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广西师范人学硕士学位论文：液相荧光金纳米粒子的制各、表征及其杠分析中的应用 液相荧光金纳米粒子的制备、表征及其在分析中的应用 2 0 0 2 级无机化学硕士研究生：蒋凌风 导师：梁宏教授沈星灿副教授 中文摘要 第一章：综述了液相金纳米粒子的制备方法、光谱性质及其应用等。 第二章：采用柠檬酸三钠还原氯金酸的水热法合成了具有荧光特性的金纳 米粒子。并用透射电镜、紫外可见光谱以及荧光光谱等对其进行了测试。 结果表明金纳米粒子呈球形单分散性，粒径为1 5 0n n l ；在紫外区2 6 4n r n 处有一肩峰，且具有与文献报导一致的峰位5 2 0n l n ：当激发波长为2 6 4a m 时，其荧光发射峰位于3 6 7 1 m 。当改变金纳米粒子的浓度时，其荧光峰的 峰位并不改变，说明该荧光峰确由金纳米粒子产生，且荧光峰的激发和发 射强度均与金纳米粒子的浓度成正比。 第三章：利用金纳米粒子荧光光谱建立了一种检测微量抗癌药物6 巯基嘌 呤f 6 m e ) 的新方法。6 - m p 自组装到金纳米粒子上以后金纳米粒子溶液的荧 光有明显增强。且增强强度，与6 m p 的浓度在6 3 5 x 1 0 一3 0 5 1 0 “m o l l 范围内呈较好的线性关系，检测限为4 8 1 1 0 。1 0 m o l l ，对浓度为1 2 7 x 1 0 “ m o l l 的6 - m p 进行1 1 次平行测定，相对标准偏差r s d = i 7 6 。该法用于 检测溶于人体尿液中6 - m p 的含量，该法简便、灵敏度高、抗干扰性强， 检测结果令人满意。 第四章：研究了利用金纳米粒子测定蛋白质的分析方法。实验结果表明， 在p h = 7 4 3 的磷酸混合盐缓冲溶液条件下，当x e x = 2 6 4m 时，加入牛血 清白蛋白( b s a ) 、人血清白蛋白( h s a ) 、人血丙种免疫球蛋白( 下i g g ) 等蛋白 广西师范大学硕士学位论文：液相荧光金纳米粒子的制备、表征鼓其在分析中的应用 质后金纳米粒子溶液的荧光发射峰仍位于3 6 7n l t l ，且荧光增强强度与蛋白 质浓度的对数值成正比。据此建立了一种测定蛋白质的新方法。对b s a 的 检出限达到4 8 3 1 0 “m g m l ，线性范围为5 7 3 1 0 。1 3 5 7 3 x 1 0 8m g m h 刘 h s a 的检出限达到2 7 1 1 0 。5m g m l ，线性范围为3 8 4 x 1 0 。3 3 8 4 x 1 0 。8 m m l ；对1 - i g g 的检出限达到3 2 0 ： 硼氢化钠法 | 6 j 。用s e h i f f r i n 法既可制备出溶于水的金纳米粒子溶液，也可制出溶于有 机相的金纳米粒子溶液。气相沉淀法是将金蒸气与水蒸气在通有液氮的冷 凝器上沉积，然后将冰溶化制得高纯的金纳米粒子溶液，其浓度相当高， 约为2 1 0 。t o o l l ( 而用柠檬酸钠法制得的金纳米粒子溶液浓度一般在1 0 。1 m o l l 以下) ，而且存放一年未发生任何聚集，稳定性极佳。 当用柠檬酸钠法制备大于6 0n l n 的金纳米粒子溶液颗粒时，颗粒分布 很不均匀，而且颗粒越大，金纳米粒子溶液浓度越稀。b r o w n 和n a t a n 7 1 以1 2n l n 的金纳米粒子溶液为晶种，在a u 3 + 和n h 2 0 h 的溶液中n h 2 0 h 将 a u 3 + 还原，使小粒径的金纳米粒子不断长大，可制得粒径为3 0 1 0 0n m 的 分布均匀的金纳米粒子溶液。 c h o w 和z u k o s k i 8 对金纳米粒子溶液制备的过程作过较详细的研究。 首先柠檬酸根将a u c l 4 - 还原成a u o ，a u o 原子首先吸附性质与其相似的 a u c l 4 ，但由于表面电位差较小，很不稳定，所以a u 2 c 1 2 之间很易聚集。 随着a u c l 4 浓度的减小，金团簇表面开始吸附柠檬酸根，金表面电势差逐 步增大颗粒之间静电斥力也随之加大，煮至生成稳定的金纳米粒子颗粒。 在粒径为1 0 5 0n l n 金纳米粒子溶液形成的最初阶段，出现2 0 0 3 0 0r i m 的聚集体，然后收缩成稳定的金纳米粒子颗粒。 尽管与其他金属胶体相比，金纳米粒子溶液是比较稳定的，但当会纳 米粒子溶液被稀释、遇电解质( 即使是很少量的) 和温度的急剧变化、长 广西师范大学硕士学位论文：液相荧光金纳米粒子的制稀、表征及其在分析中的应用 时间光照时都会使其聚集和变性。为了提高稳定性，可在金纳米粒子颗粒 表面修饰其他分子如采用s c h i f f r i n 法【4 i 等。 根据d l o v 理论，与其他胶体一样，会纳米粒子溶液的稳定性取决与 胶粒之间的范德华引力和双电子层的斥力唧。范德华引力驱使胶粒团聚， 双电子层斥力使胶粒稳定。另外，由于会纳米粒子溶液的密度比其他分子 类型的胶体要高，所以重力对稳定性的影响不可忽视，特别是颗粒较大的 金纳米粒子溶液。用柠檬酸钠制备的金纳米粒子溶液，颗粒越小表面电荷 密度就越高，双电层的斥力大，而且质量较小，所以小颗粒金纳米粒子溶 液的稳定性比大颗粒金纳米粒子溶液高。 e n u s t u n 等 lo j 用阴阳混合离子交换树脂除去金纳米粒子溶液中的阴、阳 离子，将这种金纳米粒子溶液分成三份，一份中不加任何物质，两天后金 纳米粒子溶液产生聚集；第二份中加10 刁m o f ln a c l 0 4 溶液，两周后产生 聚集；第三份中加入1 0 5m o l l 的柠檬酸钠一直未产生聚集作用。这表明金 纳米粒子溶液溶液中需要有一定浓度的阴离子以维持界面的双电层，柠檬 酸根带有较多的负电荷而且在金纳米粒子溶液表面吸附能力强于高氯酸 根。 表面增强拉曼光谱( s e r s ) 研究表明，金纳米粒子表面有许多a 且( o ) 和a u ( i ) 的位点】。这些a u ( i ) 位点可能与阴离子的吸附有关。 尽管金纳米粒子表面吸附着亲水性的阴离子，但会纳米粒子总体上显 示出疏水性f 6 】。在不同极性的材料表面上，极性小、疏水性强的材料最易 吸附金纳米粒子表面。 2 金纳米粒子的光谱性质 2 1表面等离子共振吸收峰 金纳米粒子溶液与金属金的颜色截然不同。用柠檬酸钠法制备的金纳 米粒子溶液通常显酒红色。金纳米粒子溶液随颗粒的大小和表面吸附物的 不同紫外一可见光谱图也不相同。颗粒越小吸收光的波长向短波方向移动， 如用柠檬酸钠法制备的8 9 0 ，1 5 0 ，2 1 7 ，4 8 3 和9 9 3n m 的金纳米粒子溶 液其波长吸收最大值分别为5 1 7 ，5 2 0 ，5 2 1 ，5 3 3 和5 7 5r m l 旧】。 广两师范大学硕士学位论文：液相荧光会纳米粒子的制各、表征及其在分析中的应用 金纳米粒子溶液对光的吸收属等离子共振吸收( p i a s m o nr e s o n a n c e a b s o r p t i o n ) ，m i e 理论l l 副认为球状颗粒的等离子共振吸收是由略高于费米 ( f e r m i ) 能级的导带中自由电子在交变电磁场作用下偶极振荡引起的。直 径 2 5n l n 时，光谱主要是由四和八偶极振荡吸收引起，共振带宽度随直 径的增大而增大。当金纳米粒子直径 2 5r i t i 时，光谱主要由两偶极振荡 吸收引起，共振带宽度随直径的减小而增大。共振吸收变宽与颗粒的聚集 程度和形状有关。p e r s s o n “l 认为共振吸收变宽是由于激发能转变成界面一卜 的吸附能，其能量水平在f e r m i 能级之上。对绝大多数金属胶体而言，当 颗粒尺寸接近或小于导带中自由电子的平均自由程时，尺寸效应就显得非 常明显，此时颗粒大小对吸收光谱影响较大，颗粒较小者，吸收峰高下降， 吸收峰变宽。当温度较高时，吸收强度减弱，吸收带宽加大。温度的影响 主要是电子一电子之间的作用引起的，影响的程度较小。 杨志林等【15 】采用近年发展起来的离散偶极近似( d d a ) 的方法，分析了 金纳米粒子的尺寸及形状对其光学性质的影响。计算结果显示，会纳米粒 子的等离子体吸收带同时受到粒子尺寸和形状的影响，但来自形状的影响更 为明显。在粒子尺寸较小且为球形或椭球状时，d d a 的结果与静电近似的 结果非常一致。 2 2荧光光谱特征 金纳米粒子溶液的荧光光谱已在不同的条件下丌展了研究【1 “2 6 j ，包括 毫微微秒发射 ”1 以及硫醇化合物与金核的稳态反应研究【1 8 1 。主要研究的是 荧光基团包覆金纳米粒子的荧光光谱，包覆的荧光基团有：芘基( p y r e n y l ) f 2 0 】、聚辛基巯基苯基( p o l y o c t y l t h i o p h e n y l ) 【2 2 】、芴基( f l u o r e n y l ) 【2 6 】以及 其他探针2 1 0 3 2 5 1 。实验表明，共振能量转移可在荧光基团包覆金纳米粒子 中观测到，这种现象在生物电子学2 7 1 和材料科学 2 8 - 3 0 1 上引起了极大的研究 兴趣。辐射与非辐射速率主要依赖于金纳米粒子的尺寸和形状、染料分子 间的距离、染料一纳米粒子轴的偶极方向以及分子发射与金纳米粒子的吸收 光谱的重叠程度2 5 1 。高效的小尺寸效应可从属纳米尺度范围内的金属样品 中观察到3 1 - 3 3 。荧光量子产率的增大反映了金纳米粒子上非辐射衰变的减 广西帅范大学硕士学位论文：液相荧光金纳米粒子的制备、表征及其在分析中的应用 弱( 2 l 】。水溶性金纳米粒子的可见发光的可能机理是5 d 1 6 ( s p ) 1 带的能量转 移。 然而，有关单独的金纳米粒子的荧光光谱性质研究非常有限1 3 4 - 3 9 1 。由 金纳米粒子引起的荧光猝灭或增强可应用于检测被荧光物质覆盖的物质 3 4 , 35 1 。对于粒径在8 个原子到更小的粒子( 7 0 时，溶液变成蓝色，金粒子发生聚集。因此加入到 金纳米粒子溶液后的6 - m p 浓度不应太大，要小于6 7 9 x 1 0 。7m o l l 。 2 3 2 3 自组装时间的选择 图3 4 是自组装6 - m p 金纳米粒子溶液的荧光强度随时间变化关系图。 由图可见，该体系在2 - 4 小时内很稳定，其荧光光谱强度基本保持不变。 本实验选择自组装时间为3 小时。 0 5 01 g o1 5 02 0 02 5 03 0 03 5 04 0 0 r e a c t i o nt i m e dr a i n 图3 4 反应时间对自组装6 - m p 金纳米粒子溶液荧光强度的影响 f i g u r e3 - 4 p l o to f r e a c t i o nt i m ev sf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f 6 一m ps e l f - a s s e m b l e d a u n p s t h ec o n c e n t r a t i o no f a u n p s ：9 7 0 1 0 9 m o l l ：t h ec o n c e n t r a t i o no f 6 m p ：1 2 7 x 1 0 7 m o l l 舛 g ! 帅 苦is目翌iii uu艺o；正 广西师范大学顿士学位论文：液相荧光金纳米粒子的制备、袤征及其存分析中的应用 2 3 2 4 酸度的影响 会纳米粒子在水溶液中的稳定性受p h 值的影响“引。实验表明，在p h = 5 ，0 0 8 0 0 范围内，会纳米粒子溶液可以保存数月而不发生聚集。研究了 接近生物体液p h 值6 ，4 5 7 7 3 范围内的p h 值对自组装6 - m p 金纳米粒子 荧光值的影响，结果表明，在该范围内，p h 值的改变几乎不改变荧光强度。 在实验中选择生理p h = 7 4 3 为测试p h 值。 2 3 2 5 干扰实验 在上述实验条件下，对浓度为1 2 7 x t 0 。7m o l tl6 - m p 的标准溶液进行 干扰实验，在相对误差不超过士5 的情况下，2 0 0 倍的k + ；1 0 0 倍的c a 2 + 、 m 9 2 + ；1 0 0 倍甘氨酸；4 0 倍的z n 2 + 、n i 2 + 、异亮氨酸、葡萄糖；2 0 倍的天 冬氨酸；1 0 倍的尿嘧啶、酪氨酸等不干扰实验测定。但是，1 倍的半胱氨 酸和0 2 倍的色氨酸、赖氨酸、腺嘌呤或胞嘧啶都会严重干扰测定。这可能 是因为半胱氨酸中的s h 也与金纳米粒子中的a u 原子形成了a u s 键的缘 故”“，而色氨酸、赖氨酸、腺嘌呤以及胞嘧啶中的- n i l 2 和一n h 一可同时与 会原子作用5 7 1 ，而使余纳米粒子溶液发生聚集现象影响实验测定结果。 表3 1 共存物质的影响 t a b l e3 - 1i n f l u e n c eo f c o e x i s t i n gs u b s t a n c e so i lt h ed e t e r m i n a t i o no f12 7 ) ( 1 0 。7m o l l6 - m p 测试条件：金纳米粒子溶液的浓度：9 7 0 x 1 0 一m o l l ；6 - m p 的浓度：1 2 7 x 1 0 7 m o l l l 广西师范大学硕士学位论文：液相荧光金纳米粒子的制备、表征及其在分折中的应用 2 4 工作曲线、检测限和精密度 以金纳米粒子的荧光光谱值作为空白值0 ；自组装6 - m p 金纳米粒子 的荧光光谱值作为实验值。在选定的实验条件下，6 一巯基嘌呤对金纳米 粒子溶液的荧光增强强度= 上山与6 - m p 的浓度在6 3 5 x 1 0 罐3 0 5 x 1 0 。7 m o l l 范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为，= 4 8 4 十 1 1 0 1 0 8 c 6 - m p ( m o l ll ) ，线性相关系数r 2 = o 9 9 8 7 ，由文献4 1 可知，该法置 信度达到9 9 9 以上。对浓度为1 2 7 x 1 0 1m o l l 的6 - m p 进行1 1 次平行测 定，相对标准偏差r s d = i 7 6 ，根据i u p a c 规定，计算了该法的检测限 ( 3 0 k ) 为4 8 1 x 1 0 。o t o o l l 。据此可建立一种检测6 一巯基嘌呤的新方法。 ( ) x 1 0 2o x l 0 3 0 x i t h ec o l l c e n l f l l t i o i r lo f 6 m p m o l 图3 - 5 荧光增强强度，与6 - m p 的浓度关系曲线 f i g u r e3 - 5 t h ec a l i b m l i o no f t h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n t ， n d t ht h ec o n c e n t r a t i o no f 6 一m p 2 5 样品分析 按照本实验方法，对溶解于常人尿液中的6 - m p 含量进行测定，结果 列于表3 2 。从表可以看出，该法的测定结果令人满意。 2 9 钟 m 0 广西师范大学硕士学位论文：液相荧光台纳米粒子的制备、表征及其在分析中的应用 表3 2 溶解于常人尿液中6 - m p 含量测定结果 t a b l e3 - 2r e s u l t so b t a i n e di nt h ed e t e r m i n a t i o no f 6 一m pi ns p i k e dh u m a nu r i n e 2 6 结论 利用金纳米粒子荧光光谱建立了一种检测微量抗癌药物6 一巯基嘌呤 ( 6 - m p ) 的新方法。6 - m p 自组装到金纳米粒子上以后金纳米粒子溶液的荧光 有明显增强。且增强强度i 与6 - m p 的浓度在6 3 5 1 0 一3 0 5 x 1 0 。m o l l 范围内呈较好的线性关系，检测限为4 8 1 1 0 。o m o l l ，对浓度为1 2 7 x 1 0 7 m o l l 的6 - m p 进行1 1 次平行测定，相对标准偏差r s d = i 7 6 。该法用于 检测溶于人体尿液中6 - m p 的含量，该法简便、灵敏度高，抗干扰性强， 检测结果满意。 广西师范人学硕上学位论文：液相谈光金纳米粒了的制各、表征及其在分析中的应用 第四章 荧光金纳米粒子应用于定量测定蛋白质 目前，生化及临床上常用的蛋白质分析方法是l o w r y 法【5 1 ，c o o m a s s i e b r i l l i a n tb l u e ( c b b ) 法川以及b r o m o p h e n o lb l u e ( b b ) i t 6 1 法。但这些方法 存在较低的灵敏度、实验过程时间较长且复杂。所以其他不同的方法已被 发展起来，如用硝酸纤维薄膜印迹染色的方法 7 9 , 8 0 ，银染法f 7 1 、胶体金吸 收法 7 7 7 8 ，1 1 引、荧光澍1 19 。1 2 1 】、化学发光法1 2 2 1 和电化学法旧l 。w a n g 等1 2 4 “7 1 利用不同纳米粒子的共振光散射技术检测了纳克级蛋白质。z h u 等”8 1 利用 胶体a g c l 的共振光散射的猝灭方法也发展起了种检测纳克级蛋白质的 新方法。但是利用金纳米粒子的荧光来检测蛋白质的方法尚未见报道。本 文实验结果表明，在生理p h 值条件下，利用金纳米粒子的荧光束测定测定 蛋白质可检测到皮克级蛋白质，灵敏度较高，检测范围达到5 个数量级， 该法用于人血清样品中蛋白质总含量的分析并同c c b 法比较，结果基本一 致。 c b b 法是一种常用的微量蛋白质快速测定方法，其原理如下： c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u eg 一2 5 0 在游离状态下呈红色，最大光吸收在4 8 8 n m ： 当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质一色素结合物在5 9 5 n m 波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u eg ，2 5 0 结合在2m i n 左右的时间内达到平 衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1 h 内保持稳定。测定蛋白质浓 度范围为o 1 0 0 0 肛m l 。 1 实验部分 1 1 实验仪器与试剂 1 1 1 试剂 h a u c h ( a l f a a e s a r 公司) ，配制成o 0 1 h a u c l 4 溶液：柠檬酸三钠( 合 肥工业大学化学试剂厂，分析纯) ，配制成o 1 0 柠檬酸三钠溶液；牛血清 白蛋白( b s a ) ( s i g m a 公司) ；人血清白蛋白( h s a ) ( 武汉瑞德生物制品有 广西师范大学硕士学位论文：液相荧光金纳米粒子的制各、表征发其神：分析中的应用 限责任公司) ；人血丙种球蛋白似i g g ) ( s i g m a 公司) ；三种蛋白质溶液均 配制成0 1 0m g m l 水溶液，置于冰箱4 保存，使用时逐级稀释。 c c bg 一2 5 0 ( f l e a 公司) 溶液的配制：称取7 5 0m g 试剂，溶于4 0 0m l 甲醇内，再加8 5 o 浓磷酸1 0 0m l ，浓盐酸5 0 0m 1 ，加水到1 0 0 0m l 。p h = 7 4 3 的o 0 1r o o fl 磷酸混合盐缓冲溶液。配制溶液均使用二次去离子水。 人血清样品由广西师范大学校医院提供。 1 1 2 实验仪器 r f - 5 3 0 1 型荧光分光光度计( j a p a n ，s h i m a d z u ) 微量进样器( 上海金林生化试剂仪器厂) p h s 一2 5 c 型酸度计( 上海雷磁仪器厂) d h g 一1 0 1 系列电热恒温鼓风干燥箱( 上海华连医疗器械有限公司) 1 2 胶体金纳米粒子的制备 参照论文第二章1 2 i 。 1 3 实验方法 1 3 1 在一系列1 0 0m l 具塞比色管中，各加入1 o om l 金纳米粒子溶液，5 o o m lp h = 7 4 3 的o 0 1m o l l 磷酸混合盐缓冲溶液，再加入不同浓度的蛋白质 溶液1 0 0m l ，最后再加入o 4 0 m 1o 5 0 的n a c i 溶液，用水定容至1 0 0m l ； 充分振荡摇匀，于室温下静置1 h 后测其荧光光谱。 1 3 2 在荧光分光光度计上，控制狭缝宽度e x e m = 1 0n m 1 0n m ，高灵敏度。 在1 0 0c m 荧光池中置入适量金纳米粒子溶液或金纳米粒子一蛋白质混合 溶液，以k x = 2 6 4n l n 作为激发波长，在3 1 0 4 1 0 n m 之间，记录其荧光发 射光谱。 2 结果与讨论 2 1 荧光光谱 按照实验方法1 ，3 2 ，发现随着蛋白质的加入，金纳米粒子一蛋白质溶 广两师范大学硕士学位论文：液相荧光金纳米粒子的制备、表征发其在分析中的应用 液的最大发射波长并未改变，仍为3 6 7h i l l ，如图4 1 、4 - 3 、4 5 所示；但其荧 光强度随着蛋白质浓度的增大而增强，增强强度i 与蛋白质浓度的对数值 成较好的线性关系，如图4 2 、4 - 4 、4 - 6 所示。在h e x = 2 6 4n l t l 激发波长下， 三种蛋白质b s a 、h s a 、3 - i g g 在3 6 7n l n 处没有荧光发射峰。 3 1 0 3 2 03 3 03 4 0 3 5 03 3 7 03 8 0 3 9 0 4 0 0 4 1 0 w a v e l e n g t h , n m 图4 1 金纳米粒子一b s a 体系的荧光光谱图 f i g u r e4 - 1 t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao f a u n p s b s as y s t e m t h ec o n c e n t r a t i o no f a u n p s ( m g m 1 ) ：9 5 5 x 1 0 ；t h ec o n c e n t r a t i o no f b s a ( m g m 1 ) ：a ：0 b ：5 7 3 1 0 。”；c ：5 7 3 1 0 + ”；d ：5 7 3 1 0 一“；e ：5 7 3 1 0 。”；t5 7 3 1 0 一；g ：5 7 3 1 0 8 1 6 1 4 1 2 1 0 8 6 4 1 3 - 1 2t 0 - 9- b i gc b s a 图4 2 荧光增强强度肚i l g c b s a 的关系曲线 f i g u r e4 - 4t h ec a l i b r a t i o no f f l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n t k l w i t hl g c t j s s , 嚣惦弱巧柏侣竹 暑i s c 3 u l 8c8墨苦nil 广两师范大学硕士学位论文：液相荧光金纳米粒子的制各、表征及其在分析中的应用 3 1 03 2 03 3 03 4 03 5 03 3 7 03 8 03 9 04 0 04 t 0 w a v e l e n g t h n m 图4 3 金纳米粒子- - h s a 的荧光光谱图 f i g u r e4 - 3t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao f a u n p s h s as y s t e m t h ec o n c e n t r a t i o no f a u n p s ( m g m 1 ) ：9 5 5 1 0 ：t h ec o n c e n t r a t i o no f h s a ( m g m 1 ) ：a ：o ； b ：3 8 4 x 1 0 。”；c ：3 8 4 x 1 0 - 1 2 ；d ：3 8 4 x 1 0 。”；e ：3 8 4 1 0 ”；3 8 4 x 1 0 一；g ：3 , 8 4 x 1 0 - 8 1 6 1 4 1 2 1 0 司8 6 4 2 0 1 31 21 11 09 8- 7 l ge l l s a 图4 4 荧光增强强度，与1 9 c h s a 的关系曲线 f i g u r e4 - 4 t h ec a l i b r a t i o no f f l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n ta w i t hi g c h s a 3 4 ：； 惦 药 神 侣 仲 扫i。c3三oucoo悱on|k 广西师范大学硕十学位论文：液相荧光金纳米粒子的制各、表征及其在分析中的成用 3 1 03 2 03 3 03 4 03 卯3 6 03 7 03 舯3 9 0 4 舯4 1 0 w a v e l e n g t h m 图4 5 金纳米粒子一下i g g 的荧光光谱图 f i g u r e4 - 5 t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao f a u n p s - 7 - i g gs y s t e m t h ec o n c e n t r a t i o no f a u n p s ( m g m 1 ) ：9 5 5 1 0 ：t h ee o n c e n t r m i o no f t i g g ( m g m 1 ) ：a ：o ： b ：6 4 0 1 0 。1 3 ：c ：6 4 0 1 0 。1 2 ；d ：6 4 0 1 0 - 1 1 ；e ：6 4 0 1 0 。1 0 ；e6 4 0 1 0 。9 ；g ：6 4 0 1 0 。8 1 6 1 4 1 2 1 0 h8 司 6 4 2 0 1 3 1 2- 1 11 0- 9- 8- 7 瞻i g g 图4 6 荧光增强强度，与l g c t 螂的关系曲线 f i g u r e4 - 6 t h ec a l i b r a t i o no f f l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n ta w i t hl g c r j s g 蛄 钟 书 帅 弱 ；盆 加 博 加 圣磊=甚i u苎8譬oje 广西师范大学硕士学位论文：液丰日荧光金纳米粒子的制备、表征及其存分析巾的应用 2 2 蛋白质浓度的影响 蛋白质的加入，能使金纳米粒子溶液的荧光强度明显增强，但当蛋白 质的浓度较大时，体系会在3 4 0l l l n 处出现一较强的发射峰而掩盖金纳米粒 子的特征峰3 6 7n n - 1 ，因此，蛋白质的浓度不宜太大。实验发现，当固定金 纳米粒子的浓度时，蛋白质的浓度应小于1 o o x l o 西m g m l 才不影响到分析结 果。本实验采用的蛋白质浓度范围为1 0 0 x 1 0 。5 1 o o x l o m g m l 。 2 3 最佳酸度的确定 酸度对金纳米粒子一蛋白质体系的荧光强度影响不大，我们研究7 p h - - - - 4 ，3 5 - - 8 4 2 范围内变化时体系的荧光强度，发现在p h = 7 4 3 时荧光强度最 大，如图7 所示。因此我们选择p h = 7 4 3 的磷酸混和盐缓冲液。 4s6789 p h 图4 - 7 缓冲溶液p h 对荧光强度的的影响 f i g u r e4 - 7 p l o to f p hv a l u eo f b u f f e rs o l u t i o nwf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y t h ec o n c e n t r a t i o no f a u n p sa n d b s a ( m g m 1 ) ：9 5 5 x 1 0 7 a n d5 7 3 x 1 0 1 0r e s p e c t i v e l y 2 4 盐效应的影响 繇 甜 盼 招 盯 拍 非 “ 占is目o-目hu目u器-04一凶 广西师范大学硕士学位论文：液相荧光金纳米粒子的制各、表征及其以玢析中的应用 考察了离子强度对体系的影响，结果表明：测定体系中n a c i 的浓度不 超过0 0 2 时，体系的荧光强度基本保持不变，继续增大n a c l 的浓度，体 系的荧光强度增大。 2 5 反应时间对荧光强度的影响 在室温下，金纳米粒子一蛋白质体系的荧光强度在5 0 9 0 m i n 保持恒 定，如图8 所示。故我们控制实验在此时间段内完成。 o2 04 06 0 8 01 0 01 2 0 t i m e m i n 图4 8 荧光强度与反应时间的关系 f i g u r e4 - 8 t h ec o n n e c t i o no ff l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya n dr e a c t i o nt i m e t h ec o n c e n t r a t i o n o f a u n p sa n d b s a ( m g m 1 ) ：9 5 5 x 1 0 。7 a n d5 7 3 1 f f o r e s p e c t i v e l y 2 6 共存物质对荧光强度的影响 在生物分析领域常见的共存物质主要是一些阳离子和氨基酸，为此对 它们的干扰情况进行了测定。结果表明：在实验条件下，对于5 7 3 x 1 0 。1 0 m g m l o 勺d s a ，误差在士5 范围内，常见的金属阳离子和氨基酸不会影响实验结 果。 ：； 非 ：5 ； 巧 幼 五lsco芒一ucu协o n i l 广西师范人学硕士学位论文：液相荧光金纳米粒了的制各、表征及其谯分析中的应用 2 7 蛋白质测定的线性回归方程 按照实验条件，测定了三种蛋白质的工作曲线，结果列于表4 2 。由文 献 1 1 4 1 可知，该法置信度达到9 9 9 以上。 表4 2 不同蛋白质测定的线性同归方程 t a b l e 4 2 t h el i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o n sf o r t h ed e t e r m i n a t i o no fd i f f e r e n tp r o t e i n s b s a h s a y - i g g i = 2 6 9 9 + 1 8 6l g c a s a ( m g m 1 ) i = 2 7 9 1 + 2 1 7 1 9 c h s a ( m g m 1 1 l = 2 7 0 2 + 0 9 9 9 15 7 3 x1 0 13 5 7 3 x1 0 8 o 9 9 8 23 8 4 x 1 0 - 1 3 3 8 4 x1 0 8 o 9 9 7 86 4 0 x1 0 1 3 2 0 9l g c t i g g ( m g m 1 ) 6 4 0 10 8 ：检测限为3 a k 4 8 3 1 0 一1 5 2 7 1 1 0 1 5 3 2 0 x 1 0 1 5 3 8 二墅鎏查堂塑主兰些堡塞：堕塑茎垄全垫坐垫王塑型墨：墨堡丝苎垄坌堑主塑生望 2 8 实际样品的分析 以人血清白蛋白作为标准溶液测定人血清中蛋白质的总量【1 ，并同 c b b 标准方法比较，结果基本一致。如表4 3 所示。 表4 - 3 人血清样品中蛋白质的总最 f i g u r e4 - 3 t o t a lc o n t e n to f p r o t e i n si nh u m a ns e r u ms a m p l e 2 9 结论 研究了利用金纳米粒子测定蛋白质的分析方法。实验结果表明，在p h - - - - 7 4 3 的磷酸混合盐缓冲溶液条件下，当；、_ e x = 2 6 4n l t l 时，加入牛血清白 蛋( b s a ) 、人血清白蛋i ! t ( h s a ) 、人血丙种免疫球蛋 ；t ( 3 , - i g g ) 等蛋白质后 金纳米粒子溶液的荧光发射峰仍位于3 6 7n i n ，且荧光增强强度与蛋白质浓 度的对数值成一较好的线性关系，据此建立了一种测定蛋白质的新方法。 埘b s a 的检出限达到4 8 3 x 1 0 。1 5 m m 1 ，线性范围为5 7 3 x 1 0 。3 5 7 3 x 1 0 4 m g m l ；对h s a 的检出限达到2 7 1 x 1 0 。5m g m l ，线性范围为3 8 4 x 1 0 ” 3 8 4 x 1 0 书m m l ；对下培g 的检出限达至03 2 0 x 1 0 。1 5 m g m l ，线性范围为 6 4 0 x 1 0 。3 6 4 0 x 1 0 一m g m l 。该法用于人衄清样品的分析并同c c b 法比较， 结果基本致。 广西师范大学硕士学位论文：液相荧光金纳米粒子的制备、表征及其在分析中的应用 硕士期间整理及发表的论文 1 蒋凌风，沈星灿，梁宏金纳米粒子的制备及其在生物分析中的应用 2 0 0 3 年中西部十五省化学化工会议论文 2 蒋凌风，沈星灿，梁宏液相荧光金纳米粒子的制备表征及分析应用 2 0 0 5 年中西部十五省化学化工会议论文 3 x i n g - c a ns h e n ，l i n g f e n gj i a n qh o n gl i a n g ；l a i j u nz h a n g ， x i n y a hl i u d e t e r m i n a t i o no f6 - m e r c a p t o p u r i n eb a s eo i lt h ef l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n to f a un a n o p a r t i c l e s ，t a l a n t a ( s u b m i u e d ) 4 l i n g - f e n gj i a n g , x i n g - c a ns h e n ，y um a o ，h o n gl i a n g d e t e r m i n a t i o n o fp r o t e i n sb a s eo l lt h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n to fg o l dn a n o p a r t i c l e s ( p r e p a r e d ) 4 0 广两师范大学硕上学位论文：液相荧光金纳米粒了的制各、表 j f 及j e 在分析中的应用 参考文献： 1 d o r o n a ，k a t z e ，w i l l n e r i l a n g m u i r ，1 9 9 5 ，1 1 ：1 3 1 3 2 g r a b a rk c ，a l l i s o nkj ，b a k e rbe ，e ta 1 l a n g m u i r ，1 9 9 6 ，1 2 ：2 3 5 3 3 k h l e b t s o vngb o g a t y r e vva ，d y k m a nla ，e ta 1 jc o l l