（动物学专业论文）青岛文昌鱼染色体g类带型与复制带研究.pdf

摘要 文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s i n g t a u e n s e ) 属于脊索动物门、头索动物亚 门、文昌鱼科，是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的一种过渡型动物，被认为是和脊椎 动物亲缘关系最接近的无脊椎动物，是研究生物进化的重要模式动物。文昌鱼是海洋珍 稀动物，世界上现存的文昌鱼仅有3 个主产地( 美国的佛罗里达、中国的青岛和厦门) ， 我国有两种文昌鱼，一种是厦门文昌鱼( 又称白氏文昌鱼) ，另一种是青岛文昌鱼，现 已被列为国家二级濒危保护动物。 本实验以青岛文昌鱼为研究对象，采用晚期囊胚和早期原肠胚的胚胎细胞为实验材 料，利用低渗处理、空气干燥法制备染色体玻片标本。在此基础上，为进一步探索显示 青岛文昌鱼染色体g 带的新方法，利用胰蛋白酶、蛋白酶k 和片龄显带技术对青岛文昌 鱼的染色体进行了初步研究，显示了青岛文昌鱼染色体的g 类带型，并绘制了青岛文昌 鱼染色体的g 类带型模式图。胰蛋白酶法共显示了1 2 5 条带，其中阳性带为6 6 条，阴 性带为1 7 条，可变带为4 2 条；蛋白酶k 法共显示了1 2 5 条带，阳性带为6 5 条，阴性 带1 7 条，可变带为4 3 条；片龄显带法共显示了1 0 9 条带，其中阳性带为5 5 条，阴性 带1 2 条，可变带为4 2 条。通过对上述三种g 类带型的比较，可以看出三种方法显示的 带纹数目基本一致，但每种具体的方法显示的染色体的带纹分布又具有其独特的特征 性，并提出文昌鱼染色体的g 带带型与片龄的相互关系。 同时，采用经修改的b r d u - h o e c h s t g i e m s a 方法，在培养青岛文昌鱼的胚胎细胞时， 分期加入b r d u ，对青岛文昌鱼染色体的复制带显带技术进行了研究，获得了较为清晰的 复制带带纹，绘制了青岛文昌鱼染色体的复制带动态图象，进而逐步描述了青岛文昌鱼 染色体的早、中、晚期复制带带纹特征及其复制规律，不仅为文昌鱼同源染色体配对及 各号染色体的区分提供了依据，而且对文昌鱼染色体的基因定位、育种及文昌鱼细胞遗 传学的深入开展具有重要的理论和实践意义。 关键词：青岛文昌鱼；染色体带型：g 带；片龄：复制带 a b s t r a c t a m p h i o x u s0 1 l a n c c l c t ，s u b o r d i n a t e dt oc e p h a l o c h o r d a t aa n db r a n c h i o s t o m i d a e ，i st h e e x t a n ti n v e r t e b r a t ec h o r d a t ea n da ni n t e r m e d i a t et y p ea n i m a lc o n s i d e r e dt ob et h ec l o s e s t r e l a t i o n s h i pt ot h ev e r t e b r a t e i ti sa l s oa ni m p o r t a n tm o d e la n i m a lf o rs t u d y i n gb i o l o g i c a l e v o l u t i o n y ai ti sr a t h e rr a r eo c e a na n i m a li nt h ew o r l d t h e r ea r eo n l yt h r e em a i n l yh a b i t a t s o f t h ea m p h i o x u so rl a n c e l e t 倒o r i d a , x i a m e na n dq i n g d a o ) t w os p e c i e so fa m p h i o x u sc 锄 b ed i s c o v e r e di nc h i n a o n ei sb r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i , t h eo t h e ri sb r a n c h i o s t o m ab e t c h e r i t s i n g t a u e n s ，w h i c hh a sb e e nl i s t e do nt h en a t i o n a ls e c o n d g r a d ea t t e n t i v ep r o t e c t e ds p e c i e s 1 1 1 ec h r o m o s o m e so fa m p h i o x u sr b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s i n g t a u e n s ) w e r ep r e p a r e d b yh y p o t o n i ct r e a t m e n ta n da i r - d r y i n gu s i n gt h ee m b r y o sw h i c hw e r ei n c u b a t e da tb l a s t u l a a n de a r l yg a s t r u l as t a g e s t h e ng - t y p eb a n d i n g sw e r es t u d i e dw i t ht h et r y p s i n ，p r o t e a s ek ， a n ds l i d ea g i n gt r e a t m e n tt e c h n i c q u ei no r d e rt os e a r c hn e wm e t h o d so fs h o w i n gg b a n d i n g 1 1 1 eg t y p eb a n d i n g so fa m p h i o x u sw e r eo b t a i n e d m o r e o v e r , t h eg - t y p eb a n d i n gp a t t e r n p i c t u r e sw e r ed r a w n t h e r ea r e6 6p o s i t i v e ，1 7n e g a t i v ea n d4 2v a r i a b l eb a n d sa m o n gt h e1 2 5 g - b a n d so ft r y p s i ng - b a n d i n gt r e a t e db yp r o t e a s ekt h et o t a ln u m b e ro fg - b a n d e di sa l s o 1 2 5 ，w h e r e a st h ep o s i t i v ea r e6 5 ，t h en e g a t i v ea r ea l s o1 7 ，a n dt h ev a r i a b l ea r e4 3 w h i l e1 0 9 g - b a n d e dw e r ea c q u i r e db yu s i n gs l i d ea g i n gt r e a t m e n t ，a n d5 5b a n d sa r ep o s i t i v e ，1 2b a n d s a r en e g a t i v e ，4 2b a n d sa r ev a r i a b l e c o m p a r e dt h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h et h r e eg t y p eb a n d s ， t h es i m i l a r i t i e sa n dd i f f e r e n c e so ft h e mw e r ed i s c u s s e d t h e r ea r en oo b v i o u sd i f f e r e n c e s a b o u tt h et o t a ln u m b e r , y e te a c ho ft h eb a n d sf r o mv a r i o u sm e t h o d sw a so ft h es p e c i a l c h a r a c t e r i s t i c i na d d i t i o n , t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es l i d ea g i n ga n dg - b a n d i n gw a s p r o p o s e d f u r t h e r m o r e ，t h er e p l i c a t i o nb a n d i n go fa m p h i o x u sw a ss t u d i e df i r s t l yr e f e r e n c i n gt h e s t a n d a r db r d u h o e c h s t g - i e m s am e t h o dw i t hs l i g h tm o d i f i c a t i o n t h ec h r o m o s o m e sf r o mt h e c u l t u r e de m b r y o n i cc e l l so fa m p h i o x u sw e r em a r k e db ya d d i n gb r d uw h e ni t sd n ai s r e p l i c a t e da ti n t e r v a l sb e f o r et h ec e l l sw e r eh a r v e s t e d t h e nd i s t i n c tb a n d i n gp a n e r u sw e r e d i s p l a y e do nt h ec h r o m o s o m e s t h e r e f o r e ，ar e p l i c a t i o nd e v e l o p m e n tp a t t e r np i c t u r ew a s d r a w n n wc h a r a c t e r i s t i c so fe v e r yc h r o m o s o m ea te a r l y , m i d d l e a n dl a t es t a g e sw e r e i d e n t i f i e da c c o r d i n gt ov a r i o u sm e t a p h a s ep l a t e sw h i c hs h o w e dd i f f e r e n tr e p l i c a t i o nb a n d s s t u d y i n go ft h er e p l i c a t i o nb a n d i n gc o u l db eo fp a r t i c u l a rp r a c t i c a l a n dt h e o r e t i c a l s i g n i f i c a n c ef o rg e n el o c a l i z a t i o n , b r e e d i n go ft h ea m p h i o x u s a sw e l la st h ee x t e n s i v e c y t o g e n e t i cs t u d y k e yw o r d s ：a m p h i o x u s ( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s i n g t a u e n s e ) ；c h r o m o s o m eb a n d i n g ； g - b a n d i n g ；s l i d ea g i n g ；r e p l i c a t i o nb a n d i n gp a t t e r n 1 1 1 鲁东大学学位论文原创性声明和使用授权说明 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成 果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表 或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 牟淳，羔日期：卅年 钼，苫日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权鲁 东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名： 导师签名： 劓，萋 砂阮 日期：1 年 日期：御年 ， f 月f b 日 0bf 日 鲁东大学硕士学位论文 第一章综述 1 1 染色体带型及显带技术 1 1 1 染色体染色技术及分类 染色体的染色技术可以分为普通染色和显带染色两大类。 普通染色是将普通染料直接作用在染色体标本上。由于整条染色体都均匀着色，在 显微镜下只能看到染色体的外形，看不清其内部结构，因此只能根据染色体的相对长度 和着丝粒位置等外形特征来识别判断染色体。对人类染色体来说，这种染色方法只能正 确地识别出第1 、2 、3 、1 6 、1 7 、1 8 号及y 染色体，不能正确地识别出其他染色体及染 色体上的不同片段m 。对各条染色体的微小结构变化，如缺失、易位等也不能检出。所 以，在对许多异常染色体的研究中，特别是对染色体结构变化的研究受到很大限制，因 此，普通染色有很大的局限性。 显带染色是将染色体经过一定显带技术处理，并用特定的染料染色后，使染色体在 其长轴上显示出一个个明暗交替或深浅不同的横纹，这样的横纹就叫做染色体的带。每 条染色体都含有一定数量、一定排列顺序、一定宽窄、染色深浅或明暗不同的带，这就 构成了染色体的带型，并且这些显带图型在发育过程中以及不同组织的细胞间是恒定的 嘲。显示染色体带的过程称为染色体显带，染色体显带是一类分带技术，是一种方法学 “1 。显带技术不仅解决了染色体的识别问题，而且由于在染色体上能区别许多区和带， 还为深入研究染色体的结构异常及基因定位创造了条件。 1 1 2 显带技术及分类 1 9 6 8 年，瑞典学者c a s p e r s s o n 等人首次发表了第一张人染色体的显带核型，揭开 了染色体带型研究的序幕”3 ，为染色体的研究提供了更有效的方法，以后染色体显带方 面的研究又不断深入。染色体的显带技术分为两大类：一类是产生的染色带分布在整个 染色体的长度上，如q 带、r 带和g 带等；另一类为染色体局部的显带技术，只能使少 数特定的带或结构染色，例如，显示的着丝粒( 结构异染色质) 带( c 带) ，端粒带( t 一 带) 以及核仁组织者( n o r ) 带等“1 。 1 1 2 1 以染料为基础的显带技术 此法需要染色前对染色体进行预处理，并需要混合使用染料。吉姆萨染料是一种混 合染料，它是由甲基蓝( m e t h y lb l u e ) 及其氧化产物天青( a z u r e ) 和伊红y ( e o s i n y ) 组成，几乎所有的染色体标本都用吉姆萨染色，特别是显带技术的问世，吉姆萨染 料显示出更加惊人的优越性，它可使处理过的染色体显示出不同的带纹。基于染料的染 鲁东大学硕士学位论文 色体显带技术有： q 显带技术1 9 6 8 年，瑞典的c a s p e r s s o n 首次应用荧光染料氮芥喹吖咽处理染色体 标本，发现染色体因着色不同而能够沿其纵轴显示出宽窄和亮度不同的荧光带，这种明 暗相间的带纹被称为q 带。 采用喹吖咽或喹吖咽芥子荧光染料，这些染料与某些碱基发生特异性作用。该技术 基于如下前提，即染色体上的碱基组成必须是非均匀性的。喹吖咽分子在插入染色体d n a 时无序列选择性，但用喹吖咽染料染中期染色体标本可出现一种特征性黄光亮一暗带 型，一般富含a t d n a 区段表现为亮带，富含g c d n a 区段黄光较暗，常用于人类y 染色 体长臂的观察。c a s p e r s s o n 采用该法完成了对人类全套染色体核型分析，将2 3 对染色 体一一分辨和鉴别“1 。 q 带受制片过程和熟处理的影响较小，制片效果较好，带型鲜明。但是由于荧光持 续存在的时间较短，必须立即进行显微摄影；另外，必须用荧光显微镜才能进行观察， 加之不能长久保存，所以，不能为一般实验室所采用，在临床上也较少用。 g 显带技术若染色体先经过盐、碱、热、胰酶或蛋白酶、尿素及去垢剂等的处理 再用一种叫做g i e m s a 的染液染色，使染色体沿其纵轴显示出深浅相间的带纹，这个带 纹称为g 带，也叫g 显带。最早g 显带技术是1 9 7 1 年p a t i l 等报道的，是采用吉姆萨 混合染料的染色方法，即染色体不经任何处理，将吉姆萨染液的p h 调到9 ，给以适当的 染色时间就可获得好的g 9 带”1 。该法虽然操作简单，但需要新鲜的染色体标本且低浓度 的吉姆萨染液，而在用吉姆萨直接染色时离子强度和p h 值都对g 带有较大的影响”1 ，在 常规应用时较其它显带技术( 如胰酶处理，吉姆萨染色；胰酶处理，利什曼染色等) 可 信度低。 c h u p r e v i c h 等认为，染色体经酶处理后，因蛋白质已被水解而使d n a 分子中碱基暴 露。由于碱基中g c 和a t 组合的比例不同，对染料结合的程度不同，如果这段a - t 碱 基成分多，则g i e m s a 染料易与其结合，被深染。若g - c 碱基成分多，则g i e m s a 染料不 易与其结合，结果呈淡染”1 。即在g 带深染区富含a - t 碱基对，而g 带浅染区富含g - c 碱基对”1 ，由于同源染色体的带纹致，可通过带纹对染色体较为准确地配对。 1 9 9 0 年高明君等人又在分子水平上阐述了带纹产生的原因，认为用酶处理染色体 后，使非组蛋白变性，变性蛋白更牢固地覆盖在d n a 磷酸基团上，妨碍了染料与d n a 磷 酸基团的结合，因而使染色体显示出带纹。因此，把核酸和蛋白质有机结合起来，以差 别d n a 序列为基础，综合考虑这一有机复合体与染色体显带的关系“。 g 带在各条染色体上显出的带型和q 带型基本相同，利用q 带、g 带等显带技术， 2 鲁东大学硕士学位论文 可以显示出人类每一条染色体的特异带型，这为识别和分析每条染色体提供了必要的条 件。由于g 带方法简单，带型稳定，保存时间长。在普通显微镜下就可以进行观察，所 以为一般实验室普遍采用，也是临床上最常用的显带方法之一。它可应用于辨别染色体、 分析确认染色体异常( 非整倍性、断裂和重排等) 、细胞培养中染色体的变化、癌细胞 的检测及基因作图等方面1 。 r 显带技术这种方法是1 9 7 1 年5 月d u t r i l l a u x 和l e j e u n e 分析人类染色体核型时 建立的，方法是将中期未染色的片子放在p h 为4 - 4 5 ，温度为8 7 c 的l 咖o l l 的n a h ：p o | 溶液中温育，即进行热变性处理，然后再用g i e m s a 染色。这是首次不用荧光染料分析 染色体带型的报道“。这种显带技术后来在巴黎会议上被定名为r 带“” 该法优先使富含a _ t 的d n a 变性，随后将富含g c 的d n a 区着染。在某些r 显带程 序中，采用吖啶橙替代吉姆萨染料，产生绿黄色荧光的r 带。吖啶橙是一种非特异性 阳离子荧光染料，可以结合到d n a 或r n a 的磷酸基团上，受紫外线激发产生黄绿色荧光， 它以两种方式与d n a 结合：其一为插入结合，产生绿色荧光，仅发生在d n a 双链区域： 其二为外部结合，作用于d n a 磷酸骨架上，产生红色荧光，发生于d n a 单链区域研究 发现，在高温时吖啶橙将整个染色体着染为红色，在低温时染为绿色，这说明了在r 显 带中d n a 变性所起的作用。 r 显带技术相对g 显带技术来说称为相反的显带技术，即r 显带技术和g 显带技术 产生的染色体带型呈互补性( g 阳性带为r 阴性带、反之亦然) ，这两种显带技术说明了 染色体上同一基本现象的相互关联的两个方面。2 0 0 4 年，王昌留等显示出的青岛文昌鱼 中期染色体的g 带和r 带中，仅有3 8 的部位存在互补性现象，为何存在这种较低的互 补现象还需进一步研究。”。r 显带技术也是一种常用的染色体显带方法，常用于染色体 末端的研究。 c 显带技术即结构性异染色质特征性染色体技术，使用这种技术，能使着丝粒处的 异染色质着色，这种异染色质通常位于着丝粒周围并常含有高度重复序列的d n a 。因为 这种带型通常都在着丝粒处出现，所以称之为c 带。c 显带技术包括对染色体的一系列 酸碱处理、热标准枸椽酸盐溶液( s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e ，s s c ) 温育以及随后的吉 姆萨染色过程“”。这种方法将结构异染色质和高度重复的d n a 区域染色。在人类染色体 上这些区域位于着丝粒和y 染色体上。现在普遍认为c 带产生的关键原因在于c 显带技 术处理过程中，由于酸、碱、盐溶液的作用，使染色体上的常染色质中的d n a 被抽提掉， 而结构异染色质中的d n a 无论是哪种类型因其同蛋自质结合紧密而被大部分保留下来， 从而导致结构异染色质区域被深染显示为c 带“o “”。 3 鲁东大学硕士学位论文 c 带具有多态性，在染色体上存在的位置和大小是不同的。根据c 带在染色体上的 位置可分为四种：着丝粒区( c e n t r o m e r e sr e g i o n s ) 、近着丝粒区( p e r i c e n t r i c r e g i o n s ) 、中间区( i n t e r s t i t i a lr e g i o n s ) 和末端区( t e r m i n a lr e g i o n s ) 。c 带的多 态性，对研究物种的亲缘关系和进化是非常有用的，这在不同人群中已经得到证实“”1 。 2 0 0 4 年，王昌留等发现文昌鱼的c 带除在上述4 个位置外，还发现某些染色体全部为c 带着色及某些区域的c 带是可变的。同脊椎动物相比，文昌鱼染色体的c 带所显示区域 的比率要高“。 a g n o r 显带技术也称银染色硝酸银能特异地染色显示核仁组织者区域( n o r s ) 结 合的酸性蛋白。使该区域呈黑色。着色的为与r d n a 转录有关的酸性蛋白，即显示的是 有转录活性的核仁形成区。该法是1 9 7 5 年，g o o d p a s t u r e 和b l o o m 在研究n o r 显带技术 的基础上发现的“”常用于研究r d n a 的动态变化，临床上常用于着丝粒、随体等研究。 n o r 带和c 带一样也具有多态性，在不同物种间甚至不同亚种和种群间都存在着差 异，g o l d 根据其表现分为以下4 个方面啪1 ：随每个基因组中所含的核仁组织者的绝对 数目的不同而变化；在不同生物染色体上的位置不同；随所含的核仁组织者的相对 大小的不同而变化；与核仁组织者的转录活性相关。前两者主要存在于种间，后两者 存在于种内o “。这些差异可以作为鉴定物种间的亲缘关系和染色体进化的一个重要指标 啤“。此方法已在哺乳类和两栖类等脊椎动物中获得了广泛的应用，对文昌鱼银染带的 研究起步较晚，2 0 0 3 年王昌留等发现文昌鱼n o r 带位于第十二对染色体的着丝粒区，n o r 的数目是2 个，从文昌鱼n o r 带的特征看，头索动物是较鱼类、两栖类、爬行类和哺乳 类等低等的类群“”。 t 显带技术1 9 7 3 年d u t r i l l a u x 发明了一种使r 带末端保持深染的方法，并把这种 方法命名为t 带1 。t 显带技术采用比r 显带技术更为剧烈的热处理，t 显带技术的机 制与r 显带技术相同，即除了富含铲c 的区域外，所有d n a 区域均发生变性，其显示的 带纹可以认为是着色最深的r 带1 1 1 2 2 以功能为基础的染色体显带技术 此法应用最广泛的是复制带显带技术。染色体的复制带显带法是细胞遗传学研究的 一项重要技术，是染色体显带技术与姐妹染色体分化染色技术二者结合而发展起来的一 种显带技术，用于显示染色体的某些片段在s 期复制时的先后顺序，又称为 b r d u h o e c h s t g i e m s a 技术。 最初在研究复制带型时所用的标记物为，以放射自显影方法显示汹1 。现在多使用 胸腺嘧啶核苷的类似物b r d u 作为渗入物，在细胞周期的s 期b r d u 能渗入到正在进行复 4 鲁东大学硕士学位论文 制的d n a 中去，通过精确控制b r d u 渗入的时间，即可得到染色体的早期复制图型或晚 复制图型。 除上述两大类型的显带技术外，还有其他类型的显带技术，例如，染色体显带与荧 光原位杂交技术：核酸酶显带技术；抗体显带技术；g 1 1 显带技术等。另外，染色体显 带技术不适用于非分裂细胞群体，在某些生物的某些组织，可以观察到发生多线化( 即 细胞在未分裂时染色体发生多次复制) 后的间期染色体，多线化染色体也可以含有一系 列带和带间区，带纹的数目和清晰度都相应的增加，带纹的分辨率也相应提高”1 。简单 真核生物的染色体太小，以致于不能通过光学显微镜将其完全分辨开。 1 2 染色体带数量及识别 2 0 世纪7 0 年代以来，随着染色体的显带技术不断发展，能显示的带数也不断增 加。2 0 世纪8 0 年代后，由于细胞同步化技术的应用和显带技术的改进，又出现了高分 辨显带技术。高分辨显带( h i g hr e s o l u t i o nb a n d i n g ，h r b ) 技术是采用细胞同步化等方 法，获得大量优质的有丝分裂晚前期或早中期的显带核型。例如，采用该技术，使人类 的单套染色体的带纹数量增至4 0 0 、5 0 0 、8 5 0 、1 0 0 0 甚至3 0 0 0 条以上，从而使人类染 色体在光镜下能展现出更明显的特征。高分辨显带染色体的优点是染色体细长、显出的 带纹多，它能为染色体及其畸变提供更多的细节，有助于发现更多细微的染色体异常， 使染色体结构畸变的断点定位更加准确，因而无论在l 晦床细胞遗传学检查、肿瘤染色体 研究，还是在基因定位等方面都有广泛的用途。 尽管每一条染色体的带型是一定的，但有一些因素能影响带纹的显现，其中最主要 是染色体的长度和标本及其显带处理的质量。另外，在中期，随着染色体的逐渐凝聚， 一些相邻的带常汇合在一起，带纹数量变少，一些着色较浅较窄的带不明显”1 。因此， 巴黎会议在描述g 带带型时，深带( 阳性带) 是指为g i e m s a 着色深者，浅带( 或阴性带) 是指不着色或基本不着色者；为了说明染色强度则用“浓”、“淡”等词；此外带的位 置相对着丝粒的距离而言，又常用近端，远端，近段，中段，远段等词来表示”1 。在巴 黎会议命名体系的基础上，1 9 8 1 年又公布了人类细胞遗传学命名的国际体制高分 辨显带( 1 9 8 1 ) ，并提供了4 0 0 、5 5 0 和8 5 0 条带的模式图作为命名和识别的标准1 。 1 3 染色体带的命名 对染色体带型的识别和命名是从染色体上的着丝粒开始的。在显带染色体标本 上，一条染色体被着丝粒分为短臂( p ) 和长臂( q ) ，两臂均由一系列染色深和染色浅的带 所构成，不存在带闻区。不论在长臂或短臂中，都可以依照明显的形态特征( 如着丝粒、 明显的深染带或浅染带) 作为界标( 1 a n d m a r k ) ，分为几个区，每区中可以包括若干个 5 鲁东大学硕士学位论文 带，区和带以序号命名，从着丝粒两侧的带开始，作为第1 区第1 号带，向两臂远端延 伸，依次编为2 区、3 区等每一区内也依次编为l 号带、2 号带，定为界标的染色 带就作为下一个区的1 号带。每一个染色体带的命名，由连续书写的符号组成，例如， i q 3 2 表示为第1 号染色体长臂的第3 区2 号带。如果一个带又分成若干亚带( 即高分辨 带) ，则在带号之后加小数点，再书写亚带的编号，亚带也由着丝粒向远端依次编号。 如i p 3 6 2 表示第1 号染色体短臂的第3 区6 号带中的第2 号亚带，如果亚带又再细分， 则在原亚带编号后再加数字，不需再加标点，例如i p 3 6 2 1 。 1 4 染色体显带的目的和意义 染色体是遗传物质的主要载体，兼有稳定性和可变性的特点，染色体的进化与有机 体的进化之间有着一定的平衡关系。核型分析特别是显带核型分析不仅是物种鉴定的重 要手段。而且能有效地应用于研究物种的核型进化及其可能的进化机制。因此，通过对 染色体的研究，可以为生物的分类和系统演化提供科学依据”“。 带型分析实际上是更精确的一种核型分析，在细胞遗传学中具有实用价值。不同的 染色体具有不同形态的带型，反映了染色体固有的结构，通过显带核型分析，可以准确 识别每一条染色体，而且也可以发现染色体上微小的结构特征，通过观察染色体的缺失、 重复、易位和倒位等染色体重排引起的染色体带型的异常，再与特定的遗传病相联系， 进而确定许多疾病相关的基因，异常染色体的检出对患者的治疗、预防及优生、优育、 优教都有重要指导意义。”。因此染色体显带技术是某些遗传性疾病临床诊断必不可 少的手段，现在已经广泛应用于人类疾病的研究领域，例如，在白血病的研究上国内外 进行了大量的染色体的研究，染色体显带技术不仅解决了染色体的识别问题，还为 深入研究染色体的异常及人类基因定位创造了条件。 尽管各种显带技术，如g 一带、q 一带、c 一带、r 一带、a g - n o r s 等在7 0 年代中已在绝 大多数哺乳动物中得到广泛而深入的应用，然而对文昌鱼染色体的研究而言，由于材料 来源有限，国内外仅见少量的核型报道和极为有限的带型分析，这无疑阻碍了文昌鱼细 胞遗传学的深入开展。 1 5 文昌鱼染色体的研究情况 1 5 i 文昌鱼的发现、命名与分布 早在公元8 1 9 年，唐朝文学家、哲学家韩愈( 7 6 8 - - 8 2 4 ) 在潮州作刺史时，因鳄鱼作 恶，杀鳄鱼时发现了文昌鱼。只是这一发现没有鉴定、描述、定名、发表，未被世界公 认1 。1 7 7 4 年，德国动物学家p a l l a s 在英格兰南部发现了文昌鱼，并首次对文昌鱼进 行了研究报道，因其外形类似蛞蝓，误认为是软体动物，遂将这种文昌鱼定名为l i m a x 6 鲁东大学硕士学位论文 l a n c e o a t u s 。1 8 3 4 ，年意大利动物学家c o s t a 将其改名为b r a n c h i s t o m al u b r i c u m , 1 8 3 6 年，y a r r e l 将文昌鱼更名为b r a n c h i o s t o m a a n c e o a t “i 3 力，一直沿用至今。另外，好 多文献中还可以看到许多文昌鱼的别名( 俗称) 如：鳄鱼虫、米鱼、折担虫等。 据p o s s 和b o s c h u n g 报道，世界上现存的文昌鱼有2 9 种，文昌鱼仅有三个主产地 ( 美国的佛罗里达，中国的青岛和厦门) ，广泛分布于南纬4 0 。至北纬4 8 。之间的广大 海域，包括大西洋、印度洋、太平洋沿岸的热带、亚热带、温带地区以及一些岛屿的周 围海域降”。我国有两种文昌鱼，一种是厦门文昌鱼( 又称白氏文昌鱼) ( b r a n c h i o s t o m a b e l c h e r ig r a y1 8 4 7 ) ，主要分布于福建、厦门、台湾海峡南部、香港及广东、广西、 海南的部分海区。另一种是青岛文昌鱼( b r a n c h i o s t o m a b e l c h e r it s i n g t a u e n s et c h a n g s ia n dk o ok w a n g - c h u n g1 9 3 6 ) 主要分布于山东的青岛、烟台及胶州湾大公岛和河北的 秦皇岛。 1 5 2 文昌鱼的形态特征与生活习性 1 5 2 1 文昌鱼的形态特征 文昌鱼( a m p h i o x u s 或l a n c e l e t ) 属于脊索动物门( c h o r d a t a ) 头索动物亚门 ( c e p h a l o c h o r d a t a ) 文昌鱼科( b r a n c h i o s t o m i d a e ) ，全身无色半透明，两头尖中间宽， 左右两侧扁，整个身体呈纺锤形，俗称“扁担鱼”，“双尖鱼”。文昌鱼体形小，只有 三四厘米至五六厘米长，每千克有近万尾之多。是世界海洋珍稀动物国家二级珍稀濒 危保护动物。 其外形似鱼，但它与鱼类不同。头尚未分化出来，既没有明显的头部，也没有明显 的脑和眼、耳、鼻等感觉器官，所以又称为无头类。在身体的前端有一个黑色小斑，称 为眼点，可以感觉光线的强弱，幼体尤其畏光。前端的腹面正中有一个由薄膜构成的环 形口笠，口笠周围有3 7 4 5 个触须环绕，触须的数目随年龄而增加，触须上有感觉突 起，感觉较为灵敏，可以保护口笠并阻止粗物进入口中。它没有成对的偶鳍，在身体后 端有一个比较宽大的矛状尾鳍，背面沿中线全长有一条由皮肤折迭形成的背褶或背鳍， 并与尾鳍紧相连接。尾鳍的腹侧又和它前方的臀前鳍连在一起，这些鳍都是不成对的。 在臀前鳍的前面，身体的腹部比较扁平。所以，这部分的横切面略呈三角形。在这部分 的左右两侧，有由皮肤下垂形成的褶状物，称为腹褶。腹褶和臀前鳍的交界处，有一个 孔，称为腹孔。它的身体分节十分明显，皮肤由单层细胞的表皮和冻胶状结缔组织的真 皮构成，有光泽，体表没有鳞，呈半透明的粉红色，可以看到体内左右交替地长有呈“v ” 形平行排列的6 3 6 6 个稍透明的肌节，左右交迭，这些肌节的数目是文昌鱼分类上的 重要特征之一”1 。 7 鲁东大学硕士学位论文 1 5 2 2 文昌鱼的生活习性 文昌鱼对自然环境的要求十分严格，要求海水透明度较高，水流不大，水质清洁， 水深为8 1 6 米，酸碱度在8 1 9 0 之间，最适盐度为2 4 2 9 ，最适宜的水温为1 2 3 0 ，一年水温之差在1 8 左右1 。 文昌鱼身体的外形特征虽然有利于在水中运动，但并不像鱼类那样善于游泳。因为 没有偶鳍，不能使身体平衡，也不能随意转弯，游泳时只能依靠扭动身体和尾巴。平时 最喜欢栖息于浅海疏松的含有贝壳碎片或棘皮动物碎骨片的沙地上，把身体埋藏于沙粒 之中，仅露出头部准备随时摄取硅藻和微小的浮游生物等食物，在夜间尤为活跃。当一 个地方的食物吃尽以后，它会借助身体的左右摆动游到另外一个适宜的地方，钻入沙里， 摆好姿势，继续其摄食活动。它对沙的质地也有选择，要求有较多的粗沙和少量细沙， 因为带有淤泥的细沙地比较硬钻不进去，另外，细沙也会阻碍它进行呼吸。 文昌鱼有相当一部分氧气是通皮肤表面的淋巴窦直接由水中吸入血液。其中枢神经 是一条纵行的神经管，位于脊索的背面，但稍短于脊索。1 4 c 对文昌鱼性腺( 卵巢和精 巢) 发育没有显著的作用，2 0 - - 2 5 c 十分有利于性腺发育和成熟。文昌鱼年产卵3 4 次，产卵时间在6 7 月，体外受精，生殖腺常沿体壁成对排列，长满到1 1 个月即开 始成熟，但在外形上雌、雄性并无明显区别，只是在生殖腺的颜色不同上略可分辨。精 巢呈乳白色，卵巢呈柠檬色，成熟了的精巢中排出精子，卵巢中排出卵子。它们随水流 从腹孔排到体外，在海水中受精发育“”。由于长期适应的结果，文昌鱼的精子偏好碱性 海水，最佳p h 为8 5 9 0 更有利于文昌鱼精子的活动和延长寿命，也更有利于受精。 产卵多在傍晚前后进行，它的发育从受精卵、桑椹期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、 孵化成幼体、经变态发育成为成体。文昌鱼的胚胎发育很快，卵经受精后，l h 即开始分 裂，6 h 后在卵膜内的胚胎已经能活动，1 2 h 后出现肌节，受精卵在次日上午即发育成能 自由游动的幼体，这时鳃裂的数目尚少，没有围鳃腔。三个月后长成成体，但性腺成熟 则要到年后才能发育完全”“。 1 5 3 文昌鱼在生物进化中的地位及研究意义 文昌鱼在生物进化中占有重要的地位，它是脊椎动物的祖先，被认为是现存的与脊 椎动物亲缘关系最接近的无脊椎动物，是脊椎动物始祖的现存代表。文昌鱼代表着从无 脊椎动物到脊椎动物进化过程中一个重要的过渡阶段，根据现存的低等脊索动物的躯体 构造看来，它们的原始祖先体内还没有坚硬的骨骼，所以很难在古代的地层中留下化石。 给探索脊椎动物起源问题的工作带来了困难。因此，文昌鱼是揭示脊椎动物起源从而进 一步了解人类自身的宝贵材料，是研究动物进化和胚胎发育的活化石。随着生命科学研 8 鲁东大学硕士学位论文 究进入了分子生物学时代。对文昌鱼、脊椎动物及其它亲缘关系相近的类群之间进行进 化和发育分子生物学的研究和比较，可以追踪进化过程中基因和发育图式的变化，从而 提供有关脊椎动物起源和进化的线索，这将在生命科学研究中发挥十分重要的作用。 虽然文昌鱼不是现代脊椎动物的直接祖先，但通过文昌鱼和人类基因组的比较，我 们可以推测生活在5 亿年前的人类原始祖先的基因组的结构，进而探索人类起源的奥秘。 1 5 4 文昌鱼的研究简史 继1 7 7 4 年p a l l a s 进行了文昌鱼研究的报道后，直到1 8 6 7 年俄国胚胎学家 k o w a l e v s k y 通过对其胚胎学的研究才明确其分类地位：文昌鱼是介于无脊椎动物和脊椎 动物之间的一种过渡型动物。1 8 7 4 年h a e c k e l 根据k o w a l e v s k y 的研究将文昌鱼( 头索动 物亚门) 、海鞘( 尾索动物亚门) 和脊椎动物归入一门，即脊索动物门“”。 自文昌鱼的分类地位确定后，由于它在进化研究中有着重要作用，文昌鱼受到生 物学界的广泛关注。2 0 世纪6 0 年代之后，特别是随着文昌鱼室内产卵技术的成熟和电 镜技术的进步，大大地激发了学者们对文昌鱼的研究兴趣，发表有关文昌鱼的研究论文 己达数百篇。这些论文包括文昌鱼生态学“”和生理学“”的方方面面。如文昌鱼种类特征 及其在世界各海域生态分布、栖息环境和食性，解剖学和组织学、胚胎发育”“1 、生殖 内分泌和生物化学以及近几年正在开展的分子生物学等“”“”，特别是从基因水平研究其 发育m “、进化。”3 等方面的研究报道越来越多。 2 0 0 1 年，张士璀等发现文昌鱼基因组既含有脊椎动物祖先基因的原始特征，又含 有自身特有的特征。修正了前人有关文昌鱼胚胎细胞形态发生运动和内胚层发育潜能的 错误描述；建立了文昌鱼体液补体替代途径活性检测方法，并证明了文昌鱼体内存在着 类似脊椎动物的补体替代途径。此外，首次在室内把文昌鱼受精卵培育成为成体文昌鱼， 发现实验室培养的文昌鱼能够产生具有正常受精力的卵子和精子，为保护这一国家二级 珍稀濒危动物奠定了基础”3 。 总之，这些不同学科领域却都围绕一个中心，证明文昌鱼是脊椎动物的祖先，正 如达尔文所说“是指示脊椎动物起源的钥匙”。因此文昌鱼的研究在理论和学术上有重 要的价值。 1 5 5 文昌鱼染色体的研究概况 迄今，关于青岛文昌鱼染色体数目研究的报道只有数篇。1 8 9 5 和1 8 9 6 年s t r i c h t 曾报道过b r a r t c h i o s t o m a a n c e o a t u m 单倍体的数目是1 0 和1 2 ，c o l o m b e r a 报道染色 体的二倍体数目是3 8 。”，1 9 5 7 年n o g u s a 用b r a n c h i o s t o 盟ab e l c h e r ig r a y 作实验材料 认为染色体的数目是3 2 呻3 ，而s a o t o m e 和o j i m 则认为是3 6 嘲，h o w e l l 和b o s c h u n g 9 鲁东大学硕士学位论文 报道了b r a n c h i o s t o 腑f l o r i d a e 的染色体是3 8 3 ，从这些文献中可看出各自的实验结 果并不一致， 有关文昌鱼染色体核型、带型方面的研究报道更少。目前，还没有关于厦门文昌鱼 和佛罗里达文昌鱼带型方面的报道，关于青岛文昌鱼( b r a n e h i o s t o m ab e l c h e r i t s i n g t a u e n s e ) 带型的首次报道是在2 0 0 3 年国内的王昌留和张士璀利用文昌鱼的晚 期囊胚和早期原肠胚的胚胎细胞为材料，利用空气干燥制片法，制备染色体玻片标本， 确定了青岛文昌鱼染色体数目为3 6 条，并展示其核型为2 n = 2 s t + 3 4 t 1 ；2 0 0 4 年，又首 次报道了青岛文昌鱼染色体的g 、r 、c 、n o r 带型，从核型和带型的结果提出青岛文昌 鱼的第二对染色体可能是性染色体。“。但是，关于青岛文昌鱼染色体的片龄与显带的 关系、蛋白酶k 与显带、复制带，至今还未见有这方面的报道。 虽然c a s t r o 和h o ll a n d 在2 0 0 2 年用荧光原位杂交的方法证明b r a n c h i o s t o m a f l o r i d a e 的染色体上有核糖体r n a 的基因呻1 ，但由于当时c a s t r o 和h o l l a n d 没有做文 昌鱼染色体带型方面的实验，因此，文昌鱼染色体上的核糖体r n a 基因究竟位于哪个染 色体及在