（动物学专业论文）谷胱甘肽s转移酶p1调控lps和tnfα激活的胞内信号通路的研究.pdf

学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名：篓二坠 日期：妊6 丛旦丛堑 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：，二墨二坠 日期：血垒主昼! 塑 南京师范大学博士学位论文 谷胱甘肽譬转移酶p 1 调控l p s 和t n f 一伍 激活的胞内信号通路的研究+ 摘要 谷胱甘肽口转移酶p l ( g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s ep l ，g s t p l ) 是哺乳动物体内 一种重要的解毒酶，参与维持了机体内氧化还原状态的平衡。以往研究表明， g s t p l 是一种肿瘤发生的标志性蛋白，在肿瘤细胞对抗癌药物耐药性的形成过 程中发挥了重要作用。g s t p l 还能通过与j n k 结合而使其在静止细胞中仅具有 本底低激酶催化活性。本课题对g s t p l 在细菌脂多糖( l p s ) 诱发的炎症反应 和肿瘤坏死因子a ( t n f 一旺) 激活的信号通路中的作用进行了研究。 首先，本研究发现g s t p l 参与调控了由l p s 引起的炎症反应。在小鼠巨噬 细胞株r a w 2 6 4 7 中，l p s 刺激能上调内源性g s t p i 的m r n a 水平和蛋白表达 水平。在细胞内通过瞬时转染和稳定转染的手段过表达g s t p l ，结果发现g s t p l 呈剂量效应和时间效应依赖性地抑制了l p s 激活的m a p k s ，包括e r k 、j n k 和 p 3 8 ，及n f k b 信号通路。通过抑制上游的信号通路，过表达g s t p l 抑制了肿 瘤坏死因子一a 和一氧化氮的合成和释放。结果表明g s t p l 在l p s 引起的炎症反 应中具有负向调控的功能，通过下调相关的信号通路减少促炎因子的过量产生。 t n f 一0 t 是一种多效性的细胞因子，具有诱导细胞增殖、分化、凋亡和炎症等 生物学效应。t n f a 主要由l p s 刺激的单核巨噬细胞产生，是最为重要的机体 内源诱生性促炎因子，也是l p s 引起的感染性疾病最直接和最关键的炎性介质。 在第三章中，我们发现并报道了g s t p l 在t n f a 激活的信号通路中的重要地位。 1 ) 体内和体外的实验结果显示g s t p l 蛋白能与t n f c 【通路中的重要的接头分 子t r a f 2 发生相互作用，t r a f 2 的t r a f 结构域介导了两者的结合。2 ) 过表 达g s t p l 抑制了t r a f 2 激活的j n k 和p 3 8 通路，而n f v d 3 信号通路不受影响。 国家重大基础研究( 9 7 3 ) 计划项目( 2 0 0 2 c b 5 1 3 0 0 0 ) 和国家自然科学基金( 3 0 2 7 0 5 2 7 ) 资助 ， 南京师范大学博士学位论文 在t n f - c t 激活的t r a f 2 一a s k l 信号级联中，过表达g s t p l 削弱了t r a f 2 诱导 的a s k l 自身磷酸化及其激酶催化活性，通过减少t r a f 2 - a s k l 之间的结合， 抑制了t r a f 2 一a s k l 信号级联依赖的细胞凋亡。相反，利用r n a 干扰手段下调 细胞中g s t p l 的蛋白水平导致了t n f a 刺激引起的t r a f 2 - a s k l 信号复合物含 量的增加及a s k l 和j n k 的过度与持续激活。3 ) 缺少“t r a fd o m a i n 结合基序” 的g s t p l 突变体与t r a f 2 的结合能力明显减弱，与野生型g s t p i 相比，其抑 制t r a f 2 - a s k i 信号级联的能力也显著下降。此外，g s t p i 的g s h 转移酶催化 活性并不参与对t r a f 2 信号的调节。这些结果表明g s t p l 通过与t r a f 2 发生 蛋白间相互作用来调节t n f 一激活的a s k i 一i n k 信号转导通路。 综上所述，本研究首次揭示了g s t p l 作为抗炎因子参与调节了l p s 引起的 炎症反应；提出了g s t p i 在胞内调节m a p k s 通路的新的作用机制。这些结果 对深入研究g s t p l 在细菌感染性炎症反应中的调节作用具有重要的指导意义。 关键词：谷胱甘肽s 转移酶p 1 ；细菌脂多糖；肿瘤坏死因子一；m a p k s ；n f r b t r a f 2 ；信号转导 南京师范大学博士学位论文 t h er e g u l a t o r yr o l eo fg l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s ep 1 ( g s t p l ) i n l p s a n dt n f 一位一i n d u c e ds i g n a l i n gp a t h w a y s a b s t r a c t h u m a ng l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s ep1i sau b i q u i t o u se x p r e s s e dp r o t e i nw h i c h p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ed e t o x i f l c a t i o na n dx e n o b i o t i c sm e t a b o l i s m p r e v i o u s s t u d i e ss h o wt h a tg s t p1i sac a n c e rm a r k e ra n da s s o c i a t e sw i t ha n t i c a n c e rd r u g r e s i s t a n c e nh a sa l s os h o w nt h a tg s t pli n t e r a c t sw i t hc - j u nn h 2 - t e r m i n a lk i n a s e ( j n k ) a n ds u p p r e s s e si t sa c t i v i t yi nt h ep r e s e n ts t u d 3 , , w er e p o r tt h a tg s t p lr e g u l a t e s t h el i p o p o l y s a c c h a r i d er l p s ) 一i n d u c e di n f l a m m a t o d , r e s p o n s ea n dt n f - d t r i g g e r e d s i g n a l i n gp a t h w a y s f i r s t l y , w es h o wt h a tg s t p 1i si n v o l v e di nl p s - i n d u c e di n f l a m m a t o r yr e s p o n s e g s t p le x p r e s s i o n ，d e t e r m i n e da tt h et r a n s c r i p t i o na n dt r a n s l a t i o nl e v e l s ，w e r e u p r e g u l a t e db y t h el p ss t i m u l a t i o ni nr a w 2 6 4 7m a c r o p h a g e l i k e c e l l s o v e r e x p r e s s i o no fg s t p 1i n h i b i t e dl p s - i n d u c e dm i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s ( m a p k s ) i n c l u d i n ge r k ，j n ka n dp 3 8a sw e l la sn f 一1 c ba c t i v a t i o nd o s e - a n dt i m e d e p e n d e n t l y i nt r a n s i e n tt r a n s f e c t e da n ds t a b l et r a n s f e c t e dc e l l s m o r e o v e lt h i s i n h i b i t i o no ft h es i g n a l i n gp a t h w a y sr e s u l t si nt h ed e c r e a s eo ft u m o rn e c r o s i sf a c t o r a l p h a ( t n f a ) a n dn i t r i co x i d e ( n o ) s y n t h e s e s t h e s ed a t as u g g e s tt h a tg s t p l p r e v e n t sl p s - i n d u c e de x c e s s i v ep r o d u c t i o no fp r o - i n f l a m m a t o r yf a c t o r sa n dp l a y sa n a n t i i n f l a m m a t o r yr o l ei nr e s p o n s et ol p s t n f c 【i sap l e i o t r o p i cc y t o k i n et h a te l i c i t saw i d es p e c t r u mo fp h y s i o l o g i c a la n d p a t h o g e n i c e v e n t si n c l u d i n gc e l l p r o l i f e r a t i o n ，d i f f e r e n t i a t i o n ，a p o p t o s i s a n d + s u p p o r t e db yg r a n t sf r o mt h em a j o rs t a t eb a s i cr e s e a r c hd e v e l o p m e n tp r o g r a mo fc h i n a ( 2 0 0 2 c b 5 1 3 0 0 0 ) a n dn a t i o n a ln a t u r es c i e n c ef o u n d a t i o no f c h i n a ( 3 0 2 7 0 5 2 7 ) 3 南京师范大学博士学位论文 i n f l a m m a t i o ne x c e s s i v er e l e a s eo ft h e t n f a p r o d u c e df r o m l p s a c t i v a t e d m o n o c y t e s m a c r o p h a g ec e i l s ，i st h ek e ym e d i a t o ri nt h ee a r l yp h a s eo fs e p t i cs h o c k i n t h et h i r dc h a p t e r , w er e p o r tan o v e lf u n c t i o no fg s t p li nr e g u l a t i n gt n f - a t r i g g e r e d s i g n a l i n gt h ep r e s e n te x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tg s t p 1 p h y s i c a l l ya s s o c i a t e dw i t h t u m o rn e c r o s i sf a c t o rr e c e p t o r a s s o c i a t e df a c t o r2 ( t r a f 2 ) i nv i v oa n di nv i t r o t h e t r a fd o m a i no ft r a f 2i sr e q u i r e df o rt h i si n t e r a c t i o no v e r e x p r e s s i o no fg s t p1 i n h i b i t e dt r a f 2 i n d u c e da c t i v a t i o no f b o t hj n ka n dp 3 8b u tn o to f n f - k b g s t p l a l s oa t t e n u a t e dt r a f 2 - e n h a n c e da s k la u t o ，p h o s p h o r y l a t i o na n di n h i b i t e dt r a f 2 - i n d u c e da s k la c t i v a t i o na n dc e i la p o p t o s i sb ys u p p r e s s i n gt h ei n t e r a c t i o no fa s k l c o n v e r s e l y , s i l e n c i n go fg s t p 1e x p r e s s i o nl e v e lt h r o u g h tr n ai n t e r f e r e n c e ( r n a i ) r e s u l t e di ni n c r e a s eo ft n f d e p e n d e n tt r a f 2 一a s k la s s o c i a f t o nf o l l o w e db y h y p e ra n ds u s t a i n e da c t i v a t i o no fa s k ia n dj n kam u t a n tg s t p ll a c k i n gt r a f d o m a i n - b i n d i n gm o t i fe x h i b i t e das i g n i f i c a n td e c l i n eo fc a p a c i t yt ob i n dt r a f 2a n d b l o c kt r a f 2 - a s k ls i g n a l i n gc o m p a r e dw i t ht h ew i l dt y p eo fg s t p1 m o r e o v e r , t h e g l u t a t h i o n e c o n j u g a t i n ga c t m t yo fg s t p lw a sn o t i n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no f t r a f 2s i g n a l i n g t h e s ef i n d i n g si n d i c a t e dt h a tg s t p1p l a y sa ni m p o r t a n tr e g u l a t o r y r o l ei nt n f i n d u c e ds i g n a l i n gb yf o r m i n gl i g a n d b i n d i n gi n t e r a c t i o n sw i t ht r a f 2 i nc o n c l u s i o n ，o u rs t u d yr e v e a l san o v e lr o l eo fg s t p1a sa na n t i i n f l a m m a t o r y f a c t o ri nc e l l u l a rr e s p o n s et ol p sa n de l u c i d a t e san e wl i g a n d b i n d i n gf u n c t i o no f g s t p1t or e g u l a t em a p k sv i ai n t e r a c t i n gw i t ht h ea d a p t o rp r o t e i nt r a f 2 ，w h i c h p r o v i d e s an e wi n s i g h tf o r a n a l y z i n g t h ep r o t e c t i v ee f f e c t so fg s t p l 1 i n i n f l a m m a t o r yr e s p o n s e k e yw o r d s ：g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s epl ；l i p o p 0 1 y s a c c h a r i d e ；t u m o rn e c r o s i sf a c t o r a m a p k s ；n f 一1 c b ：t r a f 2 ；s i g n a lt r a n s d u c t i o n 4 南京目i 范大学博士学位论文 第一鬻绷荫感染性炎瘰反成与谷胱甘肽舅转移酶p l ( 文献综述) 绪富： 炎瘥( 趣蠡n m 激i o o ) 避高等赫赫对搂镶整裁滤黼发生翡一粹疆蒋豁效应为 主粒萋本茨席过程，楚体隧多耱燕瘸藏癞理过程的一耱热褰秘病理现象，涔投感 染、刨伤、徕竞、移植免疫排斥等痈璎过程以及动脉粥样硬能、懿蕊瀑。陡燕节炎、 串蕊、糖蒜病寝懋霉性癔暴譬辐焚蒺癌。嶷痰夏应过程烹饔袭瑗海撬裕澎群灌织 发生变藤( 包括变矬袒坏死) 、渗出( 斑鹰厦应、液俸与细服渗_ 哇! ) 及增熊改变， 瞒漾表现为锺、黔、熬、癌辩璃髓簿蒋等，磷撼髂垒鸯劂露律毒不同程度越发热、 囱辫藤蠖多釉代嚣壤强簿瘸琏靛瘦。j 乍惫一秘教期避佬彩成妁防辩轨制，遣度的 旋症反应有镕4 予隈锚捧漓灭致斑网子，邋过免瘦茉统清除 橙斡滴繇俸和环弼缎 缎，程避舞帮穆复，嫠舞维护穰簿熬俸餍。然蔼炎燕一盥毒鳃紊熬蠛过激葭应， 太璺分泌姻诱襞囊缓炎燕子将造戏企身隧的维缀炭性擐镄，导致多擗怠悭骂慢性 燕爱度废疾满的发生( 包据脓毒癜、穗鼹翡和动脉粥群硬德等) ，严。重砖可危聂 瘸天豹燕鸯。霹赶，研键受症魇馥姻发垒与精礁溪控梗锶其有二器嚣重要豹蠹义 ( g a b a ya n d k u s h n e r , 1 9 9 9 ；n i s h i k a w a 鲋a l 。，2 0 0 0 ；l i b b y , 2 0 0 2 ；t r a c e y , 2 0 0 2 ) 。 一黢甄青，凡是貔造壤餐毅籁髓聂发生臻理荽! 张磊g l 遐袭症反应越疆豢帮统 稼为致囊翻予。根据其采嚣翱捧餍秀式瓣不阕，致嶷因子六致分鸯四类：1 ) 生 物畿添予，主要包括缅蒴、瘸毒、支蒙俸强粪蕊等微生榜投箕寄生予掇髓蔗产垒 螃抗深麴臻；2 ) 镑理健毽子，商溢、放射线、u v 、电丧翻挤妥等造或缎熬辆伤 的物理作弼均具程但嶷敞应；3 ) 纯学瞧露予，娜强酸碱、| 起源簿慷物穗裙代谢 产褥等嚣够瓷接鹱辩藩的；l 趣受癌嚣瘟；4 ) 免疫发建，异鬻免菠瑟应璜造我的 船织擐揍髓引莛多耪交卷厦应犍受攘，赫瞥小簿肾嶷、系统性曩斑狼疮秘缋节褴 多动躲嶷等( n a t h m k 2 0 0 2 ) 。在这些炎癌发应遘程申，盎臻黪性图芋引起瓣受寝 滋毙潦染f i 女f e e d e n ) ，魁接磐冤。靳最重嚣盼一娄炎癍。其中究以绷蓠盛辩对飘落 ( 毽括簿郄缀缀穗j 全垮器雷) 盼惫謦最鸯严壤l a v o i e 耐d ，1 9 9 9 ；c o h e n ：2 0 0 2 。 南京师范大学博士学位论文 第一节细菌感染性炎症反应 细菌严重感染引起的失控性炎症反应( u n c o n t r o l l e di n f l a m m a t o r yr e s p o n s e ) 能导致全身炎症反应综合征( s y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e s p o n s es y n d r o m e ，s i r s ) ， 也称作脓毒症( s e p s i s ) ，并进而诱发多器官功能障碍综合征( m u l t i p l eo r g a n d y s f u n c t i o ns y n d r o m e ，m o d s ) 乃至多器官衰竭( m u l t i p l eo r g a nf a i l u r e ，m o f ) ( k n a u se ta l ，l9 9 2 ；啪e e l e ra n db e m a r d ，1 9 9 9 ；o b e r h o l z e re ta l ，2 0 0 1 ) 。流行病 学统计资料显示，美国每年约有逾4 0 万例脓毒症患者，其中死亡病例高达3 5 以上( g a n d o e ta 1 1 9 9 8 ；m e s t e r se ta l ，2 0 0 0 ) 。据临床统计，在细菌严重感染导 致的脓毒症中，革兰氏阴性菌( g ) ( 6 0 ) 感染多于革兰氏阳性菌( g + ) ( 4 0 ) ， 前者多表现为低排高阻型冷休克，而后者发生中毒性休克为数较少，且部分表现 为低阻型休克( a s t i za n dr a c k o w , 1 9 9 8 ；m e s t e r se ta 1 ，2 0 0 0 ；a n g u se ta l ，2 0 0 1 ； c o h e n2 0 0 2 ) 。 脂多糖( 1 i p o p o l 5 r s a c c h a r i d e ，l p s ) ，有时又称内毒素( e n d o t o x i n ) ，是革兰氏 阴性菌外膜的一种糖脂复合物，在细菌感染导致的急性炎症反应中起着关键的作 用。革兰氏阴性菌感染引起的脓毒性休克的致死效应主要由l p s 的生物学效应 所介导。对宿主机体而言，过量的l p s 是单核巨噬细胞强烈的激活物，主要通 过后者胞内的丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s ，m a p k s ) 和核转录因子( n u c l e a rf a c t o r k b ，n f - k b ) 两条信号转导通路活化多种转录因子， 从而合成并释放多种促炎因子，主要包括肿瘤坏死因子一( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - 旺， t n f a ) 、自细胞介素1 ( i n t e r l e u k i n 1 ，i l - 1 ) 和一氧化氮( n i t r i co x i d e ，n o ) 等。 这些炎症介质通过旁分泌或体循环等形式作用于其它组织细胞，促进其发生增 殖、凋亡、分化以及大量释放其它致炎物质，影响细胞的代谢，脏器功能和屏障 功能的完整性，引起s i r s 及m o d s 和m o f ( b a u m a n na n dg a u l d i e ，1 9 9 4 ； m e d z h i t o ve ta l ，19 9 7 ；h o t c h k i s se ta l ，19 9 9 ；u l e v i t c ha n dt o b i a s ，19 9 9 ；a d e r e m a n du l e v i t c h ，2 0 0 0 ；b e u t i e ra n dr i e t s c h e l ，2 0 0 3 ) 。 南京师范大学博士学位论文 一、脂多糖及其生物学效应 早在2 0 世纪初，r i c h a r dp f e i f f e r 在研究霍乱弧菌时发现革兰氏阴性菌中有 一种相对不溶性成分，能够引起发热、休克和器官损害等多种病理反应，因其毒 性效应和性质与外毒素( e x o t o x i n ) 存在显著差异，因而以内毒素( e n d o t o x i n ) 这一术语来描述该物质。随后多年来对革兰氏阴性菌外膜的超微结构技术和生物 分析技术的研究证实内毒素是磷脂双分子层结构，细胞膜的外部主要由结构易变 的两性分子一一即脂多糖( l p s ) 组成。 ( 一) l p s 的结构组成 l p s 分子的基本结构由三部分共价连接而成，即0 一特异性抗原多糖 ( o s p e c i f i ca n t i g e np o l y s a c c h a r i d e ) 、核心多糖( c o r ep o t y s a c c h a r i d e ) 及脂质a ( 1 i p i d a ) ( f i g u r e1 ) ( g u h aa n d m a c k m a n ，2 0 0 1 ) 。研究表明，脂质a 为l p s 的 毒性中心，而多糖部分仅有少许或者根本没有生物学效应。值得注意的是，许多 ( g u h aa n dm a c k m a n ，2 0 0 1 ，c e ls i g n a l1 3 8 5 9 4 ) f i g u r e1 t h es t r u c t u r eo fl p s 南京师范大学博士学位论文 文献中l p s 和内毒素这两个术语几乎混用，但从严格意义上而言两者存在着一 定区别：从结构上分析，内毒素是由脂多糖和蛋白质复合而组成；而对其生物学 效应研究证实，纯化或合成的l p s 仅能通过细胞膜表面t o i l 样受体4 ( t o l l l i k e r e c e p t o r4 ，t l r 4 ) 传递信号，而内毒素或“内毒素结合蛋自”可以通过t l r 2 进 行信号转导而发挥效应。因此内毒素的概念比l p s 要更为广泛。 ( 二) l p s 的主要生物学功能 目前的研究普遍认为，l p s 在宿主体内主要通过影响机体的介导系统来发挥 其生物学效应。宿主介导系统可分为细胞和体液两大类，前者指单核巨噬细胞、 血小板、中性粒细胞、淋巴细胞和内皮细胞等；后者则主要包括补体和凝血系统。 l p s 作用于介导系统，一方面发挥其激活天然免疫系统的功能，另一方面，过量 的l p s 又能强烈引发多种病理过程。 哆卜= 乞+ 器一。呈璺帕抽 l y s e db a c t e r i a l l p sb m d m 5 p f o | e i nc o r n p l e x 。 c e l l s 1 1r m e i n h t t p ：w w w k c o m e d u f a c u f t y c h a m b e r l a i n w e b s i t e l e c t u r e s l e c t u r e i m a g e s e p s i s1 r l f f i g u r e2 h a r m f u le f f e c t so fl p sr e l e a s e df r o mt h eg r a m - n e g a t i v ec e l lw a l l 南京师范大学博士学位论文 低剂量的l p s 对于宿主机体具有一定的有利效应，包括增强宿主的非特异 性免疫，诱导非特异性感染耐受，抗辐射作用和促使白细胞与内皮细胞的黏附等 等，这些效应都有利于机体自身免疫系统的维护与平衡。 当宿主机体受到革兰氏阴性菌强烈感染时，过量脱落并释放的l p s 特异性 激活单核巨噬细胞合成并分泌过量的机体内源诱生型促炎细胞因子，如t n f 氓 i l 1 、i l 一6 、i l 一8 和血小板活化因子( p l a t e l e t a c t i v a t i n gf a c t o r ，p a f ) 等等，这些 促炎因子再作用于各自的靶细胞，通过激活补体途径、凝血途径以及合成并释放 前列腺素( p r o s t a g l a n d i n s ) 、白三烯( 1 e u k o t r e i n s ) 和r o s 等炎症效应分子，导 致组织细胞损伤与器官衰竭。临床上表现为病人机体发热、自细胞增多或减少、 凝血系统紊乱，低血压和心动过速等毒性症状并随后引发s i r s 甚至m o d s ( f i g u r e2 ) ( a s t i za n dr a c k o w , 19 9 8 ) 。 二、肿瘤坏死因子一o t ( t n f 一) 在细菌感染性炎症中的作用 如前所述，l p s 介导的革兰氏阴性菌强烈感染能促进组织细胞损伤和器官衰 竭。现已证实，l p s 本身并不能直接引起机体的这些临床病理现象，而是通过过 量诱生宿主内源性的促炎细胞因子，后者以旁分泌和体循环方式进一步作用于其 它组织细胞，引起炎症反应的扩大。过量生成的炎症因子对于机体的组织细胞起 到再次刺激和损伤的作用，与原始l p s 的效应相比其损害更为严重和广泛。这 就是所谓的细菌感染的“二次打击”学说( r a e t z ，1 9 9 0 ；u l e v i t c ha n dt o b i a s ，1 9 9 9 ； p a p a d a k i sa n dt a r g a n ，2 0 0 0 ；b e u t l e ra n dr i e t s c h e l ，2 0 0 3 ；f u j i h a r a e la 1 ，2 0 0 3 ) 。 1 9 7 5 年，c a r s w e l l 等发现对于接种卡介苗的小鼠再以内毒素刺激，血清中能 出现一种在体外能诱导肿瘤组织出血坏死的物质，并把它定义为肿瘤坏死因子 ( t u m o r n e c r o s i s f a c t o r ，t n f ) ( c a r s w e l le t a l ，1 9 7 5 ) 。 目前，t n f 一是公认的最为重要的一个内源诱生型促炎细胞因子，也是l p s 引起的感染性疾病最直接和最关键的炎性介质，通过激活靶细胞内m a p k s 与 n f 心通路以及c a s p a s e s 级联使细胞发生增殖、分化、凋亡和炎症等应激反应， 对体内多种组织和器官均有着显著的刺激效应( l e d g e r w o o de ta l ，1 9 9 9 ；m a n n e l 南京师范大学博士学位论文 a n de c h t e n a c h e r ，2 0 0 0 ；b a u da n dk a r i n ，2 0 01 ；m a c e w a n2 0 0 2 aa n d2 0 0 2 b ；x a u se t a 1 ，2 0 0 0 ；l o c k s l e ye t a l ，2 0 0 1 ；p f e f f e r ，2 0 0 3 ) 。 ( 一) t n f 一的来源与结构 内源性t n f d 是具有脂溶性的糖蛋自低聚物，广泛存在于内脏器官、皮肤、 肌肉、自细胞、胚胎组织和神经组织中。t n f - g 【主要由l p s 激括的单核巨噬细 胞分泌产生，但多形核白细胞、平滑肌细胞、星型胶质细胞及一些肿瘤细胞也可 以自发或经过诱导产生t n f 一。正常人体循环中的t n f 一口水平为1 0 8 0 n g l ( l o c k s l e ye la l ，2 0 0 1 ) 。 成熟的t n f 一蛋自由1 5 7 个氨基酸残基组成，含有一个二硫键( c 6 9 一c 1 0 1 ) ， 分子量约为1 7 k d ，等电点为5 6 。人t n f d 前体为2 3 3 肽，氨基端的7 6 肽不是 信号肽，但能将t n f - 前体形式固定在细胞膜上，使成熟的分泌型t n f - c 【保留 在细胞表面。膜结合型的t n f - 是i i 型跨膜蛋白( 氨基端在胞内，羧基端位于 胞外 ，膜结合型t n f a 介导了细胞毒理效应，可直接与相邻细胞表面的t n f - 受体( t n f ar e c e p t o r ，t n f r ) 结合，发挥其旁分泌效应( k r i e g l e re ta 1 ，1 9 8 8 ) 。 特异性的金属蛋白酶( m e t a l l o p r o t e i n a s e ) 能通过水解作用在细胞活化时从膜上 释放出可溶性的t n f c 【( b l a c ke ta l ，1 9 9 7 ；i d r i s sa n dn a i s m i t h ，2 0 0 0 ) 。 t n f 一的二级结构主要是p 折叠，x r a y 衍射分析证明，天然t n f d 是以非 共价键连接的三聚体，以三重轴对称形成一个铃状结构；t n f c 【单体有两个p 折叠和5 个反平行的p 折叠串，单体之间相互结合形成稳定的三聚体。单体的羧 基端卷在p 折叠内，氨基端暴露在外。单体两两接触区是t n f - a 结合t n f r 的 结构域，三聚体形成的三个结构域结合三个相邻或成簇的受体，诱导使受体发生 三聚化，进而启动胞内信号的传递( e c ka n ds p r a n g ，1 9 8 9 ) 。 ( 二) t n f n 的产生与调节 人t n f a 基因位于染色体6 p 2 1 1 - p 2 2 ，由4 个外显子和3 个内含子组成，其 m r n a 长度约为1 7 k b 。t n f q 基因在其转录起始位点上游存在着多个调控元件， 0 南京师范大学博士学位论文 包括yb o x 启动子、c a m p 反应元件、c j u r g a p 一1 以及至少有5 个n f - r b 增强子 结合序列。l p s 刺激能调节t n f 一m r n a 的3 端非翻译区的特异性位点，促进 其稳定性增高，显著减少其降解率，使得丁n f 一0 tm r n a 在胞内聚集1 0 0 倍，增 加t n f a 的蛋白质翻译，导致高t n f - c 【血症，表现出l p s 的毒性效应( s p r i g g s e ta l ，1 9 9 2 ；k o n t o y i a n n i se la l ，1 9 9 9 ) 。 正向调节t n f e t 表达的因素很多，包括多种病原体及其产物，如l p s 、脂 蛋白、葡聚糖和支原体；自身病变组织或应激时的反应产物，如干扰素、i l 一2 、 集落刺激因子、活性氧和抗c d 3 单克隆抗体等等。而l p s 是诱导t n f a 产生最 有效的物质，单核巨噬细胞经l p s 刺激后，t n f a 基因转录增加3 倍，胞内m r n a 含量增加近1 0 0 倍，而蛋白含量可达1 , 0 0 0 倍，说明三者之间并不存在- - 0 e 平行 关系，具体的调控机理目前尚不得而知。 1 9 8 5 年，b e u t l e r 等提供确凿的证据表明t n f c 【作为炎症介质参与l p s 引起 的脓毒症的病理生理变化。在小鼠体内直接注射t n f 一所诱导的组织病理学和 病理生理学的变化与l p s 诱导的表现极为类似，如出现组织广泛出血坏死、自 细胞浸润、低血压和低代谢率等；使用致死剂量的l p s 刺激小鼠之前，若给予 t n f 抗血清，能显著降低l p s 所致的死亡率( b e u t l e re t a l ，1 9 8 5 a ) 。此后的许 多研究报道都证实了t n f a 是l p s 发病早期的最重要介质( b e u t l e r e la l ，1 9 8 5 b ； b e u t l e ra n dc e r a m i ，19 8 6 ；o l d ，19 8 5a n d19 8 8 ；a b r a h a me ta 1 ，19 9 8 ；f e l d m a n na n d m a i n i ，2 0 0 1 ) 。临床上可以通过人为干预降低细菌感染病人的血液中t n f - q 水平 来控制脓毒症，以此降低病人的死亡率( m a c d o n a l de ta l ，2 0 0 0 ；m c d e r m o t t ，2 0 0 1 ； t a y l o r , 2 0 0 1 ) 。 ( 三) t n f - a 的生物学功能 t n f c 【的主要生物学效应与其在机体内的含量密切相关，在其本底浓度( 约 1 0 - 9 m o l l ) 时，t n f 一在局部起着旁分泌和自分泌调节自细胞和内皮细胞的作用， 主要包括( i d r i s sa n dn a i s m i t h ，2 0 0 0 ) ： 1 ) t n f 一引起血管内皮细胞表达表面受体( 黏附分子) ，使得内皮细胞与自 南京师范大学博士学位论文 细胞发生黏附，最初为中性粒细胞，接着是单核细胞和淋巴细胞，t n f 一的这一 作用可导致自细胞在炎症的局部积聚。 2 ) t n f 一可激活自细胞杀灭微生物，t n f 一能特异性激活中性粒细胞以及 增强巨噬细胞吞噬和分泌细胞因子的能力，有利于清除入侵的病原体及其成分， 同时也诱导嗜酸性粒细胞和单核巨噬细胞发生凋亡。 3 ) t n f a 可刺激单核巨噬细胞和其它类型的细胞产生细胞因子，包括i l - 1 、 i l 一6 、t n f - 自身以及趋化因子等。 4 ) t n f q 可以产生干扰素样抗病毒的保护效应，并诱使组织相容性复合体 i 类分子表达上调，增强细胞毒性t 淋巴细胞( c y t o t o x i c i t ytl y m p h o c y t e ，c t l ) 介导的溶解病毒感染细胞的作用。 当机体受到严重的革兰氏阴性菌感染时大量诱生t n f ，血液中过量的 t n f 一则以旁分泌或体循环等形式发挥着促炎效应( w a a g ee t a l ，1 9 8 7 ；k o l l i a se t a l ，1 9 9 9 ；s c h l u t e ra n dd e c k e r t ，2 0 0 0 ) ( f i g u r e3 ) ： 1 ) 对靶细胞的多重效应。t n f a 能够诱导敏感细胞凋亡或坏死，l p s 诱生 的t n f 一促使巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞以及脏器实质细胞等发生凋亡 或坏死；t n f a 能快速、强烈并且不可逆的抑制红细胞系前体和红系、粒系肿瘤 细胞( k 5 6 2 、h e 2 和h l - 6 0 等) 的生长；t n f c t 还能促进人成纤维细胞增殖， 以及诱导正常造血组织、肺成纤维细胞和血管内皮细胞表达和分泌集落刺激因 子、干扰素和i l 一6 等细胞因子，放大其促炎效应。 2 ) 对血管和凝血系统的影响。t n f 能够增加组织因子的表达，抑制抗凝 蛋白c 的辅助因子活性，从而引起血管内皮细胞的促凝血活性；t n f 一能促使 内皮细胞结构发生改变，抑制其生长或使其直接发生损伤，导致血浆蛋白和水大 量渗入组织，使机体发生毛细血管渗漏综合征；同时血液中大量存在的t n f a 还能引起广泛的凝血并使器官坏死，全身脱水和呼吸功能衰竭，导致s i r s 发生。 3 ) 对器官系统的综合作用。a ，肝脏：t n f 一诱导肝脏产生急性时相蛋白， 抑制白蛋自的合成，通过诱生的i l 一1 和i l 一6 还能放大这种效应；t n f - q 直接刺 激循环系统中脂质增加，过度的脂质生成引起急性炎症反应中常见的高三酰甘油 南京师范大学博士学位论文 血症。b ，心血管系统：大量t n f a 释放到循环中导致了机体外周血压下降、心 脏排血量减少和静脉血容量减少，出现低血压休克和心力衰竭等综合症状。同时 t n f a 诱导内皮细胞产生的n o 还能减弱外周血管的弹性和心脏的功能。c ，肺 脏：t n f 一诱导肺内皮细胞和巨噬细胞活化、自细胞迁移、粒细胞脱颗粒和毛细 血管渗漏，积聚的水肿液可进一步阻碍肺泡细胞和巨噬细胞的灌流和氧气交换， 引起急性呼吸窘迫综合征( a c u t er e s p i r a t i o nd i s t r e s ss y n d r o m e ，a r d s ) 。 4 ) 对肿瘤组织的作用。a ，直接杀伤作用：t n f 与t n f r 结合并发生内 化( i n t e r n a l i z a t i o n ) ，与溶酶体融合并增加其通透性，溶酶体中的蛋自酶类外泄 导致靶细胞坏死，出现细胞肿胀、胞膜破溃、胞核及细胞器溶解等病理变化； t n f 一与靶细胞受体结合后同样引起胞内一连串信号转导的变化，最终导致细胞 发生凋亡。b ：介导肿瘤免疫反应：t n f 一通过