（微生物学专业论文）糠醛对酿酒酵母应激作用的初步分析.pdf

贵州大学2 0 0 8 届硕士生毕业论文 摘要 本课题测定了不同白酒中的糠醛含量，证明了酱香型白酒中的糠醛含量远高 子其它香型酒的糠醛含量。 为了探明酱香型酒中糠醛含量显著的来源，本试验又从原料入手，分析不同 轮次的发酵周麓中酒醅的糠醛含量。实验结果显示，酱香型酒醅中的糠醛含量离 于其它香型白酒酒醅中的糠醛含量。 鉴于糠醛在酱香型囱酒和溪醅中的显著性，我们接着分鸯孑了糠醛对酵母产 l y c d ( l i v ey e a s tc e l ld e r i v a t i v e ，活性酵母细胞衍生物) 的影响，通过单因素实验 及完全实验，确定了产生高活性l y c d 的最佳条件为：糠醛的浓度为0 3 0 m u l ， 作用时间为1 5 r a i n 。 提取了糠黧最佳应激条绎下酵母缨脆的总r n a ，利用设计合成的弓| 物对 r n a 进行r t - p c r 扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳对h s p 7 0 基因在糠醛刺激前 后表达情况进行半定量分橱。结果显示，糠醛应激盾较糠醛疲激前，h s p 7 0 基因 表达量明显较高，说明糠醛应激导致了h s p 7 0 基因表达量的增加。 关键词：糠醛；酱香型愈酒；活性酵母细胞衍生物；热应激蛋粥 贵州大学2 0 0 8 届硕士生毕业论文 a b s t r a c t f u r f u r a li so n eo ft h ea r o m as u b s t a n c e si nt h el i q u o r f u r f u r a lc a l lb ed e t e c t e df r o m t h em o s tr e p r e s e n t a t i v eo ft h et h r e e f l a v o r ( o fm o u t a i ，l u z h o u ，f e n ) l i q u o ri nc h i n a t h eo d 2 7 7v a l u eo ff u r f u r a lc o n t e n tf r o mt h et h r e e - f l a v o rl i q u o rw a sm e a s u r e db y u v s p e c t r o p h o t o m e t r yi nt h i sp a p e r a sar e s u l t ，w ef o u n dt h a tf u r f u r a lc o n t e n tf r o m t h em o u t a il i q u o rw a s s i g n i f i c a n t l ya n dt h el o n g e ri nt h ey e a r , t h eh i g h e ri nt h e f u r f u r a lc o n t e n t s t h es t u d ya b o u tf e r m e n t e dg r a i n so fm o u t a il i q u o ri n d i c a t e dt h a ti t s c o n t e n to ff u r f u r a lw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a no t h e r k i n d so fl i q u o r l i v ey e a s tc e l ld e r i v a t i v e ( l y c d ) ，ak i n do fp r o t e c t i v es u b s t a n c ew h i c hc o u l d i n c r e a s ec e l l u l a rr e s p i r a t i o na n dw o u n dh e a l i n g ，w a sp r o d u c e db yl i v i n gc e l lr e s p o n s e t oac o n t r o l l e di n j u r e l y c dw a se x t e n s i v e l yu s e di nc o s m e t i ca n dp h a r m a c e u t i c a l f i e l d s t h i sp a p e rc h o s ef u r f u r a la sas o u r c eo fs t r e s sa n dl o o k e df o r t h eb e s tc o n d i t i o n p r o d u c i n gh i g h l ya c t i v el y c da f t e rs t r e s s f r o mt h es i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a l e x p e r i m e n t s ，w ef o u n dt h eb e s tc o n d i t i o n ：t h ec o n c e n t r a t i o no ff u r f u r a li s0 3 0m l k t i m ei s1 5m i n t h i ss t u d ya l s ow i t h d r e wt h et o t a lr n ao f y e a s tc e l lb ys t r e s s i n go nc o n d i t i o nt h a tt h e f u r f u r a lw a s0 3 m l la n dl a s t e d1 5 m i n ，a n d 己a r r i e do nt h ee x a m i n a t i o nt oi t sq u a l i t y a n dt h ed e n s i t y t h e nr t - p c rr e a c t i o na n de x t e n s i o na n di n c r e a s eo fc d n aw a s u n d e r g o i n gw i t hp c rp r o b e f i n a l l yh s p 7 0g e n ee x p r e s s i o nw a sa n a l y s e dt h r o u g h t h ea g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s a sar e s u l t ，t h ea m o u n to fh s p 7 0 g e n ee x p r e s s i o n w a si n c r e a s e dm a r k e d l ya f t e rf u r f u r a ls t r e s s k e yw o r d s ：f u r f u r a l ；m o u - t a il i q u o r ：l y c d ( l i v ey e a s tc e l ld e r i v a t i v e ) ；h s p 7 0 资州人学2 0 0 8 属硕上生毕业论文 附：学位论文原创性声明和关于学位论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行分析所 取褥的成果。除文中已经注明弓 用的内容外，本论文不包含任何其他个入或集体 已经发表或撰写过的科研成果。对本文的分析在做比重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任国本人承担。 论文作者签名：二监 日 期：论文作者签名：皇、i 鱼 日 期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人 授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论艾在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：谴导师签名 5 8 贵州火学2 0 0 8 届硕士生毕业论文 第一章绪论 1 1 糠醛和白酒香味成分的基本理论 1 1 1 糠醛的生产及应用现状 糠醛是白酒的香味物质成分之，它又名呋喃甲醛，是由戊糖脱水生成的油 状液体。由富含戊聚糖的农、转业植物原料加工制得，因最早由谷糠铡成并具有 醛的性质而得名。它是有特殊气味的无色透明液体，沸点为1 6 1 7 c 1 。 糠醛在工业上作为一种重要的有机化工原料【2 i 。在医药、兽药、农药、染料、 香料、涂料、塑料、电绝缘材料、助剂、试剂、溶剂、粘合剂、饲料添加剂、食 晶、合成树脂、合成橡胶及合成纤维单体等产品生产中有着一定的用途。在酿造 工业中，糠醛是白酒的风味物质之一。 1 1 2 白酒香味成分的分析 白酒是中国传统的蒸馏酒，为世界三大蒸馏淄之一。白酒的主要成分是乙 醇和水( 占总量的9 8 9 9 ) ，丽溶于其中的酸、酯、醇、醛等种类众多的微量 有机化合物( 占总量的l 2 ) 作为白酒的呈香呈味物质，却决定着白酒的风格 ( 指酒的香气与酒味协调平衡，具有独特的香味) 和质量1 3 1 。国际上，酒类芳香成 分的分析技术不断进步，分析成槊巨大，鉴定出的成分已达1 0 0 0 多种。白酒种 类较多，风味各异。作为白酒风味质量的关键因+ 素，各种白酒中香味成分的种类 和作用也各不相同。白酒香味成分的分析技术最初一般采用常规的化学分析方法 测定嘲酒中的总酸、总酯、总醛、甲醇和杂醇油等成分。1 9 6 4 年，原中国轻工 业部组织的茅台、汾酒试点分析组采用纸层析色谱法定性及半定量检出白酒中的 酸和醮及芳香族化合物等成分；同时，在茅台试点应用薄层色谱法和柱层色谱法 探讨茅台酒中的有机酸成分。1 9 6 6 年，内蒙古轻工分析所用气相色谱分析定量 白酒中较高沸点的酯类，如辛酸乙酯和乳酸乙酯等l4 1 。气相色谱法的分离原理是 使混合物中的各组分在固定相( 固定液) 与流动相( 载体) 间进行交换，由于各组分 在性质和结构上的不同，当溶质被流动相摊动经过固定楣时与固定相发生的相互 2 贵州火学2 0 0 8 届硕士生毕业论文 作用大小、强弱会有差异，以致各组分在固定相中滞留的时间有长有短，而按顺 序流出达到分离的是的。气相色谱法本是作为一种分离手段，但自从气相色谱配 备各种检测器( 如f i d 、t c d 、f p d 等) 以后，能使分离分析次完成，具有分离 效果好、灵敏度高、选择性强、分析速度快、用途广泛等优点，傻气相色谱成为 一种极重要的现代分析工具。目前通常采用填充柱色谱分析和毛细管色谱分析， 进行填充色谱分析时可采用邻苯二甲酸二王酯( d n p ) 和p e g2 0 m ( 聚乙二醇平 均相对分子质量2 0 0 0 0 ) 柱；进行毛细管色谱分析时通常采用黜柱( f f a p 是 p e g2 0 m 与2 硝基对苯二酸的反虚产物) 。也有分析人员1 5 】用填充柱、毛细管 柱色谱分析，检出了玉冰烧酒的香味成分有1 5 0 种。范文来【6 l 等2 0 0 7 年应用 h s s p m e 和g c - m s 分析皇酒大越中微量挥发性成分，用量少，检测时间短， 准确度高。色谱是分离混合物的有效方法，但难以得到结构信息，主要靠与标样 对比来达到未知物结构的推定，质谱法提供了丰富的结构信息，样品用量又是几 种谱学方法中最少的【7 】，【8 1 。因此，色谱：质谱的结合，成为分离和鉴定未知混合物 的理想手段。 我国传统的名白酒可以分为浓香型、清香型、酱香型三大香型。1 9 7 9 年， 中国第三届全匿评酒委员会将自酒划分为酱香型、清香型、浓香型、米香型和其 他香型5 种类型。随着囱酒传统生产工艺的不断总结，以及分析水平与测试手段 的提高，自酒香型分析戏票越来越显著。 、 经发酵、蒸馏而得的新酒，必须经过一段贮存老熟期才能装瓶出售。白酒在 贮存老熟过程中，不仅存在挥发作用和氢键缔合等物理作用，还醛类氧纯，从丽 生成糠醛等香味成分。 翻酒中香味成分的香味阑值人们对某种香味成分能感觉到的最低浓度) 有 大有小。通常用呈香单位( 为白酒中香味物质浓度的大小与阂值的比值，即香味 强度拳某物质含量该物质阈值) 来表示其香味的强弱程度。有些香味成分在自 酒中含量很低，但是如果其呈香单位较大，其呈香作用仍然较大。白酒中呈香呈 味物质虽然含量只占自酒的1 2 ，但是按含量仍可分为色谱骨架成分和微量 成分。色谱骨架成分在白酒中的含量大于1m g m l ，有己酸乙酯、乳酸乙酯、乙 酸乙酯、丁酸乙酯等约2 。种物质。色谱骨架成分占白酒香味成分总质量的9 5 9 9 以上，在常规色谱分析谱图上属大峰物质。这些成分构成了白酒的骨架， 3 贵州大学2 0 0 8 届硕士生毕业论文 是自酒的主体成分，决定白酒的香型。微量成分是指在白酒中含量小于 l m g l o o m l 的所有香味成分，占白滔香味成分总质量的l 5 。有些微量成分 由于香味强度很大，虽然含量很少，但是对白酒风格形成的贡献较大。曾发现有 “五粮液”的样品和“全兴大兹 的样品由几乎相同的色谱骨架成分组成。在生 产新型白酒时，如果以食用酒精为基酒只加2 0 种左右的色谱骨架成分，做出的 自酒档次很低，连蓝酒的一点风格也没有。微量成分对于盘滔的风格和风味质量 起着重要的、有时甚至是关键性的作用。 自酒是很多种香味成分组成的集合体，其表现出来的不仅是单体香味，更重 要的是复合香味。两种以上香味物质相混合，不但改变了单体所特有的香味，有 时还呈现出相乘作用( 呈香单位大幅度增长) 或相杀作用( 呈香单位大幅度下降) 。 作为助香剂，白酒中有些物质，如一些多元醇类，在相乘相杀过程中起到香味的 缓冲调剂作用网。 中国原轻工业部组织的茅台试点和汾酒试点确认己酸乙酯为浓香型白酒的 主体香味成分，乙酸乙熬为清香型自酒豹主体香味成分，为提高浓香型白酒和清 香型白酒的产量和风味质量提供了理论和技术基础。以后的科学分析工作者一直 不懈地分析和寻找各种番型自酒的主体香味成分。尽管主体香味成分的确定十分 困难，但是在与白酒风格特征相关的特征性成分方面的分析成果丰富。白酒是很 多种香味成分的集合体，白酒香味成分量比关系的改变能够决定其典型风格f 搬。 1 1 。3 酱香型白酒中的微量成分分析 赢温制曲、高温堆积、高温发酵、高温蒸馏、长期贮存的传统生产工艺，酿 成的酱香型白酒独特的晶味风格，代表着中国白酒的精华，它不仅是中华民族的 宝贵遗产，且孕育着现代科学技术的真谛，是中国传统工业对世界酿造技术、食 品香料、白酒物性等方面做出的贡献。特殊环境是酿造微生物活性因子生成的生 物资源宝库。键天独厚的高温潮湿生态环境，存在大最的细菌、放线蓠、酵母蔼 及霉菌。这些微生物不仅产生大量的淀粉酶、蛋白酶、纤维素水解酶，同时产生 多种具有生理活性的次生代谢产物，如多不饱和脂肪酸还原氨基丁酸、他汀类大 环内酯类化合物，具有降血脂、降血压活性；曲霉属微生物代谢的麦角甾醇具有 抑制癌细胞活性和抵抗伤痛。这表暖这些微生物不仅是酿造微生物，也是药物微 4 贵州大学2 0 0 8 届硕士生毕业论义 生物的生物资源宝库。他们经高温、高酸、高乙醇等特殊环境下生存、繁殖和驯 化，具有特殊的生存能力，这不仅为白酒酿造、酶铡荆、药物、饲料、香料等产 业提供丰富的生物资源，也为现代生物技术奠定了物质基础f l l - 1 4 1 。 1 2 活性酵母细胞衍生物 1 2 1 活性酵母细胞衍生物 在分析应激反应的过程中，人们发现酵母细臆有很强的应激反应能力。当它 受到外界不良环境刺激时，酵母细胞会很快合成许多保护性物质，以抵御这些不 良刺激的伤害作用。人们把活酵母细胞在入为控制的伤害条件下所产生的保护性 物质，称为活性酵母细胞衍生物( l i v ey e a s tc e l ld e r i v a t i v e ，l y c d ) 1 5 - 1 8 】。最初的 l y c d 是从紫磐光照处理过的酵母细胞中提取毒来的，将酿酒酵母爱于2 8 6 n m 的紫外辐射之下，细胞可以产生些能够增加细胞呼吸且促进修复作用的未知因 子，郎为l y c d 。后来有人把亚致死剂量的h 2 0 2 加入到酵母细胞中，处理后的 酵母细胞经提取同样获得了l y c d 。g r i s t a i ng o d o n 1 9 l 等人对此进行了深入的分 析，他们利用二维凝胶电泳技术对酵母细胞产生的应激蛋冬进行了分析。分析结 果表明：在应激条件刺激下，至少有1 1 5 种蛋白被诱导生成，而同时有5 2 种蛋白 的合成受到了抑制。 1 2 2 活酵母细胞衍生物的应用 对酒中活性酵母衙生物的分析和应用暂时还没有，这或许是将来酿造工业分 析的重点，但它在化妆蹋中的应用已经开始成熟起来。化妆品用生物制剂的生产 方法大致有三种：麸动物腺体孛提取；从海藻、各种植物及j # 动物器官中提取； 从微生物培养液和微生物细胞中提取【1 8 2 叭。在过去，许多化妆品活性成分都是以 活性原则从动物腺体f 如胸腺、，脾、胎盘、大脑和肺) 和循环体系的血清、淋巴缨 胞中提取出来的。然而，由于动物产品的不安全性以及动物保护组织的反对，愈 来愈多的消费者反对将来源于动物的产晶应用予化妆品。这样，取自植物的活性 成分在化妆品中的应用大大增加。但是这种方法从成本的角度来考虑并不现实。 l y c d 2 1 l 是一种特别有效、安全的活性成分，具有减轻伤害的作溺，实验结 5 贵州大学2 0 0 8 届硕士生毕业论文 果表明，l y c d 能增加细胞的线粒体对氧的利用，促进细胞的呼吸和能量代谢 过程。l y c d 还具有加速胶原蛋白和弹性蛋白生成的能力，可以滋润并更新皮肤 细胞，增加皮肤细胞中新生蛋白质对水分的吸收和促进对氧的利用，使皮肤丰满， 是奇特的保湿剂。大量毒理试验表骥，l y c d 安全无毒，l y c d 的脂质体也网样 具有高度的安全性。这种具有防止细胞衰老和促进细胞活性功能的化妆品添加 剂，是配制颏型的具有消炎作用、专f 1 用予预防晒蘑失水和促进晒伤皮肤重新水 合从而减少紫外伤害的化妆品的优良生物材料，是晒后护理化妆品中优良高效的 生物添加剂弘翻。 1 9 9 3 年，日本学者伊藤进提出把酵母细胞代谢物、线粒体成分和糖脂p s l 用于化妆品中。随着生物技术向化妆品领域的不断渗透，酵母的一些组分及其代 谢物、衍生物已逐渐应用于化妆品的开发和生产。在国外，目前己经有许多以酵 母及英衍生物为原糕的化妆品闷世，麸啤滔酵母缨胞壁中提取的葡聚糖也被应用 于抗衰老、防皱、增加皮肤弹性的高功能化妆品中。作为防衰老和治疗慢性瘸的 生物剩翔，谷赋首肽被加入到保健食品、健美饮料和功能性化妆品中，恧含有活 性酵母衍生物的化妆品更是得到了极大的应用。 含有活性酵母衍生物的化妆晶在防晒他妆品中应用很广，其主要作用是降低 和防止紫外线对皮肤的伤害作用。紫外线是指太阳中波长为2 0 0 4 0 0 r i m 的电磁 波，按波长一般可分为三段：3 2 0 - 4 0 0 。的长波区溶区，u v a ) ：2 8 0 3 2 0 r i m 的中 波区( b 区，u v b ) ；2 0 0 2 8 0 r i m 的短波区( c 区，u v c ) 。在紫外线引起的辐射损 伤中，u v b 的董筝用最大，占辐射剂量的粥，可造成皮肤的红斑反应、老化 反应以及刺激黑色素的生成等多种伤害作用；u v a 的作用强度很弱，但穿透力 强，而且伤害效应能够积累，可学| 起皮肤癌的发生；u v c 能弓l 起蛋自质和类脂 体结构变性，干扰核酸代谢，大气臭氧层可以吸收wc 而降低它的破坏作用。 由于大气臭氧层遭到不同程度的破坏，太阳紫外线曼严重地刺激和损伤入的皮 肤，而且随着人们生活水平的提高，出游的机会也越来越多，因此防晒用品的需 求也不断增大。另外，皮肤含水量的多少也是皮肤、丰满、亮泽的关键。所以， 保持皮肤水分，延缓皮肤衰老的皮肤保湿化妆品成为化妆品市场中的重中之邈。 丽活性酵母细胞衙生物正是满足防晒与僳湿双重功效的重要的化妆晶添加荆。 l yc d 是一种特别有效、安全的活性成分，具有减轻伤害的作用。一大量毒理试验 6 贵州大学2 0 0 8 届硕士生毕业论文 证明：l y c d 安全无毒，l y c d 的脂质体也同样具有高度的安全性。实验表明， l y c d 能增加细胞的线粒体对氧的剩用，促进细胞的呼吸和能量代谢过程；l y c d 还具有加速胶原蛋白和弹性蛋白生成的能力，可以滋润并更新皮肤细胞，增加皮 肤细胞中薪生蛋自质对水分的吸收和促进对氧的利用，使皮肤丰满，是奇特的保 湿剂。所以，l y c d 是一种具有强紫外吸收能力和促进细胞活性功能的化妆品添 加剂，是配制具有消炎作用、专f 1 用于预防晒后失水和促进鼷伤皮肤重新水合从 而减少紫外伤害的新型化妆品的优良的生物材料，是晒后护理化妆品中优良高效 的生物添加剂。含活性酵母衍生物的护肤晶在东南亚一带极为流行。 痔疮是常见的一种疾病，给人们的生活带来了极大的痛苦和不便。l y c d 具 有刺激血管形成和加速伤瑟愈合的作用，是一种治疗痔疮极为有效的药用成分， 早在二十世纪四十年代，人们就把l y c d 应用于治痔制品中，临床实验研究表 甓该物质对痔疮有着良好的疗效。以l y c d 为主要成分的h 割刹是一种效采屋 著的治痔制品，在临床上有着广泛的应用。另外，l y c d 还是一种良好的治疗烫 绕和机械损伤的药品添加剂，由l y c d 生产的药品瓣牛皮癣等皮肤瘸也有良好 的疗效。最近的研究发现，l y c d 对由紫外线引起的d n a 损伤具有修复作用， 对鼓膜具有荐生功能。麓前，l y c d 的应用范圈不断扩大。美国己默药焉级的活 性酵母衍生物制得浓缩产品b i o f a c t o r s t m ，用于去皱膏、疤痕净及婴儿护肤用品 等产赫的生产，飙丽将l y c d 的药雳与美容作用紧密的结合起来。 。2 。3 酿酒酵母的氧化应激反应 + 活性氧类物质是机体内自由基的主要形式，可在细胞的芷常代谢中产生，外 界环境如辐射、氧化还原活性药物、金属离子也会刺激活性氟类物质的生成。当 活性氧类物质的含量达到一定的浓度时，就会破坏细胞内的氧化还原的平麓状 态，从而导致对脂质、蛋白质、d n a 的损伤，甚至是细胞的死亡。为了消除活 性氧类物质引起的伤害作用，生物体己经进化出若干的保护机制。当终界刺激引 起机体内活性氧类物质增多时，机体发生基因转录调节水平上的变化，诱导合成 一些应激产物，保护自身不受活性氧类物质的伤害。细胞对氧化物的刺激的废答 反应已经在原核生物生物体进行了大量的研究。研究发现：当细菌处于亚致死剂 量的氧化物中时，它们将很快适应这种应激条件，从而对致死剂量的刺激产生抗 7 贵州大学2 0 0 8 届硕士生毕业论文 性。在过氧化氢或超氧阴离子的诱导下，大肠杆菌将产生3 0 。4 0 种蛋白质分子。 酵母细胞也具有很强的应激反应能力，当它受到光、热、化学损伤等不良刺激时， 很快就会合成许多具有自我修复性的物质，以抵御这些不良的条件所弓f 起的伤害 作用。过氧化氢、超氧化物等都能弓| 起酿酒酵母发生氧化应激反应。在夕 界的刺 激下，至少有1 1 5 种蛋白被诱导生成，而同时有5 2 种蛋白的合成受到了抑制。 细胞受过氧化氢刺激面产生的应激蛋叁可以分为七类： ( 1 ) 直接与细胞的抗氧化机制有关的蛋白质 这类蛋白质有很高的应激指数，是应激蛋盎中号# 常重要的一类，包括主要的抗氧 化剂酶系，如超氧化物歧化酶、硫过氧化物酶、硫氧还蛋白、硫氧还爱白还原酶、 谷耽甘肤还原酶、细胞色素c 过氧化物酶以及缨瓞溶质过氧化氢酶等。此终，在 研究中还发现了另外四种与本类蛋白具有同样功能的蛋白质：y d r 4 5 3 c ， y l r l 0 9 w ，y c l 5 和y o l l 5 1 w 。应激蛋白y d r 4 5 3 e 是在酵母基因序列中发 现的a h p c t s a 的同系物，它利用硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和n a d p h 的 传递电子作用来还原过氧化物。蛋白y l r l 0 9 w 是另癸一个与a h p c f f s a 蛋自质 同系的新型抗氧化剂，作用与过氧化物酶体蛋白质极其相似，具有抵御叔丁基醇 氢过氧化物的熊力，焉璺它还是种依赖于n a d p h 的醛基还原酶和甘油脱氢 酶。应激蛋白y c l 0 3 5 具有谷氧还蛋白和硫醇基转移酶家族的氧化还原中心的特 征，与谷氧还蛋白菲常相似。y o l l 5 1 w 劂类似予n a d p h 脱氢还原酶，与异黄 酮类化合物植物抗生素的形成有关： 圆热激蛋自 热激蛋白也有很强的应激指数，大多数的热激蛋白为伴随蛋白，在应激条件下可 促进异常蛋白的积累，从磊使其折叠并促进蛋自水解物的降解，对纲胞产生傈护 作用。 0 ) 蛋白酶及类蛋白酶体的次级单元本类鬃自也有较高的应激指数，但低于前两 种类型。 ( 4 ) 蛋白转移荦位该类蛋自中除两种蛋自受过氧化氮的诱导生成外，其余都为过 氧化氢阻遏蛋自。 ( 5 ) 碳水化合物代谢酶类包括与磷酸戊糖途径、糖酵解途径、三梭酸循环、甘油 降解和海藻糖的合成有关的酶。 8 贵州大学2 0 0 8 届硕七生毕业论文 ( 6 ) 与硫、氨基酸、嘌吟代谢有关的酶类 功能未知型蛋白酶在应激条伟下产生，但具体的作用还有待进一步的研究。 1 2 3 1 酿酒酵母的氧化防护体系 酿酒酵母拥有酶系和非酶系两种防御体系，以保护自身在氧化应激状态下细 胞成分的稳定以及维持细胞内的氧诧还原状态的平衡。 ( 1 ) 非酶系防御体系 非酶系防御体系主要由小分子可溶于水( 某些情况下可溶于脂类) 的一些物 质组成。它们是自由基清除剂，与活性氧类物质发生反应而除去这些氧化剂。 ( a ) 谷胱甘肽( c s u ) 还原型谷胱甘肽( g s h ) 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸形成的一个三肽。它 是酵母细胞在度激反应中产生的一个重要的代谢产物，也是细胞内最重要的挽氧 剂之一。g s h 的主要生物学功能是保护细胞内蛋白质的巯基，进而维护蛋白质 的正常的生物学活性，维持细胞内氧纯还原状态的平衡。另外，g s h 还是多种 酶的辅酶和辅基，正常细胞一般具有很高的g s h g s s g 比率。研究发现，如果 细胞缺乏g s h ，细胞就会对过氧化氢表现出高度的敏感性。g s h 是非酶系的防 御系统中研究的最为透彻的一个，对维持细胞内氧化还原状态的平衡起到了重要 的作用。在酿酒酵母细胞内已经鉴定了合成g s h 瓣两个基因g s h l ，g s h 2 ，并 分离得到了g s h 的两个缺陷型菌株g s h l 和g s h 2 。虽然g s h l 和g s h 2 这两个缺陷 株能够存活，僵与野生型相比其延滞期长、生长速率低，且不能形成子囊抱予， 对过氧化氢、维生素k 等具有高度敏感性。只有在基本培养基上添加g s h ，缺 陷株巧能正常生长。谷氨酸、半胱氨酸可以替代g s h 添加到培养基中，但它并 不能完全取代g s h 的作用。因为只有在培养基中添加了g s h 后，g s h 2 缺陷株 才能获得与野生型同样的生长。g sh 除作为自由基清除剂之外，还可以与毒性 亲电体结合，然后分泌到液泡中，这种功能是通过g s h 结合泵来完成的。 ( b ) 金属硫蛋臼( m d 金属硫蛋囱是具有低分子量、富含氨基酸和半胱氨酸，并能大量结合重金属 离子的具有抗氧剂活性的蛋白质。m t 对细胞内的自由基有着非常强的清除作 用，它还可以与细胞内的重会属离子配位结合成无毒或低毒络合物，起到消除重 9 贵州大学2 0 0 8 届硕士生毕业论文 金属的作用。酵母细胞的m t 由基因c u p i 和c r s 5 编码，对于保护细胞免受氧 化还原活性物质的伤害作用重大。在酵母细胞中由于缺乏c u z n s o d 引起的对氧 化剂的敏感可以通过过量表达m t 来改善。 ( c ) 黄素血红蛋白 黄素血红蛋白是在酵母氧化应激反应中起作用的一个金属蛋白，它的缺陷株 对二酰氨轻度敏感。氧气可以诱导编码黄素血红蛋白基因的表达，但关于黄素血 红蛋白抗氧作用确切的生理功能还有待进一步研究。 ( d ) 硫氧还蛋白 硫氧还蛋白是一个富含s h 的小分子蛋白，是硫氧还蛋白过氧化物酶和核苷 酸还原酶的还原剂。酿酒酵母细胞有两个编码硫氧还蛋白的基因：t r x l 和 1 f i 2 。虽然这两个基因的完全缺失或仅缺失一个不会引起细胞的死亡，但t r x 基因双缺型的菌株中g s s g 水平明显提高，而细胞周期中的s 阶段也明显延长， 这说明硫氧还蛋白对调节细胞内t 3 s h g s s g 的比率起着一定的作用，它的缺失 会刺激调节细胞分裂周期的基因的转录。然而，尽管t r x i 基因的缺失会增加细 胞对h 2 0 ：的敏感性，但与此同时细胞对胺的抗性也有所提高。 但) 谷氧还蛋白 与许多其他生物一样，酿酒酵母细胞也拥有谷氧还蛋白。谷氧还蛋白是一类 含有两个对氧化条件敏感的半胱氨酸的小分子蛋白，与硫氧还蛋白一样，属于核 苷酸还原酶的电子供体。基因g r x i 和g r x 2 编码酿酒酵母细胞中的谷氧还蛋白， 尽管二者编码的蛋白高度相似，但其作用却迥异，g r x i 编码的谷氧还蛋白保护 细胞抵御h 2 0 2 的作用。与硫氧还蛋白一样，谷氧还蛋白是氧化应激反应所必须 的一种抗氧剂。 ( f ) 脂溶性抗氧剂 迄今为止，对酿酒酵母细胞的脂溶性抗氧剂还缺乏深入的研究。不过，已有 实验表明细胞脂膜成分对起氧化抗性有很大作用。细胞膜由高度饱和脂肪酸组成 的酵母细胞比由高度不饱和脂肪酸组成细胞膜的酵母细胞对氧化剂具有更强的 抗性。 ( g ) 海藻糖 许多研究表明：海藻糖对酵母细胞的氧化耐受性有很重要的作用，定浓度 1 0 贵州大学2 0 0 8 届硕士生毕业论文 的海藻糖对细胞发生氧化应激反应的作用非常重要。不过，也有学者对海藻糖的 抗氧剂作用表示质疑。因为个别藏株的海藻糖水平并不与其对h 2 0 2 的抗性作耀 大小相关，而且用h 2 0 2 处理细胞也不会诱导海藻糖基因的表达。 ( 2 ) 酶系防御体系 在酿酒酵母细胞的酶系防御体系中，有几个非常重要的酶，可以起到清除自 由基或者修复氧化应激学| 起的细胞损伤的作用。主要包括过氧化氢酶、超氧化物 歧化酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶等。 过氧化氢酶 过氧化氢酶催化细胞内的过氧化氢降解为h 2 0 和0 2 。酿酒酵母主要有两种 过氧化氢酶：过氧化氢酶a 和过氧化氢酶t ，分别由基因c t a l 和c i t l 编码。 过氧化氢酶a 存在于避氧化物酶体中，其主要作用是去除脂肪酸氧化所产生的 h 2 0 2 ；过氧化氢酶t 的生理作用尚待研究，但c t r i 基因酌表达却受氧化应激反 应的调节。在细胞对过氯化氢的应激反应中，过氧化氢酶超着非常重要的作用。 细胞若缺失过氧化氢酶，即使处在稳定期，对过氧化氢也高度敏感，焉旦不能对 过氧化氢产生适应性的应激反应。 0 3 ) 超氧化物歧化酶( s o d ) 超氧化物歧化酶属于金属酶，随着金属的差异，该酶可分为c u z n s o d 、 m i 廑- s o d 和f e s o d 三种。这三耪酶活性部位的金属离子与酶蛋自都在催化反应 中起到关键作用，但是酶的性质与分子结构有所不同，其中c u z n s o d 与其它 两种s o d 的差别较大，褥另外两者之闻的差别却很小。f e s o d 在自然界中的含 量很少，主要存在于原核生物中：动物、植物、藻类以及某些原核生物体内都含 有c u z n s o d 和m n s o d ，在真核细胞中两者分剃存在于细胞质及线粒体内。 从不同来源提纯的c u z n s o d 酶，除个别性质有较大的差异外，都有类似的性 质。相对分子质量一般为3 重0 3 3 0 0 0 k d ，有2 个相同的亚基，每个泛基都含有 一个原子的铜和一个原子的锌。酵母细胞内的s o d 包括线粒体s o d ( m n s o d ) 和细胞质s o d ( c u z n s o d ) 两种。s o d l 编码细胞演s o d ，丽s o d 2 剡编码线粒 体s o d 。s o d 是酵母细胞内重要的抗氧剂，它是歧化作用的主要酶，线粒体 s o d 起到了傈护线粒体免受呼吸作用时产生的0 2 的伤害俸用。当细胞中存在某 一种s o d 时，细胞就获得了氧化应激的耐受性。m n s o d 还可以使细胞获得对 贵州大学2 0 0 8 届硕士嫩毕业论文 热和乙酵的耐受健，当细胞缺失c 彤z n s o d 时，燹| j 会喾致细胞内活性氧类的不平 衡，从而启动m n s o d 基因转录，产生对热和乙醇的耐受性。 ( c ) 硫氧还蛋自氧化物酶( t p x ) 和硫氧还蛋自还原酶 t p x 是一种2 5 k d 的蛋白，其基因已经得到了克隆和测序，与已知的过氧 化物酶、超氧化物歧诧酶、过氧化氢酶不具隧源性。t p x 分为t p xl 、t p x i i 型 两种，l 型t p x 主要还原过氧化氢，而i i 型t p x 则主要还原烷基化合物。t p x 是酿酒酵母中存在的一种重要的保护因子，可以和硫氧还蛋自发生反应，还原过 氧化氢或烷基化合物，同时消除了硫氧化系统对谷胱甘肽合成的抑制作用。 ( d ) 谷胱甘肽还原酶 由予谷胱甘肽的重要的生物学作用，维持细胞酶的g s h g s s g 的比率就显 得非常重要。谷胱甘肽还原酶的作用就是把g s s g 还原为g s h ，维持细胞内较 高的g s g s s g 比率。已经分离鉴定了编码谷胱甘肽还原酶的基因g l r l ，该基 因缺失后可弓| 起细胞内积累较多的g s s g ，豳此，细胞表现得对过氧化氢相当敏 感。 ( 劭谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) i1 2 1 生物细胞中有两种g p x ：典型的g p x 和磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物 酶p h g p x 。p hg p x 为单体形式，部分与膜相连；而g p x 则为四聚体，二者 具有不同的作用底物。在酿洒酵母中，缺乏四聚体型的g p x ，却有三个基因( g p x i ， g p x 2 和g p x 3 ) 分别编码三种不同的p h g p x s 。这种现象在生物界是独一无二的， 因为在一般的细胞巾，编码p h g p x 的基因一般不超过一个，这种独特的现象是 酿酒酵母在特殊的条件下为应付各种应激环境而发展的一种嵩度自我修复作用 的结果。g p x 3 维持着细胞正常代谢条件下的抗氧作用，它的表达不需要任何特 殊应激条件的诱导；在糖饥饿、氧化应激条件下，细胞诱导g p x i ，g p x 2 的表达， 因两加强了机体对各种不良环境的适应能力。 g p x 对过氧化氢和磷脂氢过氧化物都有催化作用，当编码g p x 的基因高拷 贝表达时，会提高细胞对过氧化氢及叔丁基过氧化物的抗性。另外，g p x 对g s h 的合成也有一定的调控作用。 贵州大学2 0 0 8 届硕士生毕业论文 1 2 3 2 氧化应激反应中转录因子的调节作用 蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动，而决定骚白质结构和合成的 时序的信息都由核酸编码，表现为特定的核苷酸序列，所以在机体的氧化应激反 应中最本质的变化发生在基因的表达调控上。基因在转录水平的调控反应主要表 现为信号传导调控、转录因子调控和r n a 剪辑3 个方面。转录因子是一群能与 5 端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空 间表达的蛋白质分子。许多研究证明，酿酒酵母的氧化应激反应是在转录水平上 的调控，目前，已经分离鉴定了一些转录调节因子，它们在氧化应激反应中起着 重要的调节传用。 u ( 1 ) b z i p 转录因子 b z i p 转录因子具有亮氨酸拉链结构，以特定碱性区域与d n a 结合，发挥转 录调节作用。在该类调节因子中，研究的最为广泛驹是、冲1 , y a p 2 和g e n 4 三种 转录调节蛋白，霹前己经有几个实验室分离得到了y 却1 的转录基因y a p i 。y a p l 属于转录活化因子a l p 1 家族中的一员，它是酵母氧化应激反应中的主要调节因 子，通过与结构基因启动子中的a r e 序列结合而达到调节作用。对于启动予中 不含a r e 序列的基因，y a p l 的作用尚有待研究。y a p l 具有多种调节作用，调 控着与硫的氧化还原及谷胱甘肽的合成及再生有关的反应，通过控制谷胱甘肽生 物合成，起到了消除活性氧类的作用。另外，y a p l 还对细胞的增殖起着双重的 调节作用：在通常的生长条件下，y a p l 刺激细胞的分化；在细胞受到过氧化氢 刺激的条件下，y a p l 则阻遏核苷酸合成途径的基因表达，降低d n a 的合成速度， 从而使细胞分化速度下降。缺乏转录西予y a p 2 豹纲胞对各种氧化剂高度敏感， 而y a p 2 基因的高度表达会导致细胞对其抗性的增加。由于目前尚未得到y a p 2 翡西的基因，所以它对氧化应激反应基因表达的调节作用还奄待研究。研究发现， 转录调节因子g e n 4 具有调控多种氨基酸基因表达的作用，它的结合位点与y a p l 毒# 常相似。e n g e l b e r g 研究表碉调节因子g e n 4 在一定程度上调节着酵母缨胞的紫 外线成激反应，对氧化应激反应也起着某些调控作用。 露) 与c 挂结合的转录因予 与c u 结合的转录因子主要有两个：a c e l 和m a c l 。二者的结构很相似，都 具有富含半赋氨酸的氨基酸片段。a c el 调控与瓯稳态水平有关基嚣( 如c u p 熏 1 3 贵州大学2 0 0 8 届硕士生毕业论文 的表达，它还能结合到蛐- s o d 的启动子上，调控细胞质s o d 的表达，不过 a c e l 的这种调控作用并非氧化应激反应的决定性因素。到爨翦为止，还未彻底 了解a c el 对氧化应激反应的确切作用。转录因子m a c l 调控f e 和c u 离子的还 原基因的转录水平，同时它对过氧化氢氧化应激反应中c t t l 基因的表达也起一 定的调节作用，其调控机制相当复杂，可能是一种间接的调节作用。 3 ) 锌指转录嚣子 锌指转录因子是转录因子家族中比较典型的一类，由于结合有z n 离子而形 戒特殊的锌指结构。酵母细胞中锌指转录因子主要包括转录因子h a p l 、m s n l 和 m s n 2 等。h a p l 蛋白调节氧化应激反应中的两个重要的基因c y c l 和c y c 2 的表 达，且与m n s o d 基嚣的表达有关。许多与氧化应激反应有关的酶如c t - 1 7 1 、 c t a l 和m n s o d 都受h a p l 的调节。研究表明：由m s n 2 和m s n 4 编码的两 个锌指蛋皇是s t r e 的结合蛋自，在应激反应中有缀重要的作用。缺乏这两个基 因的突变株由手不能合成相应的调控蛋白而增加了细胞对热休克、渗透压和氧化 刺激的敏感性。僵对过氧化氢刺激所弓| 起的应激反旋，m s n l 和m s n 2 的调控作用 表现出了一定的局限性，这说明一定还存在着另外的转录因子来识别s t r e 并调 控着该反应中的基因表达，但匿翁还未完成这些因子的鉴定。 ( 4 ) 转录抑制因子 、 迄今为止，在酵母的氧化应激反应中人们只发现了一种转录抑制因子，韶 x b p l 鬣白。它是一种分予量为7 2 k d 的蛋白质，属于s w i p m b p l p 转录因子系列。 它含有一个螺旋。转角蝶旋的结构片段，以结合d n a 分子。x b p1 基匿窟动子 包含5 个重复的s t r e 序列、一个g s e ( 热激因子转录基因) 序列和一个a r e ( y a p l 的结合位点序列。嚣前还不清楚具体是哪个转录因子在调节着x b p l 基因瓣表 达，但从其表达模式来看，该基因的表达可能是受s t r e 因子控制的。迄今为止， 氧亿廒激反应造成的菜些蛋自的水平的下降是由于转录掷翻还是由予蛋自分解 速度的提高尚无定论。匿然m a i 等人提出了许多拥有x b p l p 结合位点的基因， 但是实际上还并未鉴定到该转录调节因子的目的基因。x b p l p 可麓起到了抑制基 因的表达从而使蛋白水平降低的作用。鉴定x b p l p 的目的基因并确定其表达水平 与氧化应激反应酶关系将具有菲常重大的意义 1 4 贵州大学2 0 0 8 届硕：f ：生毕业论文 1 2 3 3 信号转导途径 爵前，酿酒酵母氧化应激反应调节方式中的信号转导途径还有待于进一步的 研究。很明显，调节细胞内c a m p 水平的r a s 信号转导途径具有非常重要的作 用。c a m p 调控包括热应激、冷应激以及n c 源饥饿等在内的许多的应激反应， 细胞内c a m p 的水平影响着许多应激诱导基因( 如，s s a 3 ，h s p 2 6 和h s p1 2 等1 的表达，当细胞内。a m p 水平下降时，这些基因即被活化。当细胞由于缺乏 腺苷酸环化酶两使c a m p 合成速度下降时，就会启动应激诱导基团的表达，增 强细胞对多种廒激环境的抗性作用。另外，许多受m s n 2 p m s n 4 p 调节的蛋白也 受c a m p 水平变化的影响，但。a m p 水平调节m s n 2 p 和m s n 4 p 的活性的机理还 有待研究。 1 2 3 4 氧纯应激反应与其它应激反应闻麴关系 辐射、氧化还原活性药物、金属离子等都会弓l 起酵母细胞发生各种应激反应。 研究结果表明，在酿酒酵母中，细胞的氧化应激反成与其它的应激反应之间存在 着明显的不同，但是各种应激反应闻又存在着一定的交互作用。调节因子s t r e 普遍存在于各种应激反威中，受其调节的基因产物是各种氧化应激环境下必须的 保护戮子。热激反应是一类研究得较为透彻得应激反应。对热激反应中所检测鹃 5 0 0 个蛋白质样品的分析结果表明，有8 0 种蛋白质的合成受热激反应的诱导( 其 中药多种蛋自质是主要的热激蛋叁1 ，藤有3 0 0 多种蛋皇质的合成减少，其中合 成受抑制的蛋自主要是核糖体蛋白。热