（微生物学专业论文）丙酮丁醇高产菌株的选育及其发酵新工艺的研究.pdf

浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 丙酮丁醇高产菌株的选育及其发酵新工艺的研究 摘要 本文改进获得了一种快速有效测定丙酮、丁醇和乙醇产量的方法， 其测定条件为：采用a t - f f a p 毛细管柱( 3 0m x 0 2 5m m x 0 3 3 m ) ；载 气流速：n 23 5m l m i n ，h 23 5m l m i n ，空气3 5 0m l m i m 柱温：1 8 0 ；进样口温度：18 0 c ；检测器温度：2 0 0 。c ，进样量：1 此。在此 条件下，每个样品测定时间5m i n 。 通过多次对丙酮丁醇梭菌微波、离子束和紫外诱变，选育出一株 丙酮丁醇高产菌株，命名为b 5 1 3 ，该菌株a b e 总溶剂能够达到1 8 2 7 g l ，其中丁醇产量为1 1 4 3g l ，溶剂产量比出发菌株提高了1 0 0 7 7 。 本试验从渗透压稳定剂、蔗糖浓度、酶浓度、酶解时间等方面研 究了丙酮丁醇梭菌原生质体制备和再生条件。原生质体制备和再生的 最适宜条件为：o 3m 蔗糖作为稳定剂，菌体培养1 6 18h ，溶菌酶浓 度1m g m l ，酶解温度3 7 。c ，酶解4 0m i n 。在此条件下，原生质体的 制备率和再生率分别达到7 0 和9 9 。采用紫外线灭活高产菌株b 5 1 3 、 热灭活发酵时间短的菌株d 0 1 后，双亲融合获得8 0 株融合子，但融合 子a b e 产量均较低，最高溶剂产量1 0 3 1g l ，发酵时间也没有缩短。 另外，研究了发酵温度、热处理时间、接种量、发酵液p h 、振荡、 发酵时间对丙酮丁醇发酵的影响，确定了最佳发酵条件：发酵温度3 8 ，菌悬液沸水中热处理1 5m i n ，接种量3 ，玉米醪保持原始p h ， 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 发酵液出现醪盖时，每隔1 0h 摇匀，发酵7 0h 。在此条件下，经多次 发酵，a b e 的产量能够达到1 8 l 。 通过正交试验对细胞固定化条件研究，得出最佳固定化条件为： p v a ，s a ，氯化钙浓度分别为9 ，1 1 ，4 ，固定化4h ，固定化细 胞发酵溶剂产量达到1 0 8 2g l 。固定化细胞耦合抽提发酵研究表明补 料分批发酵首次加料最适宜时间范围为7 0 8 0h 。 作者试图通过采用p t b 基因敲除的方法提高发酵主要产物丁醇的 产量，但试验结果表明p c r 扩增的含k a n 抗性基因片段不能成功转化 丙酮丁醇梭菌。不同p h 对丙酮丁醇代谢途径中酶的活性影响结果表 明，较低p h 并不能完全诱导丁醇合成酶的产生，因此认为采用基因敲 除技术切断丙酮丁醇梭菌代谢途径中的丁酸分支代谢途径，不利于丁 醇的产生，导致不能产生溶剂。 关键词：丙酮丁醇发酵，诱变育种，新工艺，固定化细胞，基因工程 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 s t u d yo nt h es e l e c t i n g0 fh i g ha c e t o n ea n d b u t f o lp r o d u c i n gs t r a i n sa n di t sn e w f e i u 压e n t a t i o nt e c h n o l o g y a b s t r a c t a r a p i da n de f f i c i e n tm e t h o do fd e t e c t i n ga c e t o n e ，b u t a n o la n de t h a n o l w a sa c q u i r e di nt h i sp a p e r i t sd e t e c t i n gc o n d i t i o n sw e r es h o w e da sb e l o w ： a t - f f a pc a p i l l a r yc o l u m n ( 3 0m x 0 2 5m i n x 0 3 3l x m ) ；c a r r i e rg a sf l o wr a t e ： n 23 5m l m i n ，h 23 5m l m i n ，a i r35 0m l m i n ；c o l u m nt e m p e r a t u r e ：18 0 ；i n j e c t i o nt e m p e r a t u r e ：18 0 。c ；d e t e c t o rt e m p e r a t u r e ：2 0 0 。c ，i n j e c t i o n v o l u m e ：1 “l u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，d e t e c t i n gt i m en e e d s5m i n ah i g ha c e t o n ea n db u t a n o l p r o d u c i n gs t r a i n s ，n a m e db 5 13 ，w a s o b t a i n e dt h r o u g hr e p e a t e dm u t a t i o no fm i c r o w a v e ，u va n di o nb e a m a b e y i e l dr e a c h e d18 2 7g l ，i nw h i c hb u t a n o lc o n c e n t r a t i o na r r i v e d11 4 3 l t h ep r o d u c t i o no fa b ew a si n c r e a s e d 10 0 7 7 i nc o m p a r i s o nw i t h t h a to ft h ep a r e n ts t r a i n p r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e do nt h e o s m o t i cp r e s s u r es t a b i l i z e r , s u c r o s ec o n c e n t r a t i o n ，e n z y m ec o n c e n t r a t i o n ， e n z y m eh y d r o l y s i st i m e t h em o s ta p p r o p r i a t ec o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w ： s u c r o s e ，a sas t a b i l i z e r , c o n c e n t r a t i o nw a s0 3m ；c e l lc u l t u r et i m ew a s 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 16 18h ；l y s o z y m ec o n c e n t r a t i o nw a s1m g m l ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i s t e m p e r a t u r ew a s37 c ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i st i m ew a s4 0m i n u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s ，t h er a t e so fp r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o nw e r e7 0 a n d9 9 r e s p e c t i v e l y s t r a i n sb 513 ，d 01w e r ei n a c t i v a t e db yu va n dh e a t t r e a t m e n ts e p a r a t e l y 8 0f u s a n t sw e r eg a i n e db yb i p a r e n t a li n a c t i v a t i o n a b ey i e l dw a sl o w e ra n dm a x i m u ms o l v e n tp r o d u c t i o nw a s10 31 g l t h e r ew a sa l s on o ts h o r t e n i n go nf e r m e n t a t i o nt i m e i n a d d i t i o n ，a b e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e do n f e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r e ，h e a t t r e a t m e n t t i m e ，i n o c u l a t i o na m o u n t ， f e r m e n t a t i o nb r o t hp h ，o s c i l l a t i o n s ，a n df e r m e n t a t i o nt i m e t h eo p t i m u m f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w ：f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew a s3 8 ；h e a tt r e a t m e n tt i m ew a s1 5m i ni nb o i l i n gw a t e r ；i n o c u l a t i o na m o u n t r e a c h e d3 ；t o mm a s hm a i n t a i n e dt h eo r i g i n a lp h ；e v e r y10hs h a k e do n c e w h e nm a s hc a pa p p e a r e d ；f e r m e n t a t i o nt i m ew a s7 0h u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s ，a b ey i e l dc a nr e a c h18g l r e s e a r c ho nc e l li m m o b i l i z a t i o nu s i n go r t h o g o n a lt e s th a so b t a i n e dt h e b e s ti m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n s t h ec o n c e n t r a t i o n so fp v a ，s a ，c a c l 2 w e r e9 ，1 1 ，4 ，i n d i v i d u a l l y ；i m m o b i l i z e dt i m ew a s4h ；s o l v e n ty i e l d r e a c h e d10 8 2 g l s t u d yo ni m m o b i l i z e dc e l lf e r m e n t a t i o nc o u p l e d e x t r a c t i o ns h o w st h a t7 0 8 0hw a st h ef i r s ts u i t a b l ef e e dt i m ei nf e d b a t c h f e r m e n t a t i o n a u t h o rt r i e dt oe n h a n c eb u t a n o lp r o d u c t i o nt h r o u g hk n o c k i n g o u tp t b 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 g e n e ，b u tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep c ra m p l i f i e df r a g m e n tc o n t a i n i n gk a n r g e n ec o u l d n tb es u c c e s s f u l l yt r a n s f o r m e di n t oc l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m t h er e s u l to fe n z y m ea c t i v i t yi na b em e t a b o l i cp a t h w a yi n f l u e n c e db y d i f f e r e n tp hs h o w e dt h a tb u t a n o ls y n t h e s i se n z y m e sc a l ln o tb ec o m p l e t e l y i n d u c e db yl o wp h s oc u t t i n go f f b u t y r a t eb r a n c hm e t a b o l i cp a t h w a yo f a b ef e r m e n t a t i o nt h r o u g hg e n ek n o c k o u tt e c h n o l o g yi su n f a v o r a b l et o b u t a n o lp r o d u c t i o n ，w h i c hc o u l dn o t p r o d u c es o l v e n t k e yw o r d s ：a c e t o n e - b u t a n o l f e r m e n t a t i o n ，m u t a t i o nb r e e d i n g ，n e w t e c h n o l o g y , i m m o b i l i z e dc e l l s ，g e n e t i ce n g i n e e r i n g 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 符号与缩略语 a b e g c ( g a sc h r o m a t o g r a p h y ) u v ( u l t r a v i o l e t ) p c r ( f i o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) k a n ( k a n a m y c i n ) e d t a ( e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ) t e t a e p v a s a p e g d ( d a y ) h ( h o u r ) m i n ( m i n u t e ) s ( s e c o n d ) r m i n 丙酮、丁醇、乙醇 气相色谱 紫外 聚合酶链式反应 卡那霉素 乙二胺四乙酸 t r i s e d t a 缓冲液 t r i s 乙酸缓冲液 聚乙烯醇 海藻酸钠 聚乙二醇 天 小时 分钟 秒 转速 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大 学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者始彳百景国 嗍汐乍歹膨日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：彳玎孑昌日期：硼7 年歹月；口日 新签名：缸自歹7 吼叩厂月7 日 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 1 1 丙酮丁醇性质及用途 第一章综述 丙酮、丁醇、乙醇( a b e ) 统称为丙丁总溶剂，是医药、农药、涂料、塑料、 橡胶、油漆、国防以及轻工业的重要原料，也是重要的化工溶剂【l 】。此外，a b e 还广泛应用于制醋酸丁酯和树脂；制醋酐、双丙酮醇、氯仿、磺仿、环氧树脂、 甲基丙烯酸甲脂；制染料、洗涤剂、脱水剂、清洁剂等【2 】。因此，丙酮丁醇的研究 对于现代工业的发展有着重大的促进作用。 丙酮( a c e t o n e ) ，又名二甲基甲酮，为最简单的饱和酮，无色透明液体，有特 殊的辛辣气味。分子量5 8 0 8 ，密度( 2 5 ) 0 7 8 8g c m 3 ，熔点一9 4 ，沸点5 6 4 8 。易溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿和吡啶等有机溶剂，易燃、易挥发，化 学性质较活泼。 丙酮既是重要的溶剂又是重要的有机化工原料，主要用于生产醋酸纤维素胶 片薄膜塑料和涂料的溶剂。丙酮与氢氰酸反应所得的丙酮氰醇( a c h ) 是制备甲 基丙烯酸甲酯( m m a ) 的原料。丙酮也是制备环氧树脂、聚碳酸酯中间体双酚a 的原料。在医药、农药方面丙酮除作为维生素c 的原料外，还可用作各种微生物 与激素的萃取剂，石油炼制的脱蜡溶剂以及用作制造其它合成材料的原料等，用 途十分广泛。 丁醇( b u t a n 0 1 ) ，无色透明液体，有酒味。分子量7 4 1 4 ，密度( 2 0 ) 0 8 1 0 9 g e r n 3 ，熔点8 9 0 c ，沸点1 1 7 7 。2 0 c 时在水中的溶解度为7 7 ，与乙醇、乙 醚及其它多种有机溶剂相混溶，蒸汽与空气形成爆炸性混合物，爆炸极限 3 7 1 0 2 ( 体积分数) 。 正丁醇是一种重要的有机化工原料，用途非常广泛，主要用于邻苯二甲酸正 丁酯、脂肪二元酸和磷酸丁酯、丙烯酸丁酯及醋酸丁酯等；可经过氧化生产丁醛 或丁酸：可用作油脂、医药和香料的提取溶剂以及醇酸树脂的添加剂等；还可用 作有机染料和印刷油墨的溶剂、脱蜡剂。丁醇不仅是重要的精细化工原料，也是 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 新型的可再生能源，丁醇具有高能量、可混合性、低挥发性、污染少等优点，可 以取代乙醇作为一种可再生的燃料添加剂。其中丁醇还可以作为效率很高的燃料， 同等量的丁醇燃烧所释放的能量是乙醇的两倍【3 1 。因此，在国际国内能源日趋紧张 ， 的今天，发展可再生能源丁醇展示出巨大的潜力。 1 2 丙酮丁醇的生产方法 1 2 1 丙酮的生产方法 丙酮的工业生产方法主要有异丙苯法、异丙醇法、发酵法、乙炔水合法和丙 烯直接氧化法。丙酮最早由醋酸钙经干馏制得。1 9 1 3 年英国斯特兰奇格拉哈姆公 司开发了谷物发酵生产丙酮、丁醇和乙醇的方法。1 9 2 0 年，丙烯水合法制异丙醇 正式工业生产，接着异丙醇脱氢制丙酮工艺开发又获成功。在以后相当长时间内， 发酵法和异丙醇脱氢法都是广为采用的方法。1 9 5 3 年后，美国赫格里斯公司和英 国蒸馏公司合作开发成功的异丙苯法制苯酚和丙酮投入工业生产。由于经济上的 优越性，此法发展迅速，从6 0 年代起成为生产丙酮的最主要方法。此外，个别工 厂曾采用丙烯液相氧化法、异丙醇氧化法，但经济上均难与异丙苯法竞争。2 0 0 6 年的世界丙酮总生产能力达到6 0 0 多万吨，其中9 0 以上为异丙苯法生产。但是 异丙苯法生产丙酮要消耗重要的石油资源，因此异丙苯法生产丙酮的潜力不大， 前景并不十分乐观。 1 2 1 1 异丙苯法 丙烯与苯在磷酸或三氯化铝的催化下烷基化生成异丙苯，异丙苯在碱稳定剂 存在下加温( 8 0 1 3 0 ) 、加压( o 9 9 表明峰面积与各溶剂浓度 的线形相关程度很好，方法的准确度较高，适用于气相色谱法检测发酵液中有机 溶剂的浓度。 2 3 4 发酵样品的检测 发酵样品预处理后，取l “l 进样，柱程序升温和恒温下检测发酵液中丙酮、 丁醇、乙醇、乙酸和丁酸的产量，气相色谱图分别如图2 4 ，图2 5 。 图2 - 4 a 程序升温下标准溶剂气相色谱图 f i g 2 - 4 ac _ r cc h r o m a t o g r a mo fs t a n d a r ds o l v e n t si nc o l u m np r o g r a m m e dt e m p e r a t u r e 鲁 室 i盆 墨_ 芰；芙；八姨强j 。7。 ”抽1 0 付 竹 。 ”蕾 图2 - 4 b 程序升温下a b e 发酵气相色谱图 f i g 2 - 4 bg cc h r o m a t o g r a mo f a b e f e r m e n t a t i o ni nc o l u m np r o g r a m m e dt e m p e r a t u r e 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 图2 5 a 恒温下标准溶剂气相色谱图 f i g 2 - 5 ag cc h r o m a t o g r a mo fs t a n d a r ds o l v e n t si nc o l u m nc o n s t a n tt e m p e r a t u r e 薹 一 萎 姨人； 7 口2 ， 图2 5 b 恒温fa b e 发酵气相色谱图 f i g 2 - 5 bg cc h r o m a t o g r a mo f a b ef e r m e n t a t i o ni nc o l u m nc o n s t a n tt e m p e r a t u r e 图2 4 b 表明，样品中丙酮、丁醇、乙醇、乙酸和丁酸能够很好的分离，与标 准溶剂( 图2 - 4 a ) 相比，发酵液中的成分相对比较复杂，8 4 6 5m i n 、1 0 6 1 5m i n 处都存在色谱峰，说明发酵液中还存在许多其它物质，可能是某些溶剂的异构体 或是中间代谢产物。 图2 5 b 表明，恒温测定a b e 时间较短，测定每个样品只需4r a i n ，但丙酮和 乙醇分离效果稍差。 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 2 4 本章小结 本文改进获得了一种快速有效检测丙酮丁醇发酵液中a b e 的方法。该方法样 品处理简单，测定需时少，每个样品检测时间在5m i n 内，检测分离结果较好，为 以后大批量筛选丙酮丁醇高产菌株打下良好的基础。 在色谱柱的选择，进样口、检测器、柱温的确定上参考有关文献的基础上【2 1 ， 采用岛津g c 1 4 b 气相色谱仪、a t f f a p 毛细管色谱柱，对色谱柱的温度进行优化， 以峰面积外标法，对a b e 进行定量分析。通过绘制溶剂标准曲线，确定了丙酮、 丁醇、乙醇、乙酸和丁酸的回归方程，其中丁醇标准回归方程为y = 1 8 9 9 9 x 6 2 4 0 7 ， r 2 = o 9 9 9 5 。各溶剂回归方程相关系数均大于0 9 9 ，表明峰面积与各溶剂浓度的线 形相关程度好，测定样品时准确度高。 气相色谱法一般采用内标法，但内标法在测定过程中每次进样都需加入一种 内标物，较繁琐【3 1 。本文采用毛细管气相色谱法、以峰面积外标法定量测定发酵液 中a b e 的产量，不需要校正因子，具有快速、便捷和准确等优点，分离效果较好， 适用于大批量样品的快速分析。但操作条件变化对结果准确性影响较大，外标法 对进样量的准确性控制要求较高，每次进样量应一致，否则会产生误差，对结果 影响较大。 参考文献 【l 】陈陶声，陆祖祺发酵法丙酮丁醇生产技术【m 】北京：化学工业出版社，1 9 9 1 【2 】姜莉，张树瑛，气相色谱法对工业正丁醇含量的测定【j 】现代仪器使用与维修，1 9 9 9 ，l ： 3 0 3 1 3 】李华，张珍，郭峰等气相色谱外标定量法分析异丙硫醇含量【j 】化学试剂，2 0 0 8 ，3 0 ( 1 1 ) ： 8 2 6 8 2 8 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 3 1 前言 第三章丙酮丁醇高产菌株的选育 微生物诱变育种是人为的利用物理和化学等因素，使诱变的细胞内遗传物质 染色体或d n a 的片段发生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或d n a 的某一部位 发生改变( 又称为点突变) ，从而使微生物的遗传物质d n a 和r n a 的化学结构发 生变化，引起微生物的遗传变异。因此，诱发突变的变异幅度远远大于自然突变【l 】。 丙酮丁醇发酵生产的丙酮、丁醇和乙醇具有广泛的用途，被认为是转化生物 量成为有价值化合物最有前途的方案之一【2 ，3 1 。随着近年来下游工业的发展，丙酮 和丁醇的市场需求直线上升。据了解，2 0 0 5 年我国丙酮、丁醇消费量均超过了5 0 万吨，但生产能力仅为4 0 万吨左右，每年需要进口大量的丙酮、丁醇，许多学者 认为丙酮和丁醇具有极大的市场空间。 早期的丙酮、丁醇采用粮食发酵法生产，发酵法是粮食或其它淀粉质农副产 品，经水解得到发酵液，然后在丙酮丁醇梭菌作用下，发酵制得丙酮、丁醇和乙 醇的混合物，通常的比例为3 ：6 ：1 。7 0 年代后由于化学法的发展，发酵法生产技术 逐渐淘汰。近年来由于石油价格的飞速上涨，加之石油资源日益紧缺，粮食发酵 法生产丙酮、丁醇的技术重新显示出其优势，尤其是丁醇具有高能量、可混合性、 低挥发性、污染少等优点，作为一种新型的可替代石油的生物能源，相对生物柴 油和生物乙醇有着更好的应用前景。况且发酵法生产丙酮丁醇是以再生资源替代 不可再生的石油基原料制造，符合国家能源安全的长远战略考虑【4 】。然而实际发酵 过程中丁醇转化碳源的产率要比乙醇低的多，限制了生物丁醇燃料的发展，所以 要使生物丁醇具有竞争力，必须提高发酵后丁醇的产量。 微生物发酵法生产a b e 的首要任务是选育丙酮丁醇高产菌株。如今，国外应 用基因工程技术构建丙酮丁醇生产菌株是研究提高菌株产溶剂水平的重要手段之 一【5 1 。但就目前而言，工业生产使用的绝大多数高产菌株主要是通过诱变方法选育 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 获得的。虽然诱变育种的工作量大，费时费力，育种效率较低，但由于诱变方法 选育获得的丙酮丁醇生产菌株遗传稳定、安全性好。此外，诱变育种还具有研究 条件和技术要求不高、容易操作、费用较低等优点。总之，诱变育种技术的实用 性和易操作性，奠定了其在丙酮丁醇生产菌株育种上的重要地位，是选育高产丙 酮丁醇生产菌株的常用方法之一【6 一。 此外，2 0 世纪7 0 年代以来，原生质体制各、再生和融合技术不断地被完善， 建立了一套基本的操作方法，原生质体融合技术克服了种与属间杂交的不育性， 大大提高了基因间重组的频率，利用种内和种间原生质体融合进行细菌的遗传重 组已有不少成功的例子。1 9 8 2 年，a l l c o c ke r 掣8 】研究了丙酮丁醇梭菌原生质体 的制备和再生，探索了其形成和再生渗透压稳定剂、培养基的选择等，此后，关 于丙酮丁醇梭菌原生质体的研究便销声匿迹。从试验重复性而言，a l l c o c ke r 的 试验重复性结果并不好。因此，通过原生质体融合技术筛选丙酮丁醇高产菌株， 对于丙酮丁醇高产菌株的选育具有重要的现实意义。如今，丙酮丁醇梭菌原生质 体融合技术在国内外研究还处于空白，所以，建立丙酮丁醇梭菌原生质体融合技 术体系具有重大的实际意义。 本章旨在研究丙酮丁醇高产菌的诱变选育。以实验室保存的丙酮丁醇梭菌为 出发菌株，使用微波、离子束、紫外线诱变方法，利用原生质体融合技术，通过 单菌落分离、发酵，选育一株丙酮丁醇高产菌株。 3 2 材料与方法 3 2 1 菌种来源 丙酮丁醇梭菌( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ) ，浙江工业大学微生物学实验室 保藏菌种。 3 2 2 试验药品 磷酸氢二钾：分析纯，湖州湖试化学试剂有限公司 磷酸二氢钾：分析纯，湖州湖试化学试剂有限公司 无水硫酸镁：分析纯，上海四赫维化工有限公司 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 葡萄糖：分析纯，广东光华化学厂 蔗糖：分析纯，广东兴华化学厂 氢氧化钠：分析纯，杭州萧山化学试剂厂 氯化钠：分析纯，浙江中星化工试剂有限公司 焦性没食子酸：分析纯，贵州遵义佳宏华工有限责任公司 无水氯化钙：分析纯，衢州医化试剂有限公司 无水氯化镁：分析纯，上海化学试剂有限公司 乙酸铵：分析纯，广东光华化学厂 乙酸钠：分析纯，温州润华化工实业公司 硫酸亚铁：分析纯，衢州百化试剂有限公司 硫酸锰：分析纯，上海美兴化工有限公司 琼脂粉：生化试剂，福建泉州市泉港化工厂 牛肉浸膏：生化试剂，北京双旋微生物培养基制品厂 酵母浸膏：生化试剂，北京双旋微生物培养基制品厂 蛋白胨：生化试剂，上海化学试剂采购供应站化工厂 胰蛋白胨：生化试剂，上海东海制药厂 水解酪蛋白：分析纯，s i g m a 公司 可溶性淀粉：分析纯，国药集团化学试剂有限公司 溶菌酶( 2 0 0 0 0u m g ) ：生化试剂，国药集团化学试剂有限公司 对氨基苯甲酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司 l 一盐酸半胱氨酸：生化试剂，国药集团化学试剂有限公司 聚山梨酯8 0 ( 吐温8 0 ) ：药用乳化剂，温州清明化工有限公司 顺丁烯二酸：化学纯，上海三爱思试剂有限公司 聚乙二醇4 0 0 0 ：国药集团化学试剂有限公司 3 2 3 仪器设备 s w - c j 1 f 超净工作台 p y x d h s 5 0 x 6 5 隔水式电热恒温培养箱 y x q l s - 5 0 si i 立式压力蒸汽灭菌锅 苏净集团安泰公司 上海市跃进医疗器械一厂 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 2 8 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 ( q s g 4 1 2 8 0 手提式压力蒸汽灭菌器 w - 2 0 1 b 数显恒温水浴锅 s c 1 0 1 1 型鼓风电热恒温干燥箱 h h s9 l _ 4 电热恒温水浴锅 u v - 7 5 4 分光光度计 微波炉 磁力搅拌器 y s l 0 0 显微镜 厌氧罐 3 2 4 培养基、缓冲液 上海华线医用核子仪器有限公司 上海申腾生物技术有限公司 浙江省嘉兴市电热仪器厂 上海医疗器械五厂 杭州纳德科学仪器有限公司 格兰仕公司 金坛市华峰仪器有限公司 n i k o n 沈阳市第五人民医院 ( 1 ) 活化培养基t y a ：葡萄糖4 0g ，牛肉膏2g ，酵母膏2g ，胰蛋白胨6g ， 乙酸铵3g ，磷酸氢二钾o 5g ，硫酸镁0 2g ，硫酸亚铁0 0 1g ，加水定容至1 0 0 0 m l ，lm o l l n a o h 调p h 至6 5 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 ( 2 ) 种子培养液c b m - 葡萄糖1 0g ，磷酸氢二钾0 5g ，磷酸二氢钾0 5g ，硫 酸锰o 0 1g ，对氨基苯甲酸lm g ，硫酸镁0 2g ，硫酸亚铁o 0 1g ，生物素2 嵋， v b “m g ，水解酪蛋白4g l ，1 1 5 。c 灭菌2 0m i n 。 ( 3 ) 种子培养液r c m 胰蛋白胨5 0g ，蛋白胨5 0g ，氯化钠5 0g ，牛肉膏1 0 0 g ，酵母膏3 0g ，葡萄糖5 0g ，氯化钠5 0g ，可容性淀粉1 0g ，琼脂o 5g ， 乙酸钠3 0g ，l 盐酸半胱氨酸o 5g ，加水定容至1 0 0 0m l ，n a o h 调p h 至6 8 士0 2 ， 1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 ( 4 ) 再生培养基：t y a 培养基中加入蔗糖，使其浓度为o 3m 。配制氯化镁和氯 化钙混合液，灭菌。t y a 使用前，将氯化镁和氯化钙的混合液加入含o 3m 蔗糖 的t y a 中，浓度达到2 5m m 。 ( 5 ) s m m 高渗溶液：蔗糖1 0 2 6g ，顺丁烯二酸2 3 2g ，m g c l 2 6 h 2 04 0 6g ，加 水定容至1 0 0 0m l ，n a o h 调p h 至6 5 ，1 1 5 灭菌3 0r a i n 。 ( 6 ) 溶菌酶液：s m m 配制溶菌酶( 酶活2 0 0 0 0u g ) 浓度为4r n g g m l ，0 2 2g m 无 菌滤器过滤除菌，4 c 保存。 ( 7 ) 7 玉米醪：称取玉米粉7 0g ，加ll 自来水，1 0 0 。c 糊化处理，补足加热过 程中挥发的水分，1 2 1 下灭菌3 0m i n ，自然p h 。 浙江工业大学2 0 0 9 硕上研究生论文 3 2 5 微波诱变 ( 1 ) 菌悬液的制备：将活化的丙酮丁醇梭菌接种至r c m 种子培养液，3 7 。c 培养 1 6 18h ，4 0 0 0r r a i n 离心1 0m i n ，收集菌体，以无菌生理盐水洗涤至盛有玻璃珠的 三角瓶中，打散菌体，血球计数板计数，无菌生理盐水调节菌悬液浓度至1 0 6 个m l 。 ( 2 ) 诱变方法：选用脉冲频率为2 4 5 0m h z ，最大功率8 0 0w 的微波炉，菌悬液 1 0m l 于直径9 01 1 1 1 1 1 的灭菌平皿内，平皿置于装有冰水混合物、直径1 6 0i a i n 的 大平皿中，中火诱变1 8 0s ，以未经微波诱变的菌悬液作对照，每处理3 个重复， 分别用无菌水稀释至l o ，1 0 ，1 0 ，涂布平板，3 7 厌氧培养。 ( 3 ) 筛选高产菌株：培养3 4d 后，统计平板上菌落数，计算诱变致死率。挑取 单菌落至玉米醪发酵液，3 7 静置发酵，记录发酵时间最短的菌株，发酵7 0h ， 气相色谱测定发酵液中丙酮，丁醇和乙醇产量。 3 2 6 离子束诱变 ( 1 ) 干菌膜的制作：将平板上丙酮丁醇梭菌转入种子培养液r c m ，培养1 6 1 8h ， 至o d 5 4 0 = 0 3 左右，2 蔗糖( 保护剂) 稀释1 0 倍，取1 0 0g l 涂布直径9c i i l 平板， 无菌风干，放置1h 。 ( 2 ) 离子束诱变条件：离子束能量1 0k e v ，离子注入剂量3 9 1 0 1 5i o n s e r a 2 ， 每平板处理时间间隔1 0 0s ，其中每束n + 离子剂量2 6x1 0 1 4i o n s e r a 2 。 ( 3 ) 诱变后处理：诱变后，用lm l2 蔗糖溶液把菌膜洗下，稀释成一系列浓度， 各取0 1m l 菌液涂布平皿，3 7 。c 厌氧培养。 ( 4 ) 筛选高产菌株：培养3 4d ，统计平板上菌落数，计算致死率。挑取平板上长 出的单菌落，转入玉米醪发酵液，3 7 静置发酵，记录发酵时间最短的菌株，发 酵7 0h ，测发酵液中丙酮、丁醇和乙醇产量。 3 2 7 紫外线诱变 ( 1 ) 菌悬液的制备：将活化的丙酮丁醇梭菌接种至r c m 种子液，3 7 c 培养1 6 1 8 h ，菌悬液4 0 0 0r m i n 离心1 0m i n ，收集菌体，0 8 5 无菌生理盐水洗涤菌体2 次， 玻璃珠振荡打散菌体，无菌生理盐水将菌体稀释至1 0 8 个m l 。 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 ( 2 ) 紫外线照射：紫外线处理前，打开紫外灯预热2 0r a i n ，以稳定光波。吸取3m l 菌悬液于直径6t i n 、放有大头针的无菌平皿中，放于磁力搅拌器上，紫外灯下( 照 射距离3 0c r n ) ，照射1 2 0s 。照射后的菌悬液分别吸取0 1m l 至0 9m l 无菌水中 梯度稀释，吸取o 1m l 涂布t y a 平板，3 7 厌氧培养。 ( 3 ) 筛选高产菌株：避光培养3 4d ，统计平板上长出菌落数，计算致死率。挑取 平板上长出的单菌落，转入玉米醪发酵液，3 7 静置发酵，记录发酵时间最短的 菌株，发酵7 0h ，测定丙酮、丁醇和乙醇产量。 3 2 8 生长曲线的制作 丙酮丁醇梭菌活化培养2 - 3d ，接种至种子培养液c b m ，3 7 c 厌氧培养，每隔 2h 取样，分光光度计测定其o d 5 4 0 值，绘制生长曲线。 3 2 9 原生质体的制备和再生 丙酮丁醇梭菌活化培养2 3h ，接种至种子培养液c b m ，培养1 6 18h ，吸取 3 0m l 菌液，3 8 0 0r m i n 离心1 0m i n ，收集菌体，s m m 洗涤2 次，然后用s m m 高渗溶液稀释菌体至一定浓度，吸取2m l 菌悬液加至小试管中，再加入2m g m l 溶菌酶，此时，菌悬液含有lm g m l 溶菌酶。3 7 酶解4 0m i n ，3 8 0 0r r a i n 离心 1 0m i n ，弃上清液，s m m 洗涤菌体2 次，最终分别用高渗溶液及无菌水稀释原生 质体至l o ，1 0 - 2 ，1 0 一，分别吸取未经酶处理的菌悬液、无菌水稀释的原生质体、 高渗溶液稀释的原生质体o 1m l 涂布平板，3 7 培养4 5d ，统计长出的菌落数a 、 b 、c ，计算原生质体形成率和再生率。 3 2 1 0 原生质体形成率和再生率的计算 原生质体得率= ( a b ) a x l 0 0 原生质体再生率= ( c b ) ( a b ) x 1 0 0 其中a ：总菌落数，未经酶处理的菌悬液涂布高渗平板后生长的菌落数；b ： 未原生质体化细胞，酶解离心后的菌悬液加蒸馏水破坏原生质体，涂布高渗平板 后生长的菌落；c ：再生菌落数，酶解离心后的菌悬液加高渗溶液，涂布高渗平板 后生长的菌落数。 3 l 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 3 2 1 1 原生质体灭活条件 ( 1 ) 紫外线灭活：s m m 高渗缓冲液稀释原生质体悬液，血球计数板计数，控制 原生质体数目为1 0 7 个m l ，吸取稀释液lm l ，距1 5w 紫外灯3 0c i t l 处分别照射 1 0r a i n ，2 0r a i n ，3 0m i n ，4 0m i n ，将照射不同时间的原生质体菌悬液梯度稀释， 涂布再生培养基平板，统计平板上长出的菌落数，计算致死率，研究紫外线照射 不同时间对原生质体灭活的影响。 ( 2 ) 热灭活：吸取1m l 原生质体菌悬液( 浓度1 0 7 个m l ) 至小试管中，3 7 ， 6 5 ，7 0 ，7 5 ，8 0 ，8 5 下分别处理2 0 m i n ，将不同温度处理的原生质体 菌悬液梯度稀释，涂布再生培养基，统计平板上长出的菌落数，计算致死率，研 究热处理不同温度对原生质体灭活的影响。 3 2 1 2 原生质体融合 分别吸取紫外线和热处理的原生质体悬液2m l 于离心管中，3 0 0 0r r a i n 下离 心1 0m i n ，弃上清液，各沉淀分别加入0 1m ls m m 高渗溶液，两者混匀后，加 入1 8m l4 0 p e g 溶液，轻轻摇匀，3 7 水浴保温5r a i n ，立即用s m m 高渗溶 液稀释4 5 倍，3 0 0 0r m i n 离心1 0r a i n ，弃上清液，沉淀充分悬浮于2m l 的s m m 高渗溶液。原生质体融合悬液稀释至1 0 一，1 0 2 ，1o 3 ，各吸取o 1m l 涂布再生培 养基平板，培养3 5d ，菌落长出后，挑取单菌落至玉米醪发酵液，3 7 c 发酵，记 录各融合子的发酵时间，发酵7 0h 后，气相色谱测定发酵液中丙酮、丁醇和乙醇 产量。 3 3 结果与讨论 3 3 1 微波诱变菌体致死曲线及诱变结果 微波辐射属于一种低能电磁辐射，具有较强生物效应的频率范围在3 0 0 m h z 3 0 0g h z ，对生物体具有热效应和非热效应。热效应是指它能引起生物体局 部温度上升，从而引起生理生化反应：非热效应指在微波作用下，生物体会产生 非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下，生物体会发生一 3 2 浙江工业大学2 0 0 9 硕士研究生论文 系列突变效应。为考察微波处理时间对菌体致死的影响，按3 2 5 方法，微波处理 0s ，6 0s ，1 2 0s ，1 8 0 s ，2 4 0s 后，稀释培养，统计各平板长出的菌落数，计算致 死率，绘制微波致死率曲线，如图3 1 所示。 1 0 0 9 0 8 0 ；7 0 一6 0 羹5 0 3 0 2 0 1 0 0 03 06 00 01 2 01 5 0 1 8 02 1 02 4 0 诱变州可( s ) 图3 - i 微波致死率曲线 f i g 3 - il e t h a l i t yr a t eg ：l l ：l - v eo f m i c r o w a v e 由图3 1 可以看出，随着微波处理时间的增加，菌体的致死率持续上升，处理 1 8 0s 时，致死率达到8 2 2 5 ；处理时间2 4 0s 时，致死率达到9 0 2 2 ，一般认为 致死率在7 0 8 0 范围内，诱变效果较好，因此确定微波处理时间为1 8 0s 。 按3 2 5 微波诱变方法对丙酮丁醇梭菌微波诱变处理，诱变后挑出16 0 个单菌 落至玉米醪发酵液，3