《RNAi干扰及其应用》PPT课件.ppt

RNAi的发现,20多年前，在对矮牵牛（petunias）进行的研究中有个奇怪的发现：RichJorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮脚牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待中的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen将将这种现象命名为协同抑制“cosuppression”，因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。后来发现在其他许多植物中，甚至在真菌中也有类似的现象。,野生型,试验,预测,1995年，GuoS等试图阻断秀丽新小杆线虫（C.elegans）中的par-1基因的表达。设计：反义RNA特异性地阻断par-1基因的表达；正义RNA以期观察到基因表达的增强。结果:二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。,RNAi的提出,直到1998年2月，FireA和MelloC才首次揭开这个悬疑之谜。他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。他们证实，GuoS博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNAinterference，简称RNAi）。,RNAi广泛存在于自然界,随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。,RNAi的定义,目前对RNAi(RNAinterference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。,如果将其作为一门生物技术，则定义为：RNAi是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA),从而诱导内源靶基因的mRNA降解,达到阻止基因表达的目的。RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的mRNA降解成21nt23nt的小片段，使相应的基因沉默。RNAi是将与靶基因的mRNA同源互补的双链RNA(dsRNA)导入细胞,能特异性地降解该mRNA,从而产生相应的功能表型缺失,属于转录后水平的基因沉默(post-transcriptionalgenesilence,PTGS)。,RNAi的定义,1、RNAi机制,体外实验结果的提示,体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢？由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸长的dsRNA片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。,RNAi作用的简单模型,当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。,RNAi引发的基因沉默机制,GiselaStorz,Science,296(5571):1263-1265,2002.,RNAi相关的基因沉默通路示意,RNAi的特点,1)高效性。Elbashir等在研究中发现分别为25nmol/L与100nmol/L的起始双链RNA产生的结果是一样的，只是高浓度起始的更有效些。将双链RNA浓度降低到1.5nmol/L时产生的基因沉默效果变化不大，只有当浓度降低到0.05nmol/L时，沉默的效果才消失。Holen等也证实1100nmol/L的双链RNA浓度对基因沉默的效果是一致的。这说明双链RNA介导的基因沉默效率是相当高的。,2)需要ATP。Zamore等认为RNAi过程中至少有2个步骤需要能量的供给：一是长的双链RNA被Dicer所酶切产生双链RNA；二是在双链RNA与RISC结合解链后形成有活性的RISC。3)特异性。Elbashir等和Brummelkamp等发现在2123个碱基对中有12个碱基错配会大大降低对靶mRNA的降解效果。,4)位置效应。Holen等根据人TF(tissuefactor)不同的位置各合成了4组双链RNA来检测不同位置的双链RNA对基因沉默效率的影响。在不同浓度和不同类型的细胞中，hTF167i和hTF372i能够抑制8590的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i则几乎没有抑制基因的活性。他们还以hTF167为中心依次相差3个碱基对在其左右各合成了几组双链RNA，有趣的是它们所能抑制该基因活性的能力以hTF167为中心依次递减。特别是hTF158i和hTF161i只与hTF167i相距9个和6个碱基，但它们几乎没有抑制该基因活性的能力。结果还表明双链RNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，相对而言，GC含量较低的mRNA被沉默效果较好。,5)竞争效应。Hoten等将10nmol/L和30nmol/L的hTF167i相比，两者的沉默基因效果无差异，但将20nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i产生的抑制效果明显降低。6)可传播性。在线虫中，双链RNA可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全身。Feinberg和Hunter在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白SID1，它可以将双链RNA转运出细胞，因此系统性的RNAi包括了SID1介导的双链RNA在细胞间的运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物，因此在果蝇上通过注射产生的RNAi不能扩散。,RNAi在植物与其他生物中的差异,在植物中存在系统性沉默(systematicRNAsilencing)现象，RNAi不会局限于单个细胞内，可以在细胞与细胞之间、甚至由诱导部位向更远的组织传播。植物中存在转移性沉默(transitiveRNAi)，对于转基因植物中的外源基因，如果dsRNA诱导的RNA沉默区域对应于基因的中间区域，能检测到与其侧翼区段对应的siRNA。但内源基因却缺乏转移性沉默，表现出沉默区域的保守性。这两种现象在线虫中也有发现,但在哺乳动物和昆虫中却没有发现类似的现象。植物中的RNAi跟两种不同大小的siRNA有关：21nt和24ntsiRNA，21nt由RISC指导切割目的mRNA，而24nt则引发了系统性沉默和甲基化；而在动物中仅发现21nt的siRNA。,RNAi研究的一般技术路线,2、制备siRNA的方法,（1）化学合成,尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成34对siRNAs的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究；不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素,（2）体外转录,相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是能够更快的得到siRNAs。值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。,Figure.UseofChemicallySynthesizedandinVitroTranscribedsiRNAstargeting-ActintoInduceGeneSilencing.,（3）用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA,选择通常是2001000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNARNaseIII(orDicer)在体外消化，得到一种siRNAs除掉没有被消化的dsRNAsiRNA混合物直接转染细胞最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗,Ku-70levelswerereduced86%incellstransfectedwiththesiRNAcocktail,comparedtonon-transfectedcontrols.,（4）siRNA表达载体,多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III启动子(polIII)中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。包括的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNApolIII启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。使用这类载体，需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的polIII启动子下游。最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）,（5）siRNA表达框架,siRNA表达框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto采用，包括一个RNApolIII启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNApolIII终止位点。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配！,（5）siRNA表达框架,如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制备。最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子；不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）。,对于线虫而言，双链RNA在生物体中的表达通过注射或者喂食的方法都可以产生很好的效果。但这种简单有效的方法对于其它生物来说并不可行。对于植物和哺乳动物来说，要有稳定的抑制效果就必须有稳定表达双链RNA的合适方法，这还得要借助遗传转化的方法。目前已经建立了多种适合产生双链RNA的方法。,制备siRNA5种不同方法的比较,制备siRNA5种不同方法的比较（续）,负对照,一个完整的siRNA实验应该有负对照。作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。,3.转染细胞,siRNAs需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此将其高效地转入细胞也是研究成功与否的关键步骤。例如，一个siRNA对某个特定基因表达的抑制效率是90%，但是其转染效率只有10%，那么总的抑制率只有9%。目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理想。对于植物细胞构建合适的RNAi载体已经有很多成功的报道。,4.RNAi的效果分析,可从mRNA和蛋白质两方面进行。mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern杂交等。蛋白质：Western杂交；ELISA；免疫荧光等。细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变化是RNAi效果最终和最大的体现。,5、RNAi在植物中应用的方法,（1）瞬时性的RNA沉默,导致产生瞬时性RNA沉默的方法包括基因枪轰击法病毒侵染法,基因枪法,基因枪轰击法尽管也能产生持久性的转基因效应，但在RNA沉默中它更多的应用于瞬时性的RNA沉默研究。用该方法对植物的转化速度快，并且当DNA进入目标组织后就会被释放并迅速表达dsRNA而产生RNA沉默现象,Schweizer等通过基因枪轰击谷物如小麦、玉米和大麦的叶片表皮细胞将表达dsRNA或hpRNA的DNA结构转化入植物并引发RNA沉默，这种方法已经在沉默内源基因A1、MLO、GUS基因中得到证实,表现为目标基因活性的降低。Klahre等在转GUS基因烟草中通过基因枪介导的dsRNA、siRNA和正义、反义RNA轰击以使GUS抑制蛋白沉默，发现每种方法都能产生siRNA而导致GUS抑制蛋白的沉默,结果使GUS能正常表达。,病毒诱导的基因沉默,病毒诱导的基因沉默(virusinducedgenesilencing,VIGS)是通过改造侵染植物的病毒使其携带用于产生RNA沉默的DNA序列，当用该病毒侵染植物时则产生RNA沉默现象Kumagal等将人工构建的植物基因PDS的片段插入烟草花叶病毒基因组中使其产生包含正向或反向PDS序列片段的RNA时产生了光褪色现象,揭示内源的PDS基因被沉默,（2）持久性的RNA沉默,目前,在植物中持久表达RNA沉默通常采用构建表达载体,通过PEG介导、电穿孔介导、农杆菌侵染等方法使设计的序列整合到植物基因组中并稳定表达,Stoutjesdijk等报道拟南芥中到T5代时RNA沉默仍然是遗传稳定性的。Wesley等系统研究了不同结构的RNA对沉默效率的影响，发现相比于单链正义或反义RNA，双链RNA尤其是发夹式结构的RNA(hpRNA)对RNA沉默的效率有非常显著的提高。如果在发夹结构的反向重复序列间加入一段非编码序列如内含子，在植物体内转录形成含内含子的发卡结构(intronsplicinghpRNA，ihpRNA),则沉默效果与hpRNA相比可从58%提高到90%,6、RNAi在植物中的应用领域,RNAi在植物功能基因组研究中的应用,RNAi为大规模高效及复杂的功能基因组学研究提供了一个便捷的平台。Chuang等在花发育研究中采用RNA沉默技术验证了AG、CLV3、APl、PAN等已知功能基因,并开创了RNA沉默技术在植物功能基因组学中的应用。Miki等利用水稻OsRac基因家族保守性序列设计RNA沉默载体，成功的对OsRac基因家族进行了沉默，发现该突变株系生长状况和植株高度均比正常的要差，揭示该基因家族在生长发育过程中有重要的作用,RNAi在作物品质改良中的应用,尽管产量问题在传统育种和植物遗传工程研究中是最重要的目标,改善植物营养价值方面也越来越受到重视。常规育种方法在改善食物营养方面取得了卓有成效的成功，然而操作耗时，并且对于作物性状的改良只限于已经得到的突变体材料而利用RNA沉默技术，其优越性不仅表现在可操作基因的范围和突变的种类扩大了，而且对目的基因的表达有了可控性,Liu等利用RNA沉默技术进行了棉籽油成份的改良研究,通过抑制2个脂肪酸去饱和酶关键基因92去饱和酶编码基因ghFAD21和62去饱和酶编码基因ghFAD221的表达，分别将硬脂酸含量从非转基因的2%3%提高到40%，油酸含量从15%提高到77%，并表明通过上述后代的杂交可获得同时提高硬脂酸和油酸的植株，而且基因沉默程度没有降低。Ogita等利用RNA沉默技术抑制咖啡植物中编码可可碱合成酶(CaMXMT1)基因