蛾( s p o d o p t e r al i t u r a ) ( 鳞翅目、夜蛾科) ，分布北起黑龙江、南抵 广东、广西，东起沿海各省，西达陕西、四川、云南，又名莲纹夜蛾、斜纹夜 盗蛾等。斜纹夜蛾是一类杂食性和暴食性害虫，寄主范围相当广泛，包括：甜 菜、棉花、芝麻、玉米、麻类、烟草、青椒、茄子、马铃薯、黄瓜、西葫芦、 豇豆、架豆、茴香、胡萝b 、芹菜、菠菜、韭菜等多种蔬菜及其他植物1 7 0 余 种，其幼虫被菜农俗称为大食虫，对农业生产造成的危害相当严重。 b 1 ，3 一葡聚糖识别蛋白在昆虫体内呈组成型表达，用e c o l i 等外源微生物诱 导后，斜纹夜蛾血淋巴中的b 1 ，3 葡聚糖识别蛋白等蛋白的浓度会迅速提高 ( w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 诱导条件确定的方法是，用不同浓度的大肠杆菌细胞诱导，分别于诱导后 的1 2 、2 4 、3 6 、4 8h r 取其血淋巴进行蛋白电泳；通过对比总蛋白的s d s p a g e 电泳图，确定斜纹夜蛾的最适诱导条件。 2 1 材料与方法 2 1 1 虫源与菌株 2 1 1 1 供试昆虫： 斜纹夜蛾( s p o d o p t e r al i t u r a ) ：由本实验室养虫室提供 2 1 1 2 菌种： 火肠杆菌t g l ：本实验室保存 2 1 2 主要试剂与仪器 4 斜纹夜蛾免疫相关蚩白bg r p 的鉴定及免疫功能初探 2 1 2 i 主要试剂与溶液 l b 液体培养基：o 5 y e a s te x t r a c t ，1 t r y p t o n e ，1 n a c l ，p h 7 0 。 生理盐水：0 7 9n a c i ，o 0 1 9m g c l 2 ，0 0 2 9k c i ，0 0 1 5 9n a h c 0 3 ，o 0 1 9c a c l 2 ， o 0 2 9n a h 2 p 0 4 ，0 7 9 葡萄糖，加双蒸水定容至1 0 0 m 。 3 0 丙烯酰胺母液：1 4 5 9 丙烯酰胺与o 5 9n ，n - 亚甲叉双丙烯酰胺溶于 4 0 m l 双蒸水( d d h 2 0 ) 中，3 7 。c 溶解，定容至5 0 m l ，滤纸过滤，4 。c 保存。 分离胶缓冲液( p h8 9 ) ：1 8 1 6 9t r i s ，8 0 m ld d h 2 0 ，用1 m h c i 调节p h 至 8 , 9 ，终体积为1 0 0 m 。 浓缩胶缓冲液( p h6 8 ) ：6 0 6 9t r i s ，4 0 m ld d h 2 0 ，用1 m h c i 调节p h 至 6 8 ，终体积为5 0 m l 。 5 电泳缓冲液：1 5 1 4 9t r i s ，9 4 9 甘氨酸，5 9s d s ，加d d h 2 0 定容至1 l ， 使用时用双蒸水稀释至i 工作液。 1 0 过硫酸铵溶液：0 1 9 过硫酸铵，加d d h 2 0 至l m l ，4 。c 保存( 此溶液 最好新鲜配制) 。 1 0 s d s 溶液：0 1 9s d s ，加d d h 2 0 至1 m l ，室温保存。 2 样品缓冲液：4 0 m l0 5 mr i f f s h c l ( p h 6 8 ) ，4 0 m l 甘油，4 0 m l2 0 s d s ， 1 0 m l0 1 溴酚蓝，2 0 m l1 3 - 巯基乙醇，加d d l q 【2 0 至2 0 m l 。 染色液：5 0 甲醇，1 0 冰醋酸，4 0 d d h 2 0 ，0 2 考马斯亮兰r 一2 5 0 。 脱色液i ：5 0 甲醇，1 0 冰醋酸，4 0 d d h 2 0 。 脱色液i i ：5 甲醇，7 冰醋酸，8 8 d d h 2 0 。 2 1 2 2 主要仪器 台式恒温振荡器( 江苏太仓市实验设备厂) ，显微镜( z e i s s ) ，低温离心机 ( s i g m a ) ，血球计数板，电子天平( s a r t o r i u s ) 。 2 1 2 方法 2 1 2 1 细菌培养 无菌条件下，按1 ：1 0 0 的比例，接l o o i t l 大肠杆菌t g i 菌种于1 0 m ll b 5 中山大学硕士学位论文 液体培养基中，3 7 * ( 22 0 0 r p m 振荡过夜。次口，将摇好的菌液于4 c5 0 0 0 9 离 心1 0m i n ，弃上清，沉淀加入l m l 生理盐水溶解。 2 1 2 2细菌计数 采用血球计数板计数法，首先用移液器移取1 0 1 1 1 稀释菌液，从盖玻片一端 滴入，待菌液白行向内渗入后，静置数分钟，放在显微镜下观察计数。一般选 取计数室内四个角及中央五个中方格( 8 0 个小方格) 计数，若菌体位于小方格 上，应遵循“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则，以减少误差。计数应 重复至少3 次，取其平均值。计数完毕后，依下式计算： 每l m l 菌液菌体数= 8 0 个小方格菌体总数愿o x 4 0 0 x 1 0 0 0 0 x 稀释倍数 2 1 2 3 斜纹夜蛾血淋巴的提取 取斜纹夜蛾的幼虫，洗净后，用解剖刀剪去其一条腹足，血淋巴迅速收集 置于冰浴中的e p 管中，e p 管中应加入少量的谷胱苷肽溶液，4 下1 0 0 0 0 9 离 心5m i n ，取上清，8 0 。c 储存备用。 2 1 2 4 最佳条件的确定 取斜纹夜蛾五龄第二天的幼虫，分别注射1 5 i _ t l 四种不同浓度的菌液，并分 别继续喂养1 2 、2 4 、3 6 、4 8h r ，每隔1 2h r 取血一次，对比s d s p a g e 电泳图， 确定诱导斜纹夜蛾的最适条件。 2 1 2 5s d s 。聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 采集的血淋巴1 0 0 0 0 9 离心5 m i n 去除血细胞后，进行s d s p a g e ( l a e m m l i ， 1 9 7 0 ) 检测。分离胶的浓度为1 0 ，浓缩胶的浓度为5 ，配好胶后，将样品 与2 样品缓冲液以1 ：1 的比例混合，充分混匀后在沸水中煮5 1 0m i n ，5 0 0 0 r p m 离心1 0m i n ，取上清点样，每泳道加入1 5 , t t l 样品。按常规方法在b i o r a d 垂 直板电泳仪上电泳，先是7 0 v 的低压，待样品进入分离胶后，电压可加至1 2 0 v 继续电泳，直至结束。电泳结束后，取出凝胶置于染色液中染色约3 0m i n ，脱 色液【脱色1 h ，再置于脱色液i i 中继续脱色，脱完色的凝胶可长期保存于脱色 斜纹夜蛾免疫相关蛋白bg r p 的鉴定及免疫功能初探 2 2 结果与分析 2 2 1 蛋白电泳结果 图2 1ec o l i 诱导1 2 h r 的s d s p a g e 效果图 f i g2 1s d s p a g ea n a l y s i so ft h et o t l ep r o t e i n i nt h eh e m o l y m p hi n d u c e d b ye c o l if o r1 2h o u r 上图各泳道均加入1 5 山血淋巴样品， l i n ei 、4 、7 、9 为正常生长的斜纹夜蛾血淋巴样品： l i n e 2 为注射1 生理盐水诱导1 2h r 后的血淋巴样品； l i n e3 为注射1 0 7 个人肠杆菌细胞诱导1 2h r 后的血淋巴样品； l i n e5 为注射1 0 8 个大肠杆菌细胞诱导1 2h r 后的血淋巴样品； l i n e6 为注射1 0 9 个人肠杆菌细胞诱导1 2h r 后的血淋巴样品； l i n e8 为沣射1 0 ”个大肠杆苗细胞诱导1 2h r 后的血淋巴样品。 如图2 1 箭头所示，与未经诱导及注射过生理盐水的对照组相比，经ec o l i 诱导后的血淋巴电泳图在箭头所示位置出现了新的条带。 7 中山大学硕士学位论文 图2 2ec o l i 诱导2 4 h r 后的s d s p a g e 效果图 f i g2 2 f i g2 2s d s - p a g ea n a l y s i so ft h et o t l ep r o t e i n i nt h eh e m o l y m p hi n d u c e db yec o l if o r2 4h o u r 上幽各泳道均加入1 5 l i l 血淋巴样品， l i n e1 、4 、7 、9 为正常生长的斜纹瘦蛾血淋巴样品： l i n e2 为注射生理盐水诱导2 4b r 后的血淋巴样品； l i n e3 为注射1 0 7 个大肠杆菌细胞诱导“j 1 r 后的血淋巴样品； l i n e5 为注射1 0 8 个大肠杆菌细胞诱导2 4 1 1 r 后的血淋巴样品； l i n e6 为注射l0 9 个人肠杆菌细胞诱导“h r 后的血淋巴样品； l i n e8 为注射1 0 ”个大肠朴葡细胞诱导2 4h r 后的血淋巴样品。 与图2 1 相似，同对照组相比，经诱导的血淋巴电泳后，在箭头处出现新 的条带。 8 斜纹夜蛾免疫相关蛋白bg r p 的鉴定及免疫功能初探 2 ：l56 7 89 图2 3ec o l i 诱导3 6 1 1 r 后的s d s p a g e 效果图 f i g2 3s d s - p a g ea n a l y s i so ft h et o t l ep r o t e i n i nt h eh e m o l y m p hi n d u c e db yec o l if o r3 6h o u r 上图各泳道均加入1 5 山血淋巴样品 l i n e1 、4 、7 、9 为正常生长的斜纹夜蛾血淋巴样品； l i n e 2 为注射生理盐水诱导3 6h r 后的血淋巴样品； l i n e3 为注射1 0 7 个大肠杆茼细胞诱导3 6h r 后的血淋巴样品： l i n e5 为注射1 0 8 个大肠杆菌细胞诱导3 6l l r 后的血淋巴样品： l i n e 6 为注射10 9 个人肠杆i 暂细胞诱导3 6 h r 后的血淋巴样品： l i n e8 为注射1 0 ”个人肠杆菌细胞诱导3 6h r 后的血淋巴样品。 与前两张电泳图相比，相对应位置出现的新条带虽然还能看到，但已经变 得很弱，表明昆虫体内的免疫系统正在发挥作用，清除入侵的外源微生物。 9 中【l i 大学硕上学位论文 图2 4ec o l i 诱导4 8h r 后的s d s p a g e 效果图 f i g 2 4s d s p a g e a n a l y s i so ft h et o t l ep r o t e i n i nt h eh e m o l y m p hi n d u c e db yec o l if o r4 8h o u r 上图备泳道均加入1 5 山血淋巴样品， l i n e1 、4 、7 、9 为正常生长的斜纹夜蛾血淋巴样品： l i n e 2 为注射生理盐水诱导4 8h r 后的血淋巴样品； l i n e3 为注射1 0 7 个人肠杆菌细胞诱导4 8l l r 后的血淋巴样品； l i n e5 为注射1 0 8 个大肠杆葡细胞诱导4 8 i l r 后的血淋巴样品； l i n e6 为注射1 0 9 个大肠杆菌细胞诱导4 8i l r 后的血淋巴样品； l i n e8 为注射1 0 ”个大肠杆菌细胞诱导4 8h r 后的血淋巴样品。 从图2 4 可以看出，各条带趋向一致，表明随着时间的延长，昆虫体内免 疫系统最终将把外源微生物清除干净。 2 3 结论与讨论 昆虫体内缺乏适应性免疫的保护，因此先天性免疫对于昆虫来说至关重要。 一个有效的免疫反应首要解决的就是对外源入侵物的识别问题，也就是如何识 别“自身”和“非我”的问题。昆虫先天性免疫系统依靠一类被称为模式识别受体 ( p r r ) 的蛋白质来识别入侵的外源微生物。模式识别受体在监测到有外源微 0 斜纹夜蛾免疫相关蛋白1 3g r p 的鉴定及免疫功能初探 生物入侵后，能启动下游的一系列反应，清除外源微生物。有些模式识别受体 在体内呈组成型表达，但表达量比较低，在有外源物诱导的条件下，表达量能 在一个比较短的时间内得到比较显著的提高，所以本实验考虑用ec o l i 对斜纹 夜蛾进行诱导，使血淋巴中目的蛋白的含量尽可能提高，以便于下一步的纯化 工作。 从以上经过诱导1 2 、2 4 、3 6 及4 8h r 后取的血淋巴的s d s p a g e 效果图看 来，与未经诱导的对照组相比，经过大肠杆菌诱导后的血淋巴s d s p a g e 电泳 图中出现了一些新的条带，表明经诱导后斜纹夜蛾血淋巴中出现了一些新的蛋 白，由此可见诱导是有效果的。不过比较诱导4 个不同时段的斜纹夜蛾血淋巴 总蛋白s d s p a g e 电泳图发现，血淋巴中蛋白组成的变化并不显著。据文献报 道，在一些昆虫体内能检测到编码模式识别受体的m r n a 呈组成型表达，而在 诱导21 1 r 后，其表达量就会显著的上升( z h ue ta 1 ，2 0 0 3 ) ，而随着注射入体内 的菌体逐渐被免疫系统所清除，血淋巴中蛋白的含量也逐渐恢复正常。 确定了用ec o l i 诱导斜纹夜蛾后能诱导其免疫蛋白的表达后，在保证不影 响实验结果及考虑到实验操作的可行性后，对斜纹夜蛾的诱导条件可以初步定 为：诱导时间为1 2h r ，诱导用的菌液浓度为每1 5 i _ t l 含l o 7 个菌体。 2 4 小结 本章通过比较s d s p a g e 图确认用ec o l i 诱导斜纹夜蛾幼虫后，能提高某 些蛋白的表达量；在保证不影响实验结果及考虑到实验操作的可行性后，我们 将对斜纹夜蛾的诱导条件定为：1 5 1 u 1 含1 0 7 个菌体，诱导时间为1 2 h r 。 中大学硕上学位论文 第3 章p - 1 ，3 - 葡聚糖识别蛋白的鉴定 近年来，国际上陆续有关于b 1 ，3 葡聚糖识别蛋白的研究报告出现 ( v a r g a s a l b o r e sf & y e p i z p l a s c e n c i ag ，2 0 0 0 ；f a b r i c ke la 1 ，2 0 0 4 ) ，但国内 对于b 1 ，3 葡聚糖识别蛋白等昆虫先天免疫相关蛋白的研究工作尚处于初级阶 段，相关的报道比较少( 张嵘等，2 0 0 4 ；刘青娥等，2 0 0 4 ) 。本章主要的目的是 鉴定斜纹夜蛾体内是否存在d 1 ，3 一葡聚糖识别蛋白。 由于相近物种间b 1 ，3 - 葡聚糖识别蛋白具有很高的同源性，因此可以用一 种昆虫的抗6 一l ，3 葡聚糖识别蛋白的多克隆抗体去鉴定另一种昆虫体内是否存 在b 1 ，3 一葡聚糖识别蛋白。本实验使用合作者余小强老师提供的抗烟草天蛾 b 一1 ，3 一葡聚糖识别蛋白的多克隆抗体来鉴定斜纹夜蛾体内是否存在p 一1 ，3 一葡聚糖 识别蛋白。 3 1 材料与方法 3 1 1 主要试剂与仪器 3 1 1 1 主要试剂与溶液 硝酸纤维素膜：o p t i t r a nb a s8 3r e i n f o r c e dn c ( s c h l e i c h e r & s c h n e l l 公司) 转移缓冲液：o 5 8 2 9t r i s ，o 2 9 3 9 甘氨酸，o 0 3 7 5 9s d s ，用d d h 2 0 定容至 8 0 m l ，临用时加2 0 m l 甲醇。 t t b s 缓冲液：2 5 m ll mt r i s h c l ( p h 8 o ) ，5 0 m l3 mn a c l ，1 1 m l0 2 5 m k c i ，5 0 9 lt w e e n - 2 0 ，用d d h 2 0 定容至l o o m l 。 封闭液：3 5 9 脱脂奶粉，用t 1 b s 缓冲液定容至5 0 m l 。 丽春红染色液：0 1 9 丽春红，5 m l 乙酸，用d d h 2 0 定容至1 0 0 m l 。 低分子量标准蛋白质( 华美生物工程公司) ：1 4 4 k d 一9 7 4 k d 。 碱性磷酸酶( a l p ) 显色试剂盒( 华美生物工程公司) ：1 0 0 1 t lb c i p ，1 0 0 9 l n b t 与5 m l 显色工作液混合。 斜纹夜蛾免疫相关蚩白bg r p 的鉴定及免疫功能初探 抗为美国的余小强老师提供的多克隆抗体，羊抗兔二抗抗体购自华美生 物工程公司。 3 1 1 2 主要仪器 蛋白电泳仪( b i o r a d ) 、半干转印仪( b i o r a d ) 、转移脱色摇床( 深华 公司) 3 1 2 方法 3 1 2 1b 一1 ，3 葡聚糖识别蛋白的鉴定 依最适条件诱导斜纹夜蛾后，取l m l 血淋巴1 0 0 0 0 9 离心5m i n 去除血细胞， 所得的血浆先跑s d s p a g e 电泳，再做w e s t e r nb l o t 实验检测。w e s t e r nb l o t 的 具体步骤参照半干转印仪的仪器说明及相关参考书的介绍( 曹亚，2 0 0 3 ) 如下： a 取得的血浆按前述的方法做s d s p a g e ，完毕后，取下凝胶，将凝胶做适 当的修饰，并在胶的右下角切下- 1 j , 块，以便区分正反面； b 将凝胶、硝酸纤维素膜及滤纸浸没在转移缓冲液中至少3 0m i r a c 浸泡完毕后，将滤纸、硝酸纤维素膜及凝胶按顺序叠起，最下层是滤纸， 中间为硝酸纤维素膜，上面是凝胶，最上层为另一层的滤纸，组成一种类 似”三明治”的结构移入半干转印仪中，并用试管将残存于”三明治”结构中 的气泡赶出； d 接通电源，设置电压为1 2 v ，电转移约3 0m i r a e 电转完毕后，取出硝酸纤维素膜，用丽春红染色液染色约5m i n ，检查蛋白 质的转移情况； f 用d d h z o 冲洗染好色的硝酸纤维素膜，将显色后的硝酸纤维素膜按泳道剪 成几条小的条带，每条条带都要做好标记以便分辨正反面，其中含m a r k e r 的条带可以用铅笔在显色的相应位置作上标记； 譬切割好的条带放入- d , 培养皿中，加入适量的封闭液，封闭至少l l r ： h 准备几个小塑料袋，每个小塑料袋装一条条带，加入稀释的一抗溶液( 一 抗用封闭液稀释1 0 0 0 倍) ，排尽塑料袋中的气泡后，将塑料袋封口，孵育 中山大学硕士学位论文 约1 5h r ： i 孵育完毕，条带用t t b s 缓冲液洗三次，每次1 0r a i n i 将条带装入塑料袋中，加入羊抗兔二抗溶液( _ 二抗用t t b s 缓冲液稀释5 0 0 倍) ，孵育l h r ； k 取出条带，用t t b s 缓冲液洗两次，每次1 0m i r a 1 洗好的条带置于显色液中显色，显色时间不能过长，否则可引起本底，故 应密切观察显色过程，并在较浅的本底且达到适当显色强度时及时冲流条 带终止显色。 3 2 结果与分析 3 2 1 b 一1 ，3 一葡聚糖识别蛋白的鉴定结果 12345678 图3 1w e s t e r nb l o t 检测血淋巴中所含的模式识别蛋白 f i g3 1i d e n t i f yt h ep r r si nt h eh e m o l y m p hb yw e s t e r nb l o t 一抗为抗h e m o l i n 的多克隆抗体的杂交结果： 一抗为抗1 3 g r p - 1 的多克隆抗体的杂交结果； 一抗为抗 b g r p - 2 的多克隆抗体的杂交结果； 一抗为抗i ： ( 3 r p 的多克隆抗体的杂交结果； 副 以 一 m m m ：雪 h 斜纹夜蛾免疫相关蛋白1 3g r p 的鉴定及免疫功能初探 l i n e 5 ：一抗为抗i m m u l e c t i n 1 的多克隆抗体的杂交结果； l i n e 6 ：一抗为抗i m m u l e c t i n - 2 的多克隆抗体的杂交结果； l i n e 7 ：一抗为抗i m m u l e c l i n - 3 的多克隆抗体的杂交结果； l i n e 8 ：一抗为抗i m m u l e c t i n - 4 的多克隆抗体的杂交结果。 w e s t e mb l o t 实验结果显示：在d n a 1 3 g r p 一1 、b g r p 一2 、i m m u l e c t i n 2 及 i m m u l e c t i n 4 抗体的组中会出现特异的条带，另外在加入i m m u l e c t i n 一1 的组中 也能出现一条较浅的条带。这表明，在经诱导的斜纹夜蛾的血淋巴中存在 1 3 g r p l 、b g r p 一2 、l m m u l e c t i n 一2 、i m m u l e c t i n 一4 及i m m u l e c t i n 一1 等模式识别受 体。 3 3 结论与讨论 无脊椎动物缺乏适应性免疫系统，因此体内不能产生能特异识别入侵微生 物的抗体或者是t 细胞受体。它们主要依赖模式识别蛋白来侦测入侵微生物表 面上普遍存在的那些多糖结构，启动自身的防御反应，每个模式识别蛋白都能 结合某个特定的多糖结构，这些模式识别蛋白相互补充就能识别范围非常广泛 的外源微生物( w i l s o ne t a l ，1 9 9 9 ；1 w a n a g a ，2 0 0 2 ) ，昆虫也属于无脊椎动物， 因此它的对抗外源微生物的免疫反应也遵循相似的原则( c h r i s t o p h i d e se ta 1 ， 2 0 0