（临床检验诊断学专业论文）强力霉素抗细胞凋亡作用机制的研究.pdf

学位论文版权使用授权书 江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中 国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位 论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一 致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研 究所将本论文编入中国学位论文全文数据库并向社会提 供查询，授权中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社将本论文 编入中国优秀博硕士学位论文全文数据库并向社会提供 查询。论文的公布( 包括刊登) 授权江苏大学研究生处办理。 本学位论文属于不保密。 学位论文作者签名： 禚虹 矽1 年多月，占日 艚狮警舻坳 捌年6 月c 4 。e l 。 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指 导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用 的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签字：簇，想 日期：砷，年z 月, 5 - 日 分类号墅窆2 ：2 u d c6 1 5 密级公珏 编号 ! q 2 窆窆s q 墨! 垒q 31 硕士学位论文 强力霉素抗凋亡的作用机制研究 t h em e c h a n i s mo fd o x y c y c l i n ep r o t e c t i n g c e l l sf o r mt h ea p o p t o s i s 作者姓名： 指导教师： 小组成员： 禚娅 邵启祥教授 许化溪教授 王胜军教授 夏圣副教授 申请学位：硕士 学科专业：临床检验诊断学 论文提交同期：2 0 1 1 年4 月2 8 日 论文答辩日期：2 0 1 1 年6 月8 日 学位授予单位：江苏大学 学位授予日期：2 0 1 1 年6 月1 9 日 答辩委员会主席：陈瑜教授 评阅人： 基金资助：国家重点基础研究发展计划( 9 7 3 ) 项目( 2 0 1 1 c b 9 4 6 1 0 0 ) 国家科学基金( 3 0 6 7 1 9 8 4 和3 0 8 3 0 0 9 1 ) 江苏省自然基金( b k 2 0 0 8 2 3 1 ) 江苏大学科技创新团队( 2 0 0 8 0 1 8 - 0 2 ) 江苏大学硕士学位论文 中文摘要 第一部分 目的强力霉素( d o x y c y c l i n e ，d o x ) 是一种传统的四环素类抗 生素，近年来研究显示它还具有许多其它非抗生素的生物学效应，本 实验前期研究发现其可部分通过m a p k 途径促进小鼠胸腺上皮细胞 系( t h y m i cm e d u l l a r y t y p ee p i t h e l i a lc e l ll i n el ，m t e c1 ) 的增殖，同 时也可以通过n f k b 和m a p k 途径促进m t e c l 分泌i l 一6 和 g m c s f ，胸腺上皮细胞能促进胸腺细胞的发育、分化，因此有可能 应用于临床治疗造血干细胞移植和h i v 治疗后t 细胞免疫系统的重 建。本项研究主要探讨d o x 保护小鼠胸腺上皮细胞系( m t e c l ) 抗 凋亡作用的分子机制，为进一步探索d o x 对免疫重建的影响奠定基 础。 方法运用c c k 一8 法、h e o c h s t3 3 3 4 2 染色和r e a l t i m e 定量p c r 等技术，分别从细胞增殖和凋亡的角度，观察不同处理条件下的 m t e c l ，研究嗽2 、b c l 2 、b a x 和c a s p a s e9 基因的m r n a 水平的 变化，分析d o x 对m m c 诱导的细胞凋亡的保护作用。 结果本研究发现d o x 可通过上调抗凋亡基因t r x 一2 ，b c l 2 表 达，而下调促凋亡基因b a x 和c a s p a s e9 的表达，对丝裂霉素 ( m i t o m y c i n ，m m c ) 诱导的m t e c l 凋亡具有一定的保护作用，且 强力霉素抗细胞凋亡作用机制的研究 具有时间依赖性。 结论本研究表明d o x 能保护m t e c l 细胞抵抗m m c 诱导的细 胞凋亡，为d o x 应用于临床，保护胸腺上皮细胞( t h y m i ce p i t h e l i a lc e l l s ， t e c s ) ，以促进t 细胞的重建提供重要依据。总之，本研究为揭示了 抗生素古老家族中的一员d o x 的新作用，奠定的良好的实验室研 究基础，但d o x 对t e c s 作用的确切作用及其机制，尚需进一步的探 索。 关键词：强力霉素，小鼠胸腺上皮细胞，细胞凋亡，保护 第 二 部分 目的d o x 是一种四环素类抗生素的衍生物，具有许多非抗生素 类作用。阿尔茨海默病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 即老年痴呆症， 是一种中老年常见的中枢神经系统退行性病变。本项研究主要探讨了 d o x 对神经细胞的保护作用，为临床治疗a d 等神经退行性病变提供 新的治疗手段。 方法首先以不同浓度的d o x 进行干预，再以m m c 处理 s h s y 5 y 细胞，模拟阿尔茨海默患者脑内神经元损伤模型，然后运 用c c k 一8 法测定细胞活性，同时采用h e o c h s t3 3 3 4 2 染色后染色荧光 显微镜下观察细胞形态学变化，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡改 变，最后通过w e s t e r nb l o t 分析d o x 作用后细胞凋亡通路变化。 结果在蛋白水平，d o x 可以通过上调b c l 2 和下调b a x ，减 i i 江苏大学硕士学位论文 少c y t c 的释放，抑制c a s p a s e3 和c a s p a s e9 的活性，进而起到对 s h s y 5 y 细胞的保护作用。 结论d o x 能有效地保护m m c 诱导损伤的s h s y 5 y 细胞。因此， d o x 就有可能在临床应用于a d 等临床各种外周和中枢神经性病变疾 病，但动物模型和临床的作用及其研究尚有待于进一步深入的探索。 关键词：强力霉素，人神经母细胞瘤，抗凋亡，丝裂霉素 强力霉素抗细胞凋亡作用机制的研究 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t p a r ti o b j e c t i v ed o x y c y c l i n e ( d o x ) i sat r a d i t i o n a lt e t r a c y c l i n ea n t i b i o t i c s r e c e n t l y , m a n yr e s e a r c h w o r k sh a v es h o w nt h a ti th a s m a n y n o n - a n t i b i o t i cb i o l o g i c a lf u n c t i o n o u rp r e l i m i n a r yr e s e a r c hf o u n dt h a t t h ed o xc a nd r i v et h et h y m i ce p i t h e l i a lc e l l sl i n em t e c 1 ，am o u s e t h y m i cm e d u l l a r y - t y p ee p i t h e l i a lc e l ll i n e ，p r o l i f e r a t i o np a r t l yv i am a p k s i g n a lp a t h w a ya n du p r e g u l a t e st h ee x p r e s s i o no fi l 一6a n d g m - c s fi n m t e c1c e l l sv i an f k ba n dm a p k j e r kp a t h w a y s n o w ，w ew a n tt o i n v e s t i g a t et h ep r o t e c t i v ee f f e c t sa n dm e c h a n i s mo fd o xo nm i t o m y c i n ( m m c ) i n d u c e dm t e c 1a p o p t o s i s ，a n dt ob u i l dt h ef o u n d a t i o nf o rt h e f u r t h e re x p l o r a t i o no fd o x se f f e c to ntc e l l si m m u n er e c o n s t i t u t i o n m e t h o d sm t e c1w e r ep r e t r e a t e dw i t hd i f f e r e n td o e so fd o x a n d t h e nt h em m cw e r ea d d e dt oi n d u c e dc e l la p o p t o s i s t h es u r v i v a lr a t eo f m t e c1c e l l sw a sm e a s u r e db yc c k 一8a s s a y ，a n dt h ea p o p t o s i sd e t e c t e d b yt h em o r p h o l o g yo b s e r v a t i o nv i af l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ea f t e r t h e c e l l sw e r es t a i n e db yh o e c h s t3 3 3 4 2 t h ee f f e c to fd o xo nt h em r n a l e v e l so ft r x 一2 ，b c l 一2 ，b a xa n dc a s p a s e9i nm t e c1w e r em e a s u r e db y r e a l t i m e 王u 乙p c r r e s u l t sd o xh a sr e m a r k a b l ep r o t e c t i v ee f f e c to nm t e c1c e l l s v 强力霉素抗细胞凋亡作用机制的研究 a p o p t o s i si n d u c e db ym m c t h em r n al e v e l so ft r x - 2a n db c l - 2w e r e f o u n dt ob eu p - r e g u l a t e di nat i m e - d e p e n d e n tm a n n e ra n dt h em r n a l e v e l so fe x p r e s s i o no fb a xw a sd e c r e a s e di nm t e c1c e l l st r e a t e db y d o x f u r t h e r m o r e ，d o xw a sa l s os u p p r e s s e dt h ea c t i v a t i o no fc a s p a s e9 c o n c l u s i o n sd o xc a np r o t e c tt h em t e c1c e l l sf r o ma p o p t o s i sv i a u p - r e g u l a t i n gt r x 一2a n db c l 一2 ，a n dd o w n r e g u l a t i n gb a x ，i n h i b i t i n gt h e a c t i v i a t i o no fc a s p a s e9a f t e rt h em m ct r e a t e d i nw o r d s ，t h y m u si sa n i m p o r t a n ti m m u n eo r g a nf o rt h eg e n e r a t i o na n dm a t u r a t i o no ftc e l l s t h y m i ce p i t h e l i a lc e l l s ( t e c s ) s u p p o r tt h ed e v e l o p m e n to ftc e l l sv i a r e g u l a t i n gi t sp r o l i f e r a t i o n ，d i f f e r e n t i a t i o n ，m i g r a t i o na n dm a t u r a t i o ni n t h y m o c y t e s t h e r e b y ，o u rp r e s e n td i s c o v e r yt h a tt h en e we f f e c to fd o x m a yc o n t r i b u t et oi m m u n er e c o n s t i t u t i o no ftc e l l s k e y w o r d s ：d o x ，t e c s ，c e l la p o p t o s i s ，p r o t e c t i o n p a r ti i o b j e c t i v e d o x ，i sad e r i v a t i v eo ft h et e t r a c y c l i n e ，h a ss h o w nm a n y n o n - a n t i b i o t i ce f f e c tt h a ti n c l u d e dt h ep r o t e c t i v ef o u n c t i o no ns o m ec e l l s ， s u c ha sv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s ( v e c s ) f r o ma p o p t o s i s a l z h e i m e r s d i s e a s e ( a d ) o rt h es e n i l ed e m e n t i ai s ac o m m o nn e u r o d e g e n e r a t i v e d i s e a s ei nt h ee l d e r l yp e p o l e t h ed e s t i n a t i o no fo u re x p e r i m e n ti st of i n d s o m ec h e m i c a la g e n t sw h i c hh a v et h ep r o t e c t i v ee f f e c t so nn e u r o c y t e s f r o m a p o p t o s i s ，t h e c h e m i c a l a g e n t sm a ys i g n i f i c a n tt o t h ef u r t h e r v i p r e v e n t i o no rt h e r a p yo nt h en e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s es u c ha sa d h e r e ， w ew a n tt od e t e r m i n a t ew h e t h e rt h ed o xh a v et h er e s c u ee f f e c to nd e a t h o fn e u r o c y t e sa f t e rt r e a t e db ym m c a n dt oe x p l o r et h em e c h a n i s mo fi t s b i o l o g i c a lf u n c t i o n m e t h o d ss h s y 5 yc e l l s ，ac e l ll i n eo fh u m a n n e u r o b l a s t o m ac e l l ， w e r et r e a t e db yd o x t h ec e l ls u r v i v a lr a t ew a sm e a s u r e db yc c k 8 a s s a y , a n dt h em o r p h o l o g i c a lc h a n g e si nt h es h s y 5 yc e l l sw e r e o b s e r v e df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ea f t e rs t a i n i n gw i t hh o e c h s t3 3 3 4 2 f o r d n a t h ec e l la p o p t o s i sw a sa n a l y z e db yf c m v i ap ia n da n n e x i n ev s t a i n n i n g t h ec e l l ss i g n a lt r a n s d u c t i o nw e r ea n a l y z e db yt h er e a l t i m e p c ra n dw e s t e r nb l o t t i n g r e s u l t sd o xc a n p r o t e c tt h es h s y 5 yc e l l sf r o m a p o p t o s i si n p r o t e i nl e v e l sv i au p r e g u l a t i n gb c l - 2a n dd o w n r e g u l a t i n gb a x ，r e d u c i n g t h er e l e a s eo f c y t cf r o mt h em i t o c h o n d r i a ，a n di n h i b i t i n gt h ea c t i v a t i o n o fc a s p a s e 3 ，c a s p a s e9 c o n c l u s i o n sd o xh a st h en e u r o p r o t e c t i v ee f f e c to ns h s y 5 yc e l l s t h er e s u l ts u g g e s tt h a tt h e t a r g e t e di n h i b i t i o no fa p o p t o s i sm i g h tb e e f f e c t i v ei nt h et r e a t m e n to fv a r i o u sn e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e s ，b u ti t w a r r e n t sf o rt h ef u r t h e re x p l o r a t i o n k e y w o r d s ：d o x ，s h s y 5 y ，a n t i a p o p t o s i s ，m m c v l i 强力霉素抗细胞凋亡作用机制的研究 v i i i 江苏大学硕士学位论文 目录 第一部分d o x 对小鼠胸腺上皮细胞的抗凋亡作用及其信号转导机制的初步研 第一章绪论1 1 1 d o x 和其它四环素类药物的结构和抗菌机制i 1 2 四环素及其衍生物的非抗生素作用2 1 2 1 抑制自身免疫性疾病及其机制2 1 2 2 对神经组织的保护作用及其机制3 1 2 3 抑制肿瘤生长及其机制4 1 2 4 对牙龈组织的作用及其机制5 1 2 5 其他作用一6 1 3t c s 的临床应用7 第二章研究目的、方法、实验设计方案和意义9 2 1 研究目的9 2 2 研究方法9 2 3 实验设计方案1o 2 4 研究意义1 0 第三章d o x 对小鼠胸腺上皮细胞的抗凋亡作用及其信号转导机制的初步研究 1 1 3 1 材料与仪器1l 3 1 1 试剂1l 3 1 2 主要溶液的配制1 1 3 1 3 主要仪器和耗材l2 3 2 方法l3 3 2 1 细胞培养l3 3 2 2c c k - 8 法测定细胞增殖及抑制l3 3 2 3h e o c h s t3 3 3 4 2 染色13 3 2 4 总r n a 的提取和r e a l t i m ep c r 分析1 4 3 2 5 统计分析l9 3 3 结果1 9 3 3 1d o x 对凋亡诱导具有抵抗作用1 9 3 4 讨论2 4 第四章主要结论及展望2 7 4 1 主要结论2 7 4 2 展望2 7 i x 强力霉素抗细胞凋亡作用机制的研究 第二部分d o x 对m m c 诱导s h s y 5 y 细胞凋亡的保护作用机理研究。2 9 第一章绪论2 9 1 1 神经变性疾病和细胞凋亡的关系一2 9 1 1 1 阿尔茨海默病与凋亡2 9 1 1 2 帕金森氏病与凋亡3 0 2 1 阿尔茨海默病简介3 1 2 2 1 p 淀粉样蛋白的毒性作用3 2 2 2 2 凋亡相关基因表达失调一3 2 2 2 3 神经元细胞周期异常3 3 2 2 4 其他3 3 3 1 丝裂霉素简介3 4 第二章研究目的、方法、实验设计方案和意义3 5 2 1 研究目的3 5 2 2 研究方法3 5 2 3 实验设计方案3 6 2 4 研究意义3 6 第三章d o x 对m m c 诱导s h s y 5 y 细胞凋亡的保护作用机理研究3 7 3 1 材料与仪器3 7 3 1 1 试剂3 7 3 1 2 主要溶液的配制。一3 7 3 1 3 主要仪器和耗材3 8 3 2 方法3 9 3 2 1 细胞培养3 9 3 2 2c c k - 8 法测定细胞增殖及抑制3 9 3 2 3h e o c h s t3 3 3 4 2 荧光染色法观察细胞形态3 9 3 2 4a m n e x i n v f i t c p i 烈染检测细胞凋亡3 9 3 2 5 细胞总蛋白的提取和w e s t e r nb l o t 分析3 9 3 2 6 统计分析：4 1 3 3 结果4 2 3 3 1d o x 能保护m m c 诱导的细胞凋亡4 2 3 3 2 流式细胞术分析细胞抗凋亡效率4 5 3 3 3d o x 抵抗凋亡的信号途经4 6 3 4 讨论4 8 第四章主要结论及展望5 1 4 1 主要结论5 1 4 2 展望51 参考文献。5 3 致谢5 9 攻读硕士学位期间发表的文章6 1 x 江苏大学硕士学位论文 第一部分d o x 对小鼠胸腺上皮细胞的抗凋亡作用及其信号 转导机制的初步研究 第一章绪论 强力霉素( d o x y e y c l i n e ，d o x ) 是属于传统的四环素类抗生素家族，一般在 临床广泛应用于细菌性和原虫类感染的治疗，随着耐药株的增多而临床的应用减 少，而最近几年的研究发现四环素及其衍生物【主要是d o x 和米诺霉素 ( m i n o c y c l i n e ，m i n ) 】除了抗菌作用之外，还同时具有相当多的其它的重要生 物学活性，从而有可能开辟新的临床应用。 1 1 d o x 和其它四环素类药物的结构和抗茵机制 d o x 即多西环素，隶属于人工合成的四环素，分子量为5 1 2 9 3 。四环素类抗 生素( t e t r a c y c l i n e s ，t c s ) 最早是在1 9 4 8 年由d u g g a r 从链丝菌中发现的，四环 素类药物的名字来源于四环素的结构，多具有的四环素母核结构氢化骈四 苯，只是取代集团不同( 图1 1 ) ，属快速抑菌剂，在高浓度时也有杀菌作用。四 环素可分为天然品和半合成品两类，天然品是由链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) 产生的， 主要有金霉素、土霉素和去甲金霉素等。它们是两性物质，可与碱或酸结合成盐， 在碱性环境较易降解，在酸性液体中比较稳定，所以临床常用其盐酸盐。半合成 的四环素有多西环素即强力霉素( d o x y c y c l i n e ) 和米诺霉素( m i n o c y c l i n e ) 即二 甲胺四环素。其抗菌作用的主要原理是通过与细菌核蛋白体3 0 s 亚基的结合，干 扰t r n a 与3 0 s 亚基上的作用位点的结合，阻止a a t r n a 在该位置上的联结， 导致蛋白质合成受阻，进而达到抑菌的作用。其次t c s 可以引起细胞膜通透性 改变，使胞内的核苷酸或其它重要成分外漏，从而抑制d n a 的复制。四环素类 的抗菌谱属于比较宽泛的，对多数革兰阳性菌、革兰阴性菌、某些厌氧菌、螺旋 体、肺炎支原体、立克次体、阿米巴原虫以及疟原虫等均有作用【l 】。但与四环素 家族的其他成员相比，d o x 具有更强的亲脂性，这就增加了它在组织器官内的浓 度与穿透力，另外它的半衰期比较长，因此它的抗菌活性更强【2 】。 强力霉素抗细胞凋亡作用机制的研究 m i n o c y c ：li n e d o x y c y ：li n e 旧环豢母攘与程力霉素， a 肌3 o f r - 3 和米诺霉蠢结构 图1 1 四环素类药物氢化骈四苯及米诺霉素，强力霉素，c m t - 3 结构 f i g u r e1 1s t r u c u t u r eo ft e t r a c y c l i n en u c l e u sa n dm i n o c y c l i n e n ，d o x y c y c l i n e ，c m t - 3 1 2 四环素及其衍生物的非抗生素作用 近年来对d o x 和其它四环素类衍生物的研究发现，t c s 除了其抗菌作用以 外，其中比较突出的是四环素类药物具有抗肿瘤、抗炎症以及对细胞存活的影响。 可以用来治疗肿瘤、类风湿及风湿性关节炎、心脑血管疾病等等免疫相关的慢性 炎症性疾病。 1 2 1 抑制自身免疫性疾病及其机制 研究发现强力霉素及其它的四环素类药物能抑制某些自身免疫性疾病的发 展，其作用机理尚十分不明确，但作用是可以肯定的。主要归纳为以下几个方面： 1 2 1 1 抑制m m p s 基质金属蛋白酶( m a t r i xm e t a l l p r o t e i n a s e ，m m p s ) 的蛋白酶活性可水解关 节中的细胞外基质，当细胞外基质再次合成，胶原蛋白即大量的交联，就会造成 胶原蛋白排列混乱。s h l o p o v 研究中发现从关节炎中分离的软骨组织其m m p 1 、 2 江苏大学硕士学位论文 m m p 8 和m m p 1 3m r n a 平均比正常关节软骨组织高1 8 3 9 倍，关节炎分离的 软骨组织与强力霉素( 1 1 0m g m 1 ) 共育，三种m m p 的m r n a 均出现下调， 并能够抑制t n f 吨刺激的正常软骨组织三种m m p 基因转录【3 ；4 1 。 1 2 1 2 抑制前炎症因子或炎症因子 d a g o s t i n o 早期就报道化学修饰的四环素( c h e m i c a l l y m o d i f i e dt e t r a c y c l i n e s ， c m t s ) 中c m t - 1 和c m t - 8 能上调l p s 诱导的巨噬细胞j 7 7 4 中的i l 1 2 基因的 转录，但是对其蛋白表达是有抑制作用；却对其分泌的t n f 仅和i l 1 0 没有影响 【5 ；6 1 。也就可以说是认为四环素类药物不是直接抑制i l 10 【和t n f a 的合成，而 是可能通过对其它途径的修饰和调节，而下调l l 10 【和t n f 仪的合成。同时这个 结果也可能提示四环素类药物可以预防和治疗败血症引起的休克，抑制炎症因子 的产生。 1 2 1 3 抑制一氧化氮合成酶 a m i n 研究证明四环素类药物都具有抑制关节炎的软骨组织细胞产生与骨关 节炎相关的诱导性一氧化氮合成酶( i n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h e t a s e ，i n o s ) 的 作用。抑制l p s 和i f n - 1 , 刺激产生的i n o s 时m i n 比d o x 作用强。当然其作用 机制与乙酰基和竞争性抑制物l 精氨酸抑制i n o s 的机制并是不完全相同的，四 环素类药物对无细胞提取物的i n o s 是没有作用的。具体的作用点主要是影响 i n o s 的转录和翻译，下调i n o s 的蛋白表达以及抑制相对应的酶的活性。四环 素类对1 3 - a c t i n 和甘油醛3 磷酸脱氢酶的转录以及1 3 - a c t i n 和环氧化酶 ( c y c l o o x y g e n a s e ，c o x ) 的蛋白表达没有明显的调节作用5 ；7 1 。d a g o s t i n o 的结 果也证实了这一点，但是d a g o s t i n o 也认为c m t 可能是主要影响酶的活性，而 对其表达影响比较小【8 1 。 1 2 2 对神经组织的保护作用及其机制 脑缺血或实脑出血病灶周围就会有大量的中性粒细胞和单核细胞浸润，从而 阻塞毛细血管，损伤血脑屏障功能，损害神经元及胶质细胞。所以抑制白细胞浸 润就可以减少损伤【9 1 。有报道显示，应用d o x 和谷氨酸受体拮抗剂可改善脑缺血 后白细胞功能，减轻白细胞浸润，从而减轻迟发性缺血性神经元损害。c l a r k 等 报道，在大鼠持久性大脑中动脉梗塞模型( m c a o ) 后1 4d ，缺血区有大量细 胞( 单核细胞为主) 聚集、浸润。在动脉闭塞2 4h 内给予d o x 或抗粘附分子抗 3 强力霉素抗细胞凋亡作用机制的研究 体可显著降低白细胞浸润，阻止单核细胞向小胶质细胞转化，缩小缺血病灶，减 轻神经元经功能的损害【1 0 ；1 1 】。国内赵宁等也发现四环素和d o x 具有促进人牙周 韧带细胞的增殖作用。w a n g 应用r 6 2 小鼠建立纹状体病变的h u n t i n g t o n s 病模 型以便于研究m i n 的神经保护作用，发现神经细胞病变进程中涉及线粒体c a s p a s e 不依赖途径和c a s p a s e 依赖途径的机制，而m i n 可以通过抑制这两条途径保护神 经细胞【1 2 】。 1 2 3 抑制肿瘤生长及其机制 肿瘤是一种严重危害人类健康的恶性疾病，虽然目前治疗肿瘤的化疗药很 多，但现有的绝大多数化疗药物在抑制或杀伤肿瘤细胞的同时，也会对机体的正 常细胞产生非常严重的细胞毒性作用，且价格昂贵，病人往往不能耐受或加重患 者经济负担而限制了临床使用。所以目前寻找毒副作用少且价格低廉的药物一直 都是肿瘤治疗中研究的热点。某些t c s ，如c m t s 主要是通过抑制肿瘤细胞增殖 并直接诱导凋亡，而达到治疗原位肿瘤的目的。目前有研究证明可以被t c s 诱 导凋亡的肿瘤细胞有淋巴瘤细胞，前列腺癌、单核细胞来源肿瘤、乳腺癌、黑色 素瘤细胞、骨转移瘤和骨肉瘤等等【1 3 ；1 4 ；1 5 ；1 6 ；17 1 。 1 2 3 1 抑制m m p s t c s 抑制m m p s 的原理主要是它可以螯合酶结合部位的锌原子，阻断 p r o m m p s 转化成活性分子并可阻断后期成熟的m m p s 活性，并能下调m m p s 的表达，促使m m p s 水解以及氧化降解。 o hoa hoo l q i - 1 2 图1 2c m t - 3 的结构示意图 f i g u r e1 2 s t r u c u t u r eo fc m t - 3 1 2 3 2 抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡 c m t s 是一类缺乏抗菌活性的四环素类衍生物，全身毒性副作用较小，但是 在体内外均有显著的抑制肿瘤生长、阻止肿瘤转移和促使肿瘤细胞凋亡的作用， 4 江苏大学硕士学位论文 因此被广泛的用于肿瘤的长期性治疗中【1 引。 l o k e s h w a r 等发现c m t - 3 ( 图1 2 ) 四环素类药物能够抑制前列腺肿瘤细胞 的增殖，但是c m t - 3 较d o x 的作用强。c m t - 3 导致线粒体膜通透性和羟基自由 基的水平增加。细胞周期分析得出c m t - 3 和d o x 导致细胞停滞在g 0 g 1 期，s 期相对减少，g 2 m 略微增加而已【1 9 1 。d a g o s t i n o 等通过t u n e l 法和 e l i s a p l u s 检测凋亡细胞d n a 片段，证实了c m t 可以诱导j 7 7 4 细胞凋亡。 流式细胞术分析发现细胞出现了明显的凋亡亚g 峰，但是细胞周期没有明显的 改变。深入研究发现c m t 诱导细胞凋亡的作用能被c a s p a s e 8 抑制剂z v a d r i n k 和z i e d t - f m k 阻断或下调，因此c m t 主要通过活化c a s p a s e 8 诱导细胞凋亡， c a s p a s e 1 和c a s p a s e 3 也许与其无关。最令人感兴趣的是c m t 能够上调b c l 一2 的 水平。b c l 一2 是抗凋亡的原癌基因，但是作者认为在线粒体中有大量的b c l 2 分 子，可能与线粒体膜对离子和细胞色素c 的通透性调节有关。可惜的是作者在 其研究工作中并没有证实这一点。因此c m t 诱导细胞凋亡主要通过非线粒体途 径，而线粒体途径就可能是一旁路【2 0 1 。 1 2 4 对牙龈组织的作用及其机制 中间型普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和放线杆菌与牙周炎的关系密切，是d o x 特异病原菌【2 1 1 。d o x 为脂溶性，抗菌谱广，半衰期长，高效且易渗透入组织及体 液中，龈沟液中的药物浓度较血浆中高，是控制和治疗牙周炎的首选药物【2 2 】。 1 2 4 1 抑制m m p s t c s 与锌离子螯合，阻断m m p s 被活化并降低m m p s 活性，从而阻止牙周 炎的进一步发展【2 3 1 。t c s 抑制m m p s 的作用机制并非依赖其抗菌活性，而是去 除了有效抗菌活性基团的四环素药物，如c m t s 仍能明显抑制m m p s 的活性【2 4 】。 1 2 4 2 对骨组织细胞的影响 研究表明t c s 能通过影响成骨和破骨细胞的结构和功能从而抑制骨组织的 溶解或吸收。存在于龈沟液中的i 型胶原吡啶交联终肽( p y r i d i n o l i n ec r o s sl i n k e d c a r b o x y t e r m i n a lt e l o p e p t i d eo ft y p eic o l l a g e n ，i c t p ) 和i l 一1 是骨组织降解和吸收 特有的产物，两者均与牙周疾病活动相关。有研究显示，胶原酶的活性水平与牙 周炎症呈j 下相判2 5 1 ，在骨关节炎时，m m p s 与t i m p 之间平衡被打破，滑液中 m m p 及其他酶类活性明显增加，从而引起软骨基质蛋白多糖和胶原的发生过度 强力霉素抗细胞凋亡作用机制的研究 降解，引起软骨分解2 6 1 。另外发现有研究表明，t c s 对m m p s 活性有抑制作用， 体外试验d o x 能直接抑制m m p 2 和m m p 9 的表达，体内试验显示除此作用外， 还可以降低内毒素诱发的m m p s 合成【2 7 1 。 1 2 4 3 对牙周组织细胞的影响 牙周韧带细胞( p e r i o d o n t a ll i g a m e n tc e l l s ，p d l c s ) 是牙周软组织中主要的 功能细胞，对牙周新附着组织形成及牙周组织再生起着非常重要的作用。四环素 能提高牙周韧带细胞活性，促进细胞的增殖，蛋白合成以及d n a 合成【2 8 1 。此外， 牙周成纤维细胞能分泌粘连蛋白和纤维连接蛋白，这两种蛋白是一种化学趋化 物，有促牙龈上皮细胞的黏附作用。d o x 能促成纤维细胞的增殖、分化及上皮和 结缔组织的黏附，因此有助于损伤的牙周组织再生与重建【2 9 1 。 1 2 5 其他作用 1 2 5 1 抑制磷脂酶a 2 p r u z a n s k i 报道c m t 各型均可以抑制p l a 2 ( p h o s p h o l i p a s ea 2 ，p l a 2 ) 的 生物学活性，对分泌性的p l a 2 有抑制作用的六种c m t ，结构中四环素母核上 c 1 3a n dc 1 0 1 2 a 是相同的基团【3 0 】。 1 2 5 2 抑制m m p 活性 b e n d e c k 证明d o x 抑制动脉血管壁m m p 2 和m m