（微生物学专业论文）热带假丝酵母辅酶q10高产菌的选育及发酵条件优化研究.pdf

摘要 量减少， 纯 化样品中 辅酶q 1 。 的 含量达到9 8 . 1 6 % e 5 . 对辅酶q i o 的 检测进行了 研究，比 较了u v法、 t l c - u v法与h p l c 法三种检测方法的相关性，并对其检测结果进行了验证，确定以u v法作为 育种与发酵优化实验中的快速检测方法，可以 采用 t l c - u v法进行定量分 析， 其检测结果与 h p l c法相差 9 .2 %，在常规实验条件下能够对辅酶 q t o 的发酵单位进行准确的检测。 关键词: 热带假丝酵母、辅酶q 1 o 、诱变育种、发酵优化、 提取纯化 ab s t r a c t ab s t r act c o e n z y m e q 1 o ,a k i n d o f li p i d s o l u b l e c o m p o u n d o f q u i n o n e h o m o l o g , g e n e r a ll y e x i s t s i n t h e a n i m a l ,v e g e t a t i o n a n d m i c r o o r g a n i s m w i t h m i c r o a m o u n t , i t p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e a s a m e m b e r i n t h e re s p i r a t o ry c h a i n . c o e n z y m e q , o e x h i b i t e s e x c e ll e n t m e d i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l a c t i v it i e s a g a i n s t v a r i o u s d i s e a s e s it i s t h e n a t u r a l a n t i o x i d a n t i n v i v o , a c t i v a t i n g a g e n t o f m e t a b o li s m , it c a n i m p r o v e t h e i m m u n i ty o f o r g a n i s m a n d h a v e a g e n e r a l u s a g e i n c l i n i c . a s a n p a r e n t s t r a i n i n t h i s r e s e a r c h ,t h e m u t a g e n i c b r e e d i n g for t h e h i g h p r o d u c t i v i ty c o e n z y m e q , o s t r a i n w i t h c a n d i d a t ro p i c a l i s a s 2 . 1 3 8 7 w a s s t u d i e d i n t h i s p a p e r , a n d o p t i m i z e d山 e f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s a n d t h e e x t r a c t t e c h n o l o g y i n e v e ry a s p e c t s m a d e a g r e a t p r o g r e s s i n i n c r e a s i n g t h e f e r m e n t a t i o n u n i t o f c o e n z y m e qo .t h e m a i n re s e a r c h r e s u l t s t o l i s t i n t h e f o ll o w . 1 . a s a n o r i g i n a l s t r a in i n t h i s re s e a r c h ,t h e m u t a g e n i c e ff e c t o f c a ndid a t r o p i c a l is a s 2 . 1 3 8 7 w a s s t u d i e d b y u s i n g s i n g l e f a c t o r u v r a d i a t i o n， d i e t h y l s u l f a t e m u t a g e n a n d t h e c o m p o s i t e m u t a g e n e s i s .i t i s f o u n d t h a t t h e u v d e s c o m p o s i t e m u t a g e n e s i s i s t h e b e s t mo d e f o r b r e e d i n g t h e re s i s t a n c e h i g h y i e l d s t r a i n , a n d t h e s u i t a b l e d o s e i s 1 场v o l u m e o f c o n c e n t r a t i o n d e s t o d e a l w i t h 4 0 m i n u t e s ,a n d t h e n e x p o s u r e w i t h u v - r a d ia t i o n f o r 6 0 s e c o n d s ， t h e l e t h a l i ty a n d t h e m u t a t i o n r a t e w e re 9 1 .5 % a n d 2 .7 1 % ; i n b r e e d i n g f o r t h e a u x o t ro p h s t r a i n ,t h e s i n g l e f a c t o r w i t h d i e t h y l s u l f a t e w a s t h e b e s t m u t a g e n e s i s m o d e , a n d t h e m u t a t i o n r a t e o f a u x o t ro p h w a s t h e h i g h e s t , th e s u i t a b l e d o s e w a s 1 % v o l u m e o f c o n c e n t r a t i o n d e s t o d e a l w i t h 4 0 m i n u t e s ,a n d t h e m u t a t i o n r a t e re a c h e d 2 .3 % .t h i s re s e a r c h c o n s t r u c t e d a c o n v e n i e n t h i g h p r o d u c t i v ity c o e n z y m e q t o m u t a n t s c r e e n i n g m e t h o d . s c r e e n i n g t h e g e n e r a l h i g h - r e s i s t a n t t o a c t i n o m y c i n - d m u t a n t s i n t h e fi r s t r u n o f s c r e e n i n g，s u b s e q u e n t l y妙 m e a n s o f h i g h c o n c e n t r a t i o n p r e c u r s o r s u b s ta n c e p - h y d r o x y b e n z c i c a c i d，a n d t h e h i g h c o n c e n t r a t i o n s t r u c t u r e a n a l o g o f t h e e n d p r o d u c t vit a m i n k 3 ， a h i g h p r o d u c t i v i ty c o e n z y m e q t o m u t a n t a p v 1 2 w i t h g o o d g e n e t i c s t a b i l i ty w a s g a i n e d , a n d t h e c o e n z y m e q t o y i e l d o f t h e a p v 1 2 re a c h e d 2 3 .9 5 8 m g / l u l t i m a t l y , w h i c h w a s 1 .7 6 t i m e s h i g h e r t h a n t h e o r i g i n a l s t r a i n . 2 . t h e f e r me n t a t i o n c o n d i t i o n s o f mu t a n t ap v 1 2 we r e s t u d i e d i n t h i s p a p e r .t h e f e r m e n t a t i o n m e d i u m w e re o p t i m i z e d ， 山 e o p t i m u m m e d i u m c o n s i s t e d o f g l u c o s e 3 .5 0/ u , y e a s t e x tr a c t 0 .6 % , p e p t o n e 0 .4 % , ( n h 4 ) 2 s o 4 0 . 1 % , c o m fl o u r 0 . 1 % , m g s o 4 . 7 h 2 0 0 .0 5 % , k 2 h p 0 4 0 .0 5 % , k h 2 p o 4 0 . 1 % , c a c 1 2 0 . 1 / o , n a a c 0 . 2 % . t h e a d d i t i o n ab s t r a c t o f s u b s t a n c e s s u c h a s p - h y d r o x y b e n z c i c a c i d ,c a r r o t j u i ce ,t o m a t o j u i c e t o g r o w t h m e d i u m w e r e s t u d i e d , t h e y c a n s t r e n g t h e n t h e a c c u m u l a t i o n o f c o e n z y m e q t o , a n d t h e s u it a b l e d o s e w a s p - h y d r o x y b e n z c i c a c i d :0 . 1 5 % , c a r r o t j u i ce: 0 .6 % , t o m a t o j u i ce:0 .4 % . 3 . t b r o u g h t h e o p t i m iz a t i o n o f t h e f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ,t h e s u i t a b l e f e r m e n t a t i o n c o n d it i o n s o f t h e m u t a n t a p v 1 2 w e r e : t e m p e r a t u r e : 3 0 1c , i n it i a l 州:6 . 0 , i n o c u l u m s i z e : 6 % , t h e v o l u m e o f m e d i u m w a s 6 0 m 1 i n 2 5 0 m fl a s k v o l u me , a n d t h e b e s t f e r m e n t a t i o n t i me w a s 4 8 h , t h e cell b i o m a s s a n d t h e c o e n z y m e q i o p r o d u c t i o n a l l h i g h e r t h a n t h e p a r e n t s t r a i n , th e c o e n z y m e q , o f e r m e n ta t i o n u n i t r e a c h e d 2 8 . 1 0 2 m g / l ,i n c r e a s e d 1 7 .3 % t h a n p a r e n t , a n d t h e c o e n z y m e q i o f e r m e n t a t i o n u n i t o f a p v 1 2 w a s 2 .2 4 t i m e s t h a n t h e p a re n t s t r a i n u l t i m a t l y . 4 . e x t r a c t i o n m e t h o d s w e re i n v e s t i g a t e d i n t h i s p a p e r , a n d t h e o p t i m u m e x t r a c t c o n d i t i o n s wa s t h a t 2 mo l / l c o n c e n t r a t i o n o f na oh u e s d f o r c e l l wa ll d i s r u p t i n g a n d s a p o n i fi c a t i o n , t h e o p t im u m t e m p e r a t u r e a n d t i m e o f s a p o n i fi c a t i o n w e re 9 0 1c a n d 6 0 m i n . u s 吨 a c e t o n e t o d e a l w i t h t h e ce l l s r e s i d u e a ft e r a b s t r a c t i o n妙 l i g h t p e t r o l e u m t h e p r o d u c t i o n i n c r e a s e d 5 8 . 9 % a ft e r e x t r a c t i o n p r o c e d u re o p t i m i z a t i o n , t h e f o re i g n m a t e r i a l w a s d e c re a s e d i n gr e a t p r o gr e s s i n t h e s a m p l e a ft e r c h r o m a t o gr a p h y a n d t h e c o e n z y m e q i o c o n t e n t re a c h e d 9 8 . 1 6 % i n t h e p u r i fi c a t i o n s a m p l e . 5 . t h e c o e n z y m e q , o d e t e c t i o n m e t h o d s w a s s t u d i e d i n t h i s p a p e r t h e c o r r e l a t i o n o f t h r e e d e t e c t i o n m e t h o d s i n c l u d in g u v m e t h o 氏 t l c - u v m e t h o d , h p l c m e t h o d w a s c o m p a r e d , a n d t h e u v m e t h o d c a n u s e d a s a k i n d o f f a s t d e t e c t i o n m e t h o d i n f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s o p t i m i z a t i o n re s e a r c h , a n d t h e t l c - l t v m e t h o d c a n u s e d a s f a s t q u a n t it a t i v e a n a l y s i s , i t s r e s u l t w a s 9 .2 % r e l a t i v e a c c u r a c y c o m p a r e d w it h h p l c d e t e c t i o n . k e y w o r d s : c a ndi d a t r o p i c a l i s ; c o e n z y m e q , o ; m u t a t i o n ; b r e e d i n g ; f e r m e n t a t i o n o p t i m i z a t i o n ; e x t r a c t i o n ;p u r i f i c a t i o n ; 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所 呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。 据我所知， 除了文中特别加以 标注和致谢的地方外， 论文中 不包含 其 他人已 经发表或撰写过的 研究成果， 也不包 含为获得 南昌大学 或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同 工作的同志对本研究所做的 任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学 位 论 文 作 者 签 “ (手 写 ，:4 i 签 字 日 期 : ， 夕 年 月 z / fh 学位论文版权使用授权书 本学 位 论 文 作 者 完 全了 解 鱼$ 达-有 关 保留 、 使 用 学 位论 文 的 规 定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和 借阅。 本人授权南昌大李可以 将学位论文的 全部或 部分内容编入有关数据库进 行检索，可以 采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学 位 论 文 作 者 签 “ (手 写 : 动者 签 字 日 期2 -o 07 年b 月 ， ) 日 ” 师 签 “ (手 写 ，: 介 育 庄 签 字 日 期 : 2 0 0 瓜 月 211 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 电话: 通讯地址 : 邮编: 第 1 章 绪论 第1 章 绪论 1 . 1辅酶q ,。 的基本性状 辅酶q 1 o ， 又称泛e, 癸 烯n( 商品 名: u b i q u i n o n e - 1 0 , c o e n z y m e q i o ， 简 称 c o q 1 o )，是一类脂溶性酮类化合物， 化学名称为2 , 3 一 二甲 氧基一 5 一 甲 基一 6 - 癸 异戊 烯基 苯醒 ， 其 分 子 式为c s 9 h 9 o o 4 ， 分子量为8 6 3 .3 6 , 结构 式 如图1 . 1 所示 il l . 辅酶q 1 。 为 黄色或橙 黄色结晶 性粉末， 无臭无味， 易溶 于氛仿、 苯、四 氯 化碳， 溶 于丙 酮、 石油醚及乙 醚， 微溶于乙 醉， 不溶于水和甲 醉。 在光照下易分解成微红色， 对温 度和 湿度较稳定， 熔点为4 8 .0 - 5 0 .0 102 1 . 严 ( c i a c f 3 =c -c h 2 ) io h c s 同时， 辅酶q 1 0 亦是一 种与网 状 内皮组织系统有关的酿类化合物，能够提高机体免疫力。 1 . 2辅酶。 ， 。 的生理、药理功能研究 1 9 4 0 年，m o o re等15 1首次 鉴定了 辅酶q 1 。 的作用 ， 但未引 起临 床界的重视。 1 9 5 7 年，美国威斯康辛大学酶研究所的f r e d e r i c k g r a n e 博士和他的研究小 组首次成 功的 从牛心的 线粒 体中 分离出了 辅酶q 1 。 并测出 其化学结 构y . ， 证实 辅 i 第 1 章 绪论 酶 q i o 实际上在哺乳类动物的 呼吸传递链的氧化还原载体中 起重要作用， 现己 知 辅酶q 1 。 是呼吸链中n a d h脱氢酶、 alm酸脱氢酶 和b e 复合 物之间的 脂溶性电 子载体， 是细胞能量生成要素， 具有抗氧化性、消除自 由 基、 提高机体免疫力等功 能。 1 9 5 8 年， k a r l f o l l k e r s 和m e r c k 公司的同事在实 验室里首次运用发酵法生产 出了 辅酶q 1 o 17 。 科学家对 辅酶q 1 。 的 研究也由 此展开并 且 获得很多 重要发现。 1 9 6 4 年，日 本的n i s s h in 公 司， 开始 研究化 学 合 成 法 制 备 辅酶q 1o 的 工艺并 于 1 9 “年实现了 工业化生产，极大地刺激了辅酶q 1 。 的 应用研究18 1 . 6 0 年代中 期，日 本的y a m a u r a 教授19 第一次用辅酶q 7 来治疗 人类充 血性心脏 病。同 年， m e l l o r s 和t a p p e l l o l研究表明 ， 还原 性的 辅酶仇也是 一种 有效的 抗氧化 剂。 1 9 7 2 年， 辅酶q 1 。 之父k a r l f o l k e r s 首先发 现心脏病患 者 普遍缺乏辅酶q i o , 揭开了 辅酶q i 。 用于治疗心脏病的序幕1111。 1 9 7 8 年p e t e r m i t c h e l l 因用化学渗透理论解释了 生物能量转移包括在能量转 换系 统中辅酶q l 。 起重要的 质子转移作用而获得了 诺贝 尔 奖112 1 8 0 年代， 瑞典 人l a y s e r n s t e r 1研究发现辅酶q t 。 是 一个重要的 抗氧化剂， 在体内清除自由基方面有着重要的作用。 辅酶q i o 的生理功能作 用主要来自 于醒基的 氧化还原 特性和类异戊二烯侧链 的物理特性a 4 ， 而且研究表明，还原态的辅酶q 1 。 和异戊二烯单体全为反式结构的 辅酶q 1 o ， 比氧化态的辅酶q 1 。 和异戊二烯单体为顺式结构的 辅酶q i 。 具有更高的 活性和药理作用。 辅酶q 1 o 主要存在于人体细胞线粒体内 ， 作为与能量转换有关 的若干酶系统的辅助因子， 是人体维持生命的必需物质。 长期以来大量科研人员 研究显示，它在以下几个方面具有重要的生理生化作用: 1 ) 抗氧化作用: 这是辅酶q i o 的生理生化特性中研究较多的一个方面， 科学家们对其抗氧化 作用的 机理进行了 一些研究11 5 1 。 研究发现， 在辅酶 q j。 的两种存在状态氧化型 ( c o q , o ) 和还原型 ( c o q , o h 2 ) 中， 起抗氧化作用的 是 还原 型的 ( c o q , o h z ) 。 虽然其抗氧化作用的机制尚不很明确， 但目前的研究认为有两种可能， 大部分的 研究结果认为， c o q , o h z 的抗氧化作用是通过终止自 由 基链式反应， 从而减少自 由 基对脂质、蛋白 质等的 氧化损伤; 第二 种机制认为 c o q i o h 2 通过与维生素 e 协同 抗氧化而起作用， 也 有研究者认为， c o q , o h 2 可能是 通过 还原维生素e 在清 除自 由基时产生的a - 生育酚酞基自由 基，节约和再生维生素 e而起抗氧化作用 的。 此外还有不少研究 证实c o q , o h 2 也能单独 起清除自 由 基的 抗氧化作用， 一些 研究中发现c o q i o h 2 在维生素e 和硒缺乏状态下仍有很强的 抗氧化能力。 2 )稳定生物膜功能11 61 , 第 i 章 绪论 辅酶q i o 可防止过量维生素a所致的红细胞膜及溶酶体膜不稳定， 对维持细 胞膜通道的 完整性具有重要作用，同时辅酶 q i 。 可抑制磷脂酶活性，加强a t p 再合成，产生直接的膜稳定作用，防止细胞膜破裂几肌纤维结构的破坏。 3 ) 对呼吸系统的作用u 飞 由供氢体、 递氢体、 受氢体以及相应的酶系统所组成的代谢途径一般称为生 物氧化还原链。 如果受氢体是氧， 则称为呼吸链。 辅酶q i o 是组成线粒体呼吸链 的2 0 多种物质中的一种，由于其苯酿结构能进行可逆的加氢反应，所以它是电 子传导系统中的递氢体，是生成a t p的必需辅酶。 此外，它不仅是呼吸链的氧 化还原成分，还是调节玻拍酸脱氢酶与细胞色素b e 复合中间产物的重要物质。 日 本 最早将辅酶q i o 作为治疗心脏病药物使 用i ) , 3 0 多年来人们一直持 续不 断的 进行 着辅酶q j o 在心脏病治 疗和保 健方面的 研究， 研究发现辅酶q 1 o 在治疗 心力衰竭、 预防和治疗心绞痛、 心律失常以 及缓解高血压方面功效卓越11 9 1 ， 并广 泛应用于糖尿病、 癌症、 急慢性肝炎、 帕金森症以及人体免疫系统等疾病的治疗 例， 作为 一种多功能性的生化药物， 在临床中 有着广泛的用途。 日 本是世界上最大的 辅酶q i 。 生产国家， 据统计， 全球有9 0 %的产品来自日 本， 全球产量最高的公司为日 清制粉和协和发酵株式会社p i !。 在日 本， 这种产品 已 成为上市药， 在美国 和欧洲市场上， 该产品以 食品添加剂名义销售。 据有关部 门 统计，该产品在美国的年销量达到3 0 吨以上，市场增长率为 1 5 % 2 0 %。 含 辅酶q i o 的营养保健品与其它天然保健品一样， 可在超市、 食品连锁店和药店里 自由销售。 1 . 3国内外辅酶q ,。 生产研究现状 目 前，国内 外辅酶q i o 的制备方法有三种: 化学合成法、动植物组织提取法、 和微生物发酵法网。化学合成法合成条件苛刻， 步骤繁多，另外， 化学合成的辅酶 q i o 的异戊二烯单体大多为顺式结构， 生物活性不好， 且副产物含量多， 提纯成本 高; 动植物组织提取法主要是从提取细胞色素 c后的猪心残渣中提取， 动物组 织中 辅 酶q 1 o 含量低， 每公斤新鲜猪心的 收率仅为7 5 m g ， 并受原 材料和来源限 制i2j i 规模化生产受到一定制约; 而微生物发酵法由于自 身独特的优点而备受关注， 国 外多用微生物发酵法， 尤其是日 本， 早在1 9 7 7 年就实 现了 微生物发酵法工业生产 辅 酶q i o lu l o 1 . 3 . 1微生物发酵法生产辅酶。 ， 。 的优点 微生 物菌体中辅酶q i 。 含量普遍较高， 是辅酶q i 。 的良 好来源。 相比 之下，利用 第 1 章 绪论 微生 物发酵生产 辅酶q 1 。 将成为主要的 趋势， 首先其发酵 产物 为天然品 ， 生物活 性 好渴被人体吸收; 其次没有原材料的制约， 可通过规模放大提高生产能力。如能 选择合适菌株进行遗传改 造， 定向 选育性能 优良 的菌种 ， 使菌体中 辅酶q 1 。 的 含量 提高 ， 生产成本就会大幅度下降 1娜 。 国内 关于微生物发酵提取法生产辅酶 q t 0 的研究近几年也取得了 突破性进 展， 中国科学院微生物研究所利用生物工程高科技126 1 ， 已基本实现了工业化生产 该产品 所需的 微生物发酵提取新技术， 制备出了富 含辅酶q t 。 的 菌液。 同时， 辅 酶q 1 。 是微生物发酵的 胞内 产 物， 大多数生 产菌发酵后的 产物非常复 杂， 给 辅酶q t 0 的提取纯化带来很大困难， 我们还需要找到一种简便、 准确且相对快速的测定发 酵液中辅酶q t 0 的方法， 为进一步大规模的发酵生产控制和成分分析提供参考。 1 . 3 . 2辅酶。 ， 。 生产菌种的选择 表1 . 1 辅 酶q 1 。 产生 菌 及 其细 胞内 含 量12 7 1 t a b . l . l t h e c o e n z y m e q , 0 p r o d u c t i o n s t r a i n s a n d t h e i r c o n t e n t s i n t h e c e l l c o q j o 产生菌 英膜红假单抱菌 胶状红假单抱菌 热带假丝酵母 脱氮假单抱菌 斯谷假单抱菌 脱氮副球菌 鱼精蛋白 杆菌属 醋酸杆菌属 含量( m g / g 干细胞) r h o d o p s e u d o m o n a s c o p s u l a t a r h o d o p s e u d o m o n a s g e l a t i n o s a 0a d z 由t r o p i c a l i s p s e u d o m o n a s d e n i t r if i c a r r s p s e u d o mo n a s决 口策 口 r 口 忍 p a r a c o c u s d e n i t r 舜a n s pr o t a m动o b a c t e r a c e t o b a c t e r a g r o b a c t e r i u m ( t t o n e f a c i e n s ) r h o d o s p i r i l l u m r u b r a m r h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s 有氧无光时为1 .2 2 ， 无氧有光时为1 . 9 8 5 . 9 7 m g / l b ro t h 1 - 5 3 野生株为2 .5 8 ， 突变株为3 . 4 2 1 . 6 4 1 0 8 m g / l b r o t h 5 0 g 脂溶性提取物含0 . 7 % .8a 211曰 土壤杆菌属 类球红细菌 迄今为止， 国内外报道的辅酶q 1 。 生产菌株主要为细菌如假单菌胞属、 土壤杆 菌属、红极毛杆菌、脱氮极毛杆菌、氢极毛杆菌等2 9 1 ，还有像酵母菌属如假丝酵 母、尚德尔酒香酵母、隐球酵母等真菌12 l ，另外还有霉菌的报道13 0 1 ，如表1 . 1 所 示。 野生型菌株的辅酶q 1 。 生产能力是不能满足生产需要的， 可以 利用常规诱变及 基因工程技术对其进行遗传改造。 第 1 章 绪论 1 . 3 . 2 . 1红假单饱菌属 该 菌属体内 辅酶q i o 含 量 较高， 在无氧有光条件下 产量 更高， 但未见有关 其 突变菌株的报道。 s a s a k i 等p i l对胶状红假单抱菌的培养条件作了进一步研究， 在 有氧无光条件下， 实验结果显 示在州7 . 0 , 3 8 时可获得最大生 产率0 . 2 0 8 生 物 量 / h : 常 态培养， 稀释率为0 .0 5 5 生 物量 / h , p h 7 .0 , 3 8 时 所得最高 辅 酶q i 。 产 量为1 .6 m g / g 干细胞。 1 . 3 . 2 . 2假丝酵母属 这类菌属中 研究得较多的 菌 株是c t r o p i c a l is , c a l b i c a n s a t a n a k a 等i;y .i.用摇 瓶培养菌种c . t .p k - 2 3 3 ，以1 0 - 1 3 个碳原子长的链烃为碳源于3 0 培养4 5 小 时， 从培养液和细胞中 分别得到4 . 6 6 m g / l 和1 . 3 1 m g 的 辅酶q 1 o ; 若在培 养基中 加入 对 经基苯甲 酸， 产量分别为1 0 .6 8 m g / l和2 . 7 7 m g . 这是因 为 对经基苯甲 酸 可作为前体， 促进辅酶q i 。 生物合成， 此现象在其它菌株中 未见报道; 实验还发 现醋 酸 钠 可提高 辅 酶q i 。 发 酵 产 量。 s h im iz u 等13 3 1报 道 三梭 酸循 环中的 酸 和c a 2 + 也可提高该菌株的 辅酶q i 。 产量，其中 丙酸被认为是辅酶q i 。 中 侧链异戊二烯 聚合 物的 前体。 培养条件优化后( 培 养基中c / n比 例改 善) 辅酶q 1 。 的 总产量为5 2 m g / l o 1 . 3 . 2 . 3副球菌属 据日 本 m. g . c . 公司报道13 4 1 ， 在脱氮副球菌的基本培养基中加入胆碱和甜菜 碱可提高辅酶q 1 o 的合成量达约3 0 %， 若同时加入l 一 半肤氨酸则可提高5 0 % 0 这一结果对其它一些细菌和酵母也适用。 y o s h i d 等ic i报道脱氮副球菌的发酵含量 可达到2 7 .6 m g / l ， 并且产物易于分离纯化. 1 . 3 . 3辅酶场 。 发酵工艺的研究 1 . 3 . 3 . 1培养基组分的优化 对培养基的组分进行优化是提高发酵产量的一条重要而有效的途径。 在辅酶 q l o 发酵中 通过选择不同 来源成分的 碳源、 氮源、生长因子、无机盐等进行发酵 优化实 验， 以 确定培养 基的 组成， 能 够有效的 提高 辅酶q i 。 的 产量m i . 另 外， 有 研究 表明 ， 金 属 离 子 ，尤 其 是m e. f e z 十 、 m n + 对r sp h a e r o i d e s 发 酵生 产 辅 酶q 1 。 有 促 进 作 用 13 7 1 。 已 证实 ， m e是 辅 酶q i。 合 成 关 键 酶 的 辅 基， m e 是3 - 聚 十 异 戊 二 烯 - 4 - 对 经 基 苯甲 酸 脱 v 酶的 辅 基， f e z + 在 辅 酶q 1 。 的电 子 转 移 过 程中 起 递电 子 体的 作 用 阅。 因 此 ， 提高 培 养 基中m g , 十 、 f e e + , m u z + 的 含 量 可 能 会 提高辅酶q 1 。 的产量。 研究还表明iq ， 前体物能明 显提高产品的产量， 在一定条件下还能控制菌体合 成代谢产物的流向。ma s a z u m i 等14 0 1人研究了前体物对轻基苯甲酸和甲经戊酸的 第 i 章 绪论 添加对辅酶q i。 合成的 促进作用， 还有报道在辅酶q j o 发 酵生 产中 添加异 戊烯醇 和香叶 醇， 辅酶q i 。 的 产量得到了 大幅度的 提高. y o h e i 等14 1 .人发现在培养过程中 流加蛋白 陈和葡萄糖可以 增加微生物中 辅酶 q 1 。 的 产量; 在培养基中加入白 氨酸、 缴氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等也能增加辅 酶q 1 。 的产量; 另外， y o s h i y u k i 等14 2 1研究表明n h 4 + 对微生 物辅酶q 1 。 的 合成 有 很重要的作用。 1 . 3 . 3 . 2发酵工艺的优化 1 ) 通气条件的优化 研究表明， 通 气量对辅酶q i o 产量的 影响因 生产菌株的 不同 而异， 一 种是能 促进辅酶q i 。 的 发 酵生产， 另一种是抑制 作用14 3 1 。 依据现有的 研究报道， 通气条 件对r s p h a e r o i d e s 菌生 产辅酶q 1 。 不利。 s a k a t o 等 14 4 利用r s p h a e r o i d e s k y 8 5 9 8 发酵生产辅酶q 1 o ， 研究了 其通气量对辅酶q 1 。 产量的影响， 结果表明限制供氧 对细菌生长及辅酶q l 。 的 生产有利。 在上述研究基础上， 又用电 镜观察了 供氧对 r s p h a e r o i d e 显微结构的影响， 结果证实， 在限 氧条件下生长的 细菌的 细胞质内 膜发达， 呈多层结构， 而 p s b的光反应中心正位于此处， 这可能导致辅酶 q i o 的含量比 在供氧充足条件下生长的细菌高。 k u n i a k i 等14 5 1人研究表明溶氧对微生 物合成辅酶q io 的影响很大，而且不同的 微生物在积累辅酶q 1 。 产物时所需的溶 氧有很大的不同，就是同一株菌的不同诱变菌株对氧气的需求也有很大的差别， 应针对每一株菌采取相应的培养策略。 2 ) 光照条件的影响 光照条件 对光合细菌的 辅酶q l 。 的 产 量也有重要影响. 袁静， 魏泄等4 6 1通过 正交 试验发现， 光合 细菌r c a p s u l a t w m t 1 1 3 1 的 最佳光照 强度为2 0 0 0 l x ， 光照 时间为4 天。 3 ) 发酵时间的影响 研究发 现细菌处于稳定期前期时 辅酶q 1 。 的 含量较高。 朱旭芬等14 7 1也认为菌 体内 辅酶q 1 。 的 含量随 着培养时间的 增加 而不断 上升， 至稳定 期前中期达 到最高， 随后开 始下降，因 此， 培养时间的 长短对辅酶q 1 。 的 得率也 起到了 很大的 影响。 4 ) 其它条件的影响 在微生 物发 酵生产辅酶q 1 。 的 过程中， 接种 量、 培养温 度、 培养基p h值等 条件，也在一定程度上影响辅酶 q 1 o 的产量，因 此，优化发酵工艺是提高辅酶 q 1 o 产量的一个重要途径。 1 . 4辅酶q , 。 高产菌的选育研究 第 1 章 绪论 1 . 4 . 1辅酶。 : 。 的代谢调控育种 辅酶q 1 o 是由芳香环及异戊烯基侧链组成， 在微生物体内 必须首先合成芳香 环。 其合成途径有两条: 一是由 莽草酸经对轻基苯甲 酸合成芳香环; 二是由乙 酸 一 丙酸途径合成芳 香环148 1 ， 另外， 辅酶q 1 。 和类胡 萝卜 素的 微生 物合成途 径中 都 存 在一个相同的聚异戊二稀长链的合成途径， 实验表明， 两者的合成之间具有很密 切 的 关 系 149 / r u d n e y 在1 9 7 6 年 辅酶q l 。 的国际专题会议上 im ， 提出 较为具体的 合成路 线， 见图1 .2 ， 从图中 可以 看出， 微生物体内 辅酶q 1 。 的 合成主 要由 聚异戊 二烯基焦 磷酸的合成和酮环核心的合成以及两者的有效结合三部分组成。 聚异戊二烯基焦 磷酸主要是通过0 - 乙酞辅酶a途径，经甲经戊酸、异戊烯基焦磷酸、法呢醇焦 磷酸， 最终生成聚异戊烯基焦磷酸。 生成的聚异戊烯基焦磷酸长链再与对羚基苯 爹 岭戊倪 户 邝众一 六 di . , a 共中 卜理日 - c 卜c 月 四 助-f9:)1朋 图1 . 2微生物体内 辅酶q l 。 的合成路线 f i g . 1 . 2 t h e s y n t h e s i s p a t h w a y o f c o e n z y m e q , o i n v i v o o f m i 甲 酸结合， 经一系列的 过程， 最终生成辅酶q 1 o 。 根据芳香环及异戊二烯基侧链 的生 物合成途径结合细 菌的 代 谢调 节机制， 辅酶q 1 。 工 业发酵高 产菌株的 选育途 径可分为:选育营养缺陷型突变株和选育代谢拮抗物抗性突变株as p 第 i 章 绪论 1 . 4 . 1 . 1选育营养缺陷型突变株 o l s o n 和r u d n e y 发现类胡萝卜 素与辅酶q 1 。 均以 聚异戊二烯为前体物进行合 成代谢， 减少类胡 萝卜 素的生成量可能会 促进辅酶q 1 。 的生物合成152 1 。因 此， 选育 类胡 萝卜 素缺陷 型( g r e e n m u t a n t ) 的 p s b 突变株可提高 辅酶 q 1 。 的 含量. 1 . 4 . 1 . 2选育代谢拮抗物抗性突变株 解除抑制物对辅酶q 1 。 合成或其相关合成代谢的抑制作用可增加辅酶q 1 。 的 含量。 y o s h i d a 等153 ，通 过筛选抗辅酶q 1 。 合成的 前体物、 抑制物及其结构 类似物( 乙 基硫氨酸、l - 甲 硫氨酸、甲基蔡醒、道诺霉素) 的突变株， 获得的 a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s 突变株比 野生株提高1 0 - 2 0 % e 1 . 4 . 2构建墓因工程菌株 利用分子生物学技术找到辅酶q 1 。 生产菌株的关键酶基因， 通过重组d n a 技 术将该基因引入生产菌株， 使关键酶基因拷贝数增加并高效表达， 从而增强合成 辅酶q 1 。 的能力， 这是构建辅酶q 1 。 发酵重组菌株的 基本 路线。 不同 生物细 胞内 辅 酶q 1 。 生物合成的限 速步骤均为 对9基苯甲 酸聚异戊二 烯焦磷酸转移酶催 化的 对 轻基苯甲酸与聚异戊二烯的缩合反应。对于该酶的研究发现冈， 该类型酶对底物 有相对宽广的专一性。 根据这一原理， 克隆大肠杆菌中u b i a 基因并将其导入p s b , 通过强化该基因的表达以期得到辅酶q 1 。 的高产株。另一方面， 由 于p s b并不是 一个成熟的基因工程受体菌， 故转向寻找以大肠杆菌为受体菌的代谢途径。在不 同的生物细胞中 ， 由于所含的侧链长度控制基因各异， 其辅酶q 1 0 主要成分的 侧链 长度也不同。 辅酶q ) 。 的 侧链长度是由 基因( 如大肠杆菌is p b ， 酵母 o q l ， 光合细 菌d d s 1 等) 控制的。 大肠杆菌高密度培养简单， 且外源基因的表达系统成熟， 但其 合成的 辅酶q主要 成分为辅酶q 8 。 因 此可设想从p s b中 克隆 控制辅 酶q 1。 侧链 长度的 基因( d d s l ) ， 引 入到大肠杆菌细胞内 ， 同时灭活其自 身的 辅酶q 8 侧链控制 基因is p b ， 最终实 现在 重 组大 肠杆 菌中 大规 模生 产辅 酶q 1 0 。 目 前 ， s h o k u h i n 等is