（植物学专业论文）不同表型盐地碱蓬叶片抗氧化系统的研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 英文缩写符号及中英对照表 英文缩写中文全称 英文全称 a p x 抗坏血酸过氧化酶 a s c o r b a t ep e r 0 ) 【i d a s e a s a 抗坏血酸 吣c r o b a t e b s a 小牛血清蛋白 b o v i n es e n m la l b u m i l l c a = r 过氧化氢酶 c a t a l a s e c l d 叶绿素 c h l o r o p h y l l d t t 二硫苏糖醇d i 廿：l i o l r e i t o l e d ，i = a 乙二胺四乙酸 e t l l y l e n e d i a m i n e t e 他a c e t i ca c i d g s h 谷胱甘肽 g l u t 砒i o n e m d a 丙二醛 m a l o n d i a l d e h y d e m e t 蛋氨酸 m e n l i o r l i l 舱 n b t氯化硝基四唑兰n i 仃ob l u et e t r 北o l i 啪c h l o r i d e p o d 过氧化物酶 p e r o x i ( 1 a s e p r 0 脯氨酸 p r o l i n e p v p 聚乙烯吡咯烷酮 p l o y v i l l y 呐哟l l i d 0 地 r o s活性氧 r e a c t i v e0 x y g 饥s p e c i e s s o d 超氧化物歧化酶 s u p e r o x i d | ed i s m u t 笛e t e m e d n ，n ，n ，n 一四甲基乙烯二胺 n n n n t e 觚m e n l y le t l l y l e n e h 觚l i i l e t c a 三氯乙酸 t r i c l l l o r o a c e t i ca c i d t b c 硫代巴比妥酸t l l i ob a rb i t u r i ca c i d 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：面田够铜导师签字：易方二 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权趁可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：噩醵潮 导师签字：三 参易 ，弓 签字日期：2 0 0 8 年月日签字日期：2 0 0 8 年月日 山东师范大学硕士学位论文 不同表型盐地碱蓬叶片抗氧化系统的研究 摘要 盐地碱蓬( 觑口e 如阳加l ) 是一种肉质化真盐生植物，能在盐碱化土壤和 滨海滩涂地区正常完成生活史。盐地碱蓬有两种表型：在滨海的潮间带或者部分 涝洼积水地带生长的植株在整个生长期地上部分皆为紫红色；而在地势较高或距 离海边较远的盐碱地植株则呈现绿色。前者受高盐、低温及淹水的影响，而后者 则主要受到盐胁迫和干旱的影响，不同生境诱导了盐地碱蓬不同的表型。在逆境 条件下，植物体内得活性氧的生成和清除会发生改变，植物体内非酶促和酶促抗 氧化系统也存在着差异。 本实验主要以不同自然生境下两种表型盐地碱蓬成熟叶片为材料，一方面， 通过测定两种表型成熟叶片的含水量、渗透势、离子含量、可溶性糖含量、脯氨 酸含量和叶绿素含量，对两种表型叶片生长等状况进行了研究；另一方面，测定 了非酶促抗氧化剂抗坏血酸( a s a ) 、还原型谷光甘肽( g s h ) 和甜菜红素含量及 超氧化物歧化酶( s o d ) 、抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 、过氧化氢酶( c a t ) 和过 氧化物酶( p o d ) 的活性，并进行了同工酶分析，比较了不同生境条件下两种表 型盐地碱蓬叶片抗氧化系统的差异。 本文主要研究结果如下： 1 紫红色和绿色表型盐地碱蓬叶片含水量、溶质和渗透势的比较 紫红色表型盐地碱蓬含水量为9 8 6 ，显著高于绿色表型的9 6 6 ，肉质化 程度也显著高于绿色表型。紫红色表型盐地碱蓬叶片的n a + 含量显著高于绿色表 型，k + 无显著性差异。紫红色表型盐地碱蓬n a 7k + 高于绿色表型，达到极显 著水平。可溶性糖降低植物叶片渗透势，对植物逆境伤害有缓解作用，紫红色表 型盐地碱蓬叶片的可溶性糖含量( 8 2 9 6 肛g 佗f w ) 高于绿色表型( 6 3 0 8p 眺f 哪， 达到极显著水平。脯氨酸作为一种渗透调节物质，保护膜与酶的结构，缓解胁迫 压力，在植物遭受逆境时发挥作用。紫红色表型盐地碱蓬脯氨酸含量显著高于绿 色表型，达到极显著水平。紫红色表型盐地碱蓬离子和可溶性溶质含量高于绿色 表型，紫红色表型盐地碱蓬叶片渗透势为4 1 8 a 低于绿色表型盐地碱蓬的 3 4 4 m p a ，达到极显著水平，利于植物叶片吸水。 2 紫红色和绿色表型盐地碱蓬色素含量的比较 甜菜红素是一种水溶性的色素，主要集中在液泡当中，对于渗透势的降低和 抗氧化起作用。紫红色表型盐地碱蓬叶片的甜菜红素含量( 6 1 4 岬。垤f w ) 高 于绿色表型( 2 6 3 岬l o 垤f w ) ，达到极显著水平。绿色表型盐地碱蓬叶片中叶绿 素a ，b 均显著高于紫红色表型盐地碱蓬。绿色表型盐地碱蓬中总叶绿素含量 c h l a + b 也显著高于紫红色表型，但是紫红色表型盐地碱蓬叶片叶绿“叶绿素b 山东师范大学硕士学位论文 极显著高于绿色。叶绿素a b 的值可以反映叶绿体中类囊体的垛叠程度，类囊体 垛叠程度越高，光抑制越不易发生，抵御氧化胁迫的能力增强。表明在高盐、低 温和淹水综合逆境下形成紫红色表型盐地碱蓬叶片叶绿体中类囊体的垛叠程度 高，抗氧化能力强于盐胁迫环境中形成绿色表型盐地碱蓬。 3 紫红色和绿色非酶促抗氧化系统的比较 紫红色表型盐地碱蓬叶片中g s h 含量、a s a 含量和甜菜红素含量都显著高 于绿色表型，抗氧化物质为耐受逆境的胁迫提供了条件；同时紫红色表型盐地碱 蓬叶片较高a s a 含量也是a p x 清除h 2 0 2 的必要条件。 4 紫红色和绿色酶促抗氧化系统和同工酶的比较 不同自然生境下紫红色表型盐地碱蓬叶片中s o d 和a p x 的活性高于绿色 表型，达到极显著水平。然而绿色表型盐地碱蓬p o d 和c a t 活性则高于紫红 色表型盐地碱蓬，也达到极显著水平。 s o d 、a p x 、c a t 、p o d 四种抗氧化酶的同工酶分析，发现了这两种盐地 碱蓬叶片抗氧化酶酶谱的不同。紫红色表型盐地碱蓬叶片s o d 、a p x 表达量分 别为绿色表型的1 6 5 倍和1 5 6 倍，绿色表型盐地碱蓬叶片c a t 、p o d 表达量分 别为紫红色表型的5 2 倍和1 4 5 倍。两种表型盐地碱蓬叶片抗氧化酶的活性和 同工酶表达均不同，表明它们依赖不同的抗氧化酶清除体内的活性氧。 本文结果表明，潮间带紫红色表型盐地碱蓬可能通过提高叶片非酶促抗氧化 剂g s h 含量、a s a 含量和甜菜红素含量和关键抗氧化酶s o d 和a p x 活性来适应 潮间带高盐、缺氧和低温的综合逆境。 关键词：盐地碱蓬；表型；叶片；酶促抗氧化剂；非酶促抗氧化剂 分类号：q 9 4 5 7 8 2 山东师范大学硕士学位论文 c 0 m p a r a t i v es t u d y o nl e a fa n t i o x i d a n ts y s t e mo fg r e e na n d r e d - v i o l e tp h e n o t y p ej 9 跖口砌s 口如口 a b s t r a c t 鼽口p 如s 口豇口l i sas u c c u l e mh a l 叩l i y t e & 踟砌p l a n t sa r er e d v i o l c t ( r e d - v i o l e t p h e i l o t y p e ) w h c i lt h e yg r o wi l lt i d e l 觚da n dt h o s ea r eg r e e n ( 乒e e np h e n o t y p e ) 、7 i ，：h e n t l l c y 伊o w si ns a l i n es o i lf 缸丘0 mt h et i d e l 锄d r e d - 访o l e tp h 朗o t ) ，p e 跏p 如阳蛔 毋0 w su n d e rt h es 缸e s s e so fs a l i i l i 劬h y p o x i a 趾d1 0 wt e m p e r a t l l r e ，m eg r e e no n e 黟o w su i l d e rt l l es 仃e s s e so fs a l i i l i t ) ra n da i i d i 吼t h ed i 熊獭l te n v i r o 衄e n ti i l d u c e s d i a ：e r e n tp h e n o t y p e u n d e rt l l ed i 行e r e i l ts 仃e s s 髓，e n z y m 撕ca i l dn o n e n z y m a t i c a n t i o x i d a n tm e c h a i l i 锄sc o u l d a l s ob ed i f 衔e mi i lt 1 1 e 锄r 0p h e i l o t ) ，p 铭t 0a d a p tt 0 e n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s h 1t h ep r e s 既ts t u d y ，t l l em a n 鹏l e a v e so f 锕op h e l l o t y p 懿& 阳西口p l a n t sg r o w l l u n d e rn a _ t l l r a le r 的姗e n t ( i nt h ey c l l o wd e l t a ) w e r eu s e dt os t l l d y 既屹) ，i i l a t i ca n d n o n e i l z ) ，i i l a t i ca n t i o x i d a n t s o nt l l eo mh a i l d ，w a t e rc o n t e n t ，o s i n o t i cp o t e l l t i a l ，i o n c o m e m ，m ec o n t e n t so f s o l u b l es u g a r 、p r 0 、g s h 、j 姒w e r ed e t e 肌i n e dt og a i l li i l s i g h t i i l t 0m er e s p o n s e so f 俺r 0p h e n o 帅e st 0d i 舒胃即te i i r m 吼e n t s o nt h eo 廿1 e rh 锄d ，m e a c t i v 时o fs o d 、a p x 、c a t a i l dp o dw e r em e 解u r c d ，锄dt h eb 孤d so fi z y m eo f s o d 、a p x 、c a t 、p o dw e r ea l s o 觚a l y s e dt 0e x 锄i n ew t l e t h e r t l l e r ei s 觚yd i 佰：r e n c e b e t w e e n 押op h e i l o 咖e s t h em a i l lr e s u l t so ft l l i ss t u d ya r c 鹊f o l l o w s ： 1 t h ec o m p a r i s o no ft h ep h y s i o i o g i c a lp a r a m e t e r so ft h em a t l l nl e a v e so ft w o p h e n o t y p e s & s 讲妇 t l l el e a fw a t e rc o n t e n to fr e d 一访o l e tp h 肌o t y p e & s 口西口w 弱9 8 6 趾dm eg r e 铋 o mw 豁9 6 6 n l ed e 蓼e e0 fl e a fs u c c u l e n c eo fr e d 新o l e tp h e i l o t y p e s 口b 口w 弱 m u c hl l i 曲e rm a i lm a to fg r e e no 鹏n 僵rr a t i oo fr e d - v i o l e tp h e n o t y p e & 册加w 弱 m u c hl l i g l l e rt l l a nt 1 1 a to f 孕e e no i l e s o l u b l es u g a r 雅dp r o l i i l ec a nr e d u c eo s m o i t i c p o t e n t i a lo fl e a fa n da l l e v i a t et l l es 仃e s s e s t h ec o n t e n to fs 0 l u b l es u g a ro fr e d 一、，i o l e t p h e n o t y p e & s 口红口( 8 2 9 6p g 儋f w ) w 弱i n u c hl l i g l l e rt h a l lm a to f g r e e l lo n e ( 6 3 0 8 毗f 聊p r o l i n ec 趾a l s 0p r o t e c tt h em 锄b 瑚e p r o l i n ec o n t 饥to f 川- v i o l e t p h e l l o t ) ，p e & s 口厶口w 弱m u c hl l i g l l e rt h a i lt h a to fg r e e no n c r e d - v i o l e tp h e i l o t y l e & 3 s 口豇口a c c u m u l a t e dm o r ei o n 锄ds o l u b l es o l u t e sm 锄m eg r e e no n e ，w h i c hi s t h e r e a s o nf - o rm a to s m o t i cp o t e n t i a l ( 4 18 m p a ) o fr e d - 访o l e tp h e n o t y p e w 觞m u i h1 0 w e r t h a nm a to fg r e e no i l e ( 3 。4 4 m p a ) i tw a si nf a v o ro fa b s o r b i n gm e w a t e r 吼d e rs 仃e s s e n v i r o m e n t 2 t h e c o m p a r i s o no fl e a fp i g m e n to ft w op h e n o 姆p e s s 口西4 b e t a c y a i l i ni sal 【i n do fs o l u b l ep i g m e n ti nv a u c u o l e ni sp o s s i b l e l yi n v 0 1 v e dl n r e d u c i n gm eo s m o t i cp o t 饥t 乩r e c 咖s t u d i e sa l s os h o w t h a tb e t a c y 弛l sak mo t 觚t i o x i d a n t s b e t a c y a n i nc o n t e n to fr c d v i 0 1 e tp h e n o t y p e & s 口厶口( 61 4 m o 垤f w ) w a sm u c hh i g h e rm a l lm a to fg r e c i lo n e ( 2 6 3p m o 垤f w ) h o w e v e r t 1 1 ec o n t e i l t so f 。 c h l o r o p h y l laa n dc h l o r o p h y l lbo f g r e e i lp h c n o t ) ，p e & s 口厶w e r et l i g l l e rm 锄t h o s e0 f t h er e d v i 0 1 e to n e i n t e r e s t i n g l xc h l 鲫0 p h y l la 办c h l o r o p h y l lbo fr e d v i 0 1 e tp h 铋9 姊e & s 口西w a sl l i 出e rt h a i lt h a to f 乎e e no n c c h l o p h 姐la c h l o r o p h y l lb r a t i oi n d i ca ：t e s 也e d e 每e eo ft h et h y l a k o i d s t 1 1 eh i 曲e rt h er a t i o ，m em o r ep o w e m lp h o t o p r o t e c to f t h e n l v l a k o i d s t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tr e d - v i o l e tp h e n o t y p e & s 口厶口p l 觚t sf 0 m e di i l m ef l o o d i n g ，l o wt e n 叩e r ：l t i 鹏觚dl l i 班s a l i i l i 够p o s s e s sm o r ee 伍c i e i l ta 1 1 t i o x i d 觚t m e c h a m s mt h a nm e 伊e e no r l ef 0 肌e do i l l yi n1 1 i 曲s a l i n i 够 3 t h ec o m p a r i s o no fi e a fn o n e n z y m a t i ca n t i o x i d a n t so f 锄op h e n o 够p 髑& s q l s 伍 t h eg s ha l l da s aa r et w ok i n d so fn o n e i 】亿y i l l a t i c 锄t i o x i d a i l t s t h ec o n t e n to f g s ha n da s ao fr e d - v i o l e tp h e n o t y p e & s 口西口w a sm u c hl l i 曲e rm 舭m a t o ft l l e 伊e e n o n e m e a n w l l i l e ，a s ai sn e c e s s a 巧f o ra p x t 0d e c o m p o s et h eh 2 0 2 4 t h ec o m p a r i s o no fl e a fe n z y m a t i ca n t i o x i d a n t so ft w op h e o 够p e s 殳s l 豇口 t h ca c t i v i t i e so fs o da i l da p xi nr e d v i o l e tp h e n o t y p el e a v e sw e r em u c hl l i 曲c r m a i l l o s ei 1 1t h e 黟e e i lo n e s ，m e a i l w l l i l em ea c t i v i t i e so fp o d a n dc a to fr e d 访o l e t p h e n o t y p el e a v e sw e r es i 鲥f i c a n t l y1 0 w e r m a i lt h o s eo ft l l eg r e e n0 n e s t 1 1 eb 狃d so f i s o z eo fs o d 、a p x 、c a t 、p o dw e r ed i 侬r a n t i ta f f i m e dt l l ed i f i ；舒c eo f a c t i v i 时a i l dq u a l l t i t yo fe i l z y m a t i c 锄t i o x i d 觚t t h er e l a t i v ea c t i v i t i e so fs o da n da p x i l lr e d - v i o l e tp h 铋0 t y p el e a v e sw e r e1 6 5 t i m e sa i l d1 5 6t i i i l 韶h i 曲e rt h a i lt l l o s ei 1 1t h eg e no n e s ，r e s p e c t i v e l y h 1c o n 臼粥t ， r e l a t i v ea c t i v i t i e so fc a t a n dp o d i n 笋e e np h e n o t ) ，p el e a v e sw e r e 5 2t i i i l e sa 1 1 d1 4 5 4 山东师范大学硕士学位论文 一一_ = 。一 t i m e sh i 皿l e i t h 锄t l l o s ei nt h er e d v i 0 1 e to n e s i ts h o w e dt h a t 帆op h e i l o t ) ，p e s & 阳五馏 r 锄0 v et h er e a c t i v e0 x y g e ns p e c i e sb yd i f f e r e n te n z y m a t i ca n t i o x i d a l l t s ，t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tr e d v i o l e tp h e n o t y p ess 口豇口p l a n t sa r ed b l et 0a d a p tt 0 i n t e g r a t i v es 仃e s s e so fs a l “戗h y p o x i aa n d1 0 wt e m p e 均t i l r ep o s s i b l yv i ai n c r e 硒i n g 1 1 0 n 即四，1 1 1 a t i c 锄t i x i d a i 】峪s u c h 髂g s h ，a s ac o n t e i 】临锄da c t i v i t i e so fk e ye i 】忆y m a t i c a n t i o x i d a n ts u c h 嬲s o da n da p x k e yw o r d s ：跏砒s a 括n ，p h 觚0 t y p e ，1 e a 眦) ，i i l 撕c 觚t 碱d 觚t ，n o n e n z y m 撕c 锄t i o x i d a n t c l a s s i f i c a t i o n u m b e r ：q 9 4 5 7 8 5 山东师范大学硕士学位论文 1 文献综述 黄河三角洲位于山东省东北部，土壤盐渍化严重，盐渍化土壤面积约占总面 积的8 0 9 6 【2 0 】。利用传统的改良土壤盐渍化的工程措施取得了一定成绩，如淡水压 碱、挖沟排碱、引黄放淤、平地深翻和筑堤种植等，但其有许多不可克服的缺点： 费用昂贵、效果不持久、淡水资源不足、淡水冲洗后土壤中的养分和盐分同时被 排走等。要从根本上改良和利用盐碱地，必须转移到生物学措施方面，进行植物 抗盐机理研究。利用生物学措施进行植物抗盐机理的深入研究，探究提高植物抗 盐能力的有效措施，克隆耐盐基因并通过基因工程、蛋白质工程等手段培育出耐 盐作物，建立配套栽培技术使其适应盐碱地的环境是一种非常重要的途径，但这 方面的研究进展较为缓慢【2 4 1 。 盐生植物是一类适合在盐渍土上生长繁殖的植物。这类植物由于其生境恶 劣，生物量小，经济效益低，因而在过去漫长的历史岁月中一直未得到人们的足 够重视。对盐生植物开发利用程度不够，严重影响了对盐渍土的改良，一大批宝 贵的基因资源也因此自生自灭，不能造福人类。然而许多盐生植物却是在盐渍土 上唯一能正常生长的植物，尽管其经济价值低下，但其中也不乏许多具有很高开 发利用价值的种类，如可供观赏和园林绿化的植物：胡杨、补血草、白麻、柽柳 等；供医药开发的大芸、锁阳、罗布麻；可作优质饲料的骆驼刺；可作为纤维板、 编织优质原料的柽柳等。对这些耐盐植物的开发利用不仅会产生良好的经济效 益，而且对促进区域生态平衡和社会发展也将产生良好的作用。盐生植物可以减 少土壤的蒸发，阻止耕作层盐分积累，改善土壤的盐碱化程度，改善土壤肥力， 增加土壤的有机质，改善生态系统的功制2 4 1 ，其生态环境价值不可低估。研究已 知的盐生植物，开发利用盐碱地，发展盐土农业和海水农业已成为目前研究的热 点之一。 盐地碱蓬( 舰口砒s 口加l ) ，又名翅碱蓬，幼苗俗称黄须菜，是一种典型的 抗逆性强的真盐生植物，富含氨基酸和胡萝卜素等，可作为蔬菜食用；种子榨出 的油富含人体生长发育所必需的脂肪酸( 亚油酸和亚麻酸) ，具有抗肿瘤、抗动 脉粥样硬化、抗氧化和降低体内脂肪等医药保健功效。 盐地碱蓬耐盐机制十分复杂，目前对其分子水平的研究主要围绕以下几方面 展开：小分子渗透物质的调控；调控抗氧化防御系统；植物胁迫信号的转导。由 于盐地碱蓬具有众多的真盐生植物抗盐相关基因，因此人们迫切希望通过基因工 程的手段将这些抗盐基因导入到非盐生植物中去，以提高后者的抗盐能力，这对 于发展沿海滩涂农业和改良盐碱地具有十分重要的作用。可作为抗盐关键基因而 进行基因工程操作的目的基因主要有合成渗透调节物质的关键酶基因、调控抗氧 化防御反应的抗氧化基因以及离子平衡的调节基因和盐胁迫信号转导相关基因 7 山东师范大学硕士学位论文 等。但目前盐地碱蓬基因工程领域内的研究面临很多困难，如缺乏成熟有效的目 的基因；对基因导入后的表达调控缺乏了解和控制；对于导入基因在转基因植株 中引起的效应与其抗盐性之间的关系缺乏本质的了解等。基因工程的研究取得了 一些初步成果，但其中未知和不可控因素仍然很多，只有依靠对盐地碱蓬抗盐机 制的进一步了解和基因工程研究的进一步深入，才能最终筛选出成熟、有效的目 的基因和稳定的转基因表达系统。 盐生植物抗逆能力与抗氧化胁迫能力之间有着复杂而密切的联系，表现在活 性氧产生与清除平衡的破坏、恢复、维持和氧化损伤的修复等方面。盐生植物较 盐敏感植物具有较强的活性氧清除系统，在一定条件下，能够在较短的时间内恢 复活性氧产生与清除系统的平衡并保持在较高水平。 黄河三角洲滨海地区由于潮汐的影响，植物主要受到盐、低温和淹水等综合 逆境影响；离海边较远的内陆地区的植物则主要受到盐胁迫影响。生长在不同环 境下的盐生植物能够完成正常的生活史，并能形成一定的生物群落，而且同种植 物因环境因素的不同会出现不同的表型。 因而，进一步揭示植物抗逆性与活性氧代谢的关系，特别是生长在不同逆境 中同种植物的不同表型抗氧化组分的差异，将有助于对抗盐机理的进一步理解， 为盐生植物基因工程提供理论根据。 1 1 活性氧 1 1 1 活性氧造成的氧化损伤 活性氧( r o s ) 是需氧生物代谢中不可避免会产生的中间代谢物。r o s 主 要包括超氧阴离子自由基( 0 2 。) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、羟基自由基( o h ) 和单 线态氧( 1 0 2 ) 。其特点是带有孤电子，具有很强的氧化能力，与0 2 相比明显提 高了反应活性。盐碱、干旱、涝害、高温、冷( 冻) 害、重金属和有毒气体等胁迫 条件下，植物细胞产生并积累大量的活性氧，使其产生的活性氧超出活性氧清除 系统的能力时，就会产生氧化损伤，如损伤细胞结构和功能，抑制植物生长，诱 发膜脂过氧化作用，损伤生物大分子等，活性氧还可以攻击蛋白质的氨基酸残基， 尤其是t y r 、p h e 、1 却、m e t 和c y s ，形成羰基衍生物。此外，活性氧可以促进 分子内和分子问的交联，如二硫键的形成和蛋白质的断裂，超氧化物可使一些含 金属的酶类失活或产生羟自由基引发磷脂的过氧化【2 引。1 0 哪儿的h 2 0 2 可以抑 制碳固定，在l 岬。儿的低浓度下，它可使卡尔文循环中的一些巯基酶类失活。 最主要的是h 2 0 2 能够通过h a b * w d s s 反应产生更活跃、更有毒性的o h ，从而 导致膜脂过氧化、碱基突变、d n a 的断裂和蛋白质的损伤。o h 可以修饰一些 8 山东师范大学硕士学位论文 蛋白质使它们对蛋白水解酶的作用更敏感【3 6 1 ，一旦被破坏，蛋白质就会进一步被 内切酶降解，已发现在类囊体膜上存在这样的酶。逆境条件下，细胞中活性氧含 量增加，诱导膜脂过氧化，引起膜流动性下降，质膜透性大大增加，破坏膜的正 常功能【2 2 】【8 2 1 ，从而影响植物的生长发育，甚至导致死亡。 1 1 2 活性氧的有益作用 虽然过量的活性氧对植物细胞有很强的毒害作用，但在正常生命过程中活性 氧为维持生命活动所必需，如调节多种基因的表达，可作为第二信使参与信号转 导，进一步参与植物的防御反应、细胞死亡、生长和形态建成等生理生化反应【5 4 1 。 1 1 3 植物体内活性氧的产生 和其它生物相比，植物细胞中的氧浓度最高，最容易产生活性氧。植物体 内活性氧的产生是多渠道、多途径的【”】，主要可以分为：在分子氧单电子还原 过程中产生；某些酶催化产生( 已经证明黄嘌呤氧化酶系统能产生0 2 和h 2 0 2 导致脂类氧化) 和某些生物物质自动氧化产生( 如氢酶、儿茶酚胺、硫醇、还 原铁氧还蛋白等) 。就产生的部位而言，细胞壁在木质化及解体过程中产生0 2 和h 2 0 2 ：线粒体、叶绿体、微粒体、细胞核在代谢过程中也有活性氧产生。在 绿色植物组织中，光合电子传递系统是活性氧的主要来源【3 5 】【4 0 】：叶绿体光合电 子传递链p si 的受体端存在大量的自动氧化酶类，能够通过米勒反应将氧还原 成超氧化物，这些超氧化物或参与p si 电子循环，或从类囊体腔扩散至基质膜 表面，在那里超氧阴离子可通过酶促反应歧化成h 2 0 2 和0 2 ；或在铁或铜的存 在下通过f e m o n 和h a b * w e i s s 反应生成o h 和0 2 。最近研究发现，在强光处 理的类囊体及完整的叶绿体中，超氧化物和h 2 0 2 同样可由p si i 产生。 1 1 4 活性氧的清除 活性氧是机体正常代谢的产物，虽然它在细胞代谢过程中不断产生，但由于 机体自身存在保护系统，故正常情况下危害不大，机体可通过以下途径对活性氧 的氧化作用进行防护：a 、早期抑制活性氧的产生；b 、清除或猝灭已存在的活性 氧；c 、植物的光呼吸消除潜在的激烈氧化条件，抑制或限制潜在的活性氧生成； d 、损伤修复系统修复活性氧引起的d n a 、蛋白质、脂质等的氧化损伤。 概括地说，机体的抗氧化系统由酶促抗氧化系统和非酶促抗氧化系统组成， 前者称为抗氧化酶，后者称为抗氧化剂。酶促和非酶促抗氧化系统并不是孤立的， 而是相互联系，相互作用，彼此构成一个复杂的抗氧化网络【删【6 引。 1 1 4 1 非酶促抗氧化剂 非酶促保护机制中参与活性氧清除的抗氧化物有抗坏血酸( a s a ) 、谷胱甘 肽( g s h ) 、甜菜红素、多元醇、仅一生育酚( 维生素e ) 、类胡萝卜素和类黄酮等， 9 山东师范大学硕士学位论文 这些物质既可直接同活性氧反应将其还原，又可作为酶的底物在活性氧的清除中 发挥重要作用。 抗坏血酸存在于植物所有的亚细胞小室中，平均浓度为2 2 5 姗o l l ，在叶 绿体基质中浓度最高。可溶性的抗坏血酸在保护植物免受氧化损伤过程中至关重 要，它可以作为初级抗氧化物直接淬灭单线态氧、超氧化物和羟自由基；也可以 作为叶黄素循环中的紫黄质去环化酶的辅助因子，在光保护及光合调节过程中起 重要作用；还可作为次级抗氧化物直接参与0 【一生育酚的再生，并且还参与减数 分裂和细胞扩展的调节，氧还原信号的传递，病原菌防御以及金属和生物异源物 质的清除。抗坏血酸与活性氧反应后形成单脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸。脱氢 抗坏血酸可分解为酒石酸和草酰乙酸；而单脱氢抗坏血酸还原酶和脱氢抗坏血酸 还原酶又可以利用n a d ( p ) h 或谷胱甘肽提供的还原力将单脱氢抗坏血酸和脱氢 抗坏血酸氧化为抗坏血酸，从而形成抗坏血酸的循环( 图1 ) 。 岛一 i s o d 小。 图l 植物中的抗坏血酸一谷胱甘肽循环钏 f i g la s c o r b i ca c i d - g l u t a t h l o n ec i r c l ei np l 柚t 谷胱甘肽是一个三肽“g l u c y s g l y ) ，其分子式为c 1 0 h 1 7 0 6 s n 3 ，以较高浓度 ( o 卜1 0 舳o l 几) 普遍存在于微生物、植物和所有哺乳动物细胞中，如大鼠肝细 胞内浓度可达1 0 嘞0 1 l ，烟草叶肉细胞胞质浓度达6 0 岬0 1 几，拟南芥根毛表皮 细胞和基细胞胞质的分别是1 4 4 、8 0 岬0 1 l 。还原型谷胱甘肽( g s h ) 与氧化型 谷胱甘肽( g s s g ) 共存并可相互转化。在亚细胞水平，叶绿体中谷胱甘肽含量最 高，平均为卜4 咖0 1 几，胞质中也积累较高浓度的谷胱甘肽。谷胱甘肽主要以还 原形式存在，约占谷胱甘肽总量的7 0 一9 0 。谷胱甘肽作为生物体内最主要的非蛋 白巯基和含量最丰富的低分子量多肽，在植物抗逆中直接和间接参与许多功能活 动，如：( 1 ) 参与细胞内许多化合物、药物及激素的代谢；( 2 ) 通过“y 谷氨酞循 环”储存和运输半胱氨酸，是半胱氨酸的储存库；( 3 ) 参与d n a ，r n a 和蛋白质等 大分子的生物合成；( 4 ) 氧化还原的缓冲池；( 5 ) 是硫还原和硫的运输形式之一， l o 山东师范大学硕士学位论文 维持细胞内硫醇和二氧化硫的平衡；( 6 ) 对内、外源性毒物的解毒作用；( 7 ) 可能 是逆境条件下的信号传递物之一【6 5 】【吲。( 8 ) 能直接作为自由基清除剂与单线态 氧、超氧化物阴离子和羟自由基发生化学反应，能除去过氧化反应形成的酰基过 氧化物而稳定膜结构，能作为抗坏血酸循环中的还原剂，使抗坏血酸再生。在p h 值大于7 和谷胱甘肽浓度大于1 姗o l l 时，谷胱甘肽能以非酶促机制还原脱氢抗 坏血酸；在光下，叶绿体基质中的p h 值约为8 ，谷胱甘肽含量约为5 姗o l l ，上 述途径易于发生。 甜菜素( b c t a l 血s ) 最早发现于甜菜中，是吡啶衍生物，基本生色团是1 ，7 一二偶氮七甲碱吡啶衍生物，根据取代基不同，可以分为甜菜黄素( b e t 觚a 埘璐， 可见光最大吸收波长在4 6 5 眦) 和甜菜红素( b e t a c y a i l i n s ，可见光最大吸收波长 在5 3 8 衄) 。在碱性环境中，甜菜红素部分变成甜菜黄素，显黄色。甜菜红素在 自然光及紫外光下比较稳定，同时在酸性及中性环境中表现稳定，尤其在p h4 0 5 9 的溶液中，颜色亮红，具有氧化或还原作用的物质同时使用对甜菜红素具 有降解作用，如v c 。光抑制甜菜红素积累并促进其降解，黑暗、低温、高盐环 境有利于盐地碱蓬甜菜红素积累，其中萌发期黑暗是诱导甜菜红素积累的重要因 子【l 引。盐地碱篷甜菜红素积累受培养基质含盐量、温度、光照时间、发育时期的 影响，其中暗培养促进甜菜红素的积累效果最明显，g a b r i e l a 等发现，将含h 2 0 2 等自由基的溶液注射到甜菜( 眈细枷廊) 叶片中会诱导叶片甜菜红素的合成， 而加入自由基合成抑制剂n a d p h 氧化酶能明显抑制甜菜红素的积累，说明自由 基可以激活甜菜红素合成系统，而甜菜红素具有清除过氧自由基的功斛4 8 1 。 1 1 4 2 酶促抗氧化剂 酶促抗氧化系统为植物体提供了又一高效而专一的活性氧清除体系，抗氧化 酶主要包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、过氧化物酶( p o d ) 、谷胱 甘肽过氧化物酶( g p 均、抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 、谷胱甘肽还原酶( g 】r ) 、脱 氢抗坏血酸还原酶( d h a r ) 、单脱氢抗坏血酸还原酶( m d 舢蚰、谷胱甘肽一s 转移 酶( g s t ) 等。如同非酶促抗氧化剂，这些酶系统在细胞中的定位不同，分布也不 均一，有的是水溶性的，有的结合在膜上，并且多数酶有多种同工酶。这些酶的 专一性较强，分别清除不同种类活性氧。 ( 1 ) 超氧化物歧化酶( s o d ) 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 是一种含金属的抗氧化酶，在 植物界普遍存在而且具有多种类型。这些不同类型的s o d 具有不同的分子质量和 氨基酸序列，而且位于酶活性中心的金属原子也不同。根据s o d 所结合的金属原 子的不同，植物s o d 可分为三种类型：m n s o d 、c u z n s o d 和f e s o d 。低 等植物以f e s o d 和m n s o d 为主，高等植物以c u z n s o d 为主，c u z n s o d 主要 山东师范大学硕士学位论文 位于细胞质和叶绿体中，m n s o d 主要位于线粒体中，f e s o d 一般位于一些植物 的叶绿体中。f e s o d 和m n s o d 在序列和结构上具有很高的同源性，c u z n s o d 与f e s o d 或m n s o d 之间不存在同源性，s o d 存在于植物细胞内所有能够产生活 性氧的亚细胞结构中，在不同植物，以及同一细胞的不同亚细胞结构中s o d 的类 型和酶活性存在差异。 c u z n s o d 是分子质量约为3 2 k d a 的同源二聚体酶，其中一个亚基结合一个 c u 原子，另一个亚基结合一个z n 原子，两个亚基间的相互作用提高了酶的催化 活性和稳定性，金属原子的氧化还原完成了酶的催化功能。大多数原核生物的 f e s o d 和m n s o d 是同源二聚体，而植物等真核生物的f e s o d 和m n s o d 是同源 四聚体，组成f e s o d 和m n s o d 的每个亚基的分子质量约为2 0k d a ，而且每个亚 基结合有一个f e 或m n 原子。f e s o d 和m n s o d 具有同源性，它们与金属相结合 的活性中心的碱基序列和三维结构也具有同源性【2 1 1 。 s o d 是活性氧清除反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，能将超氧阴离子 自由基( 0 2 。) 快速歧化为过氧化氢和0 2 ；在随后的反应中，过氧化氢在过氧化 氢酶( c a t ) 、各种过氧化物酶( 如a p x ) 和抗坏血酸一谷胱甘肽循环系统的作用下 转变为h 2 0 和0 2 。s o d 对于清除氧自由基，防止氧自由基破坏细胞的组成、结构 和功能，保护细胞免受氧化损伤具有十分重要的作用。 ( 2 ) 抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 抗坏血酸过氧化物酶( 弱c o r b a t ep e r o x i d a s e ，a p x ) 主要用来清除h 2 0 2 。a p x 催化的反应为： 2 a s a + h 2 0 2 2 m d a ( 单脱氢抗坏血酸) + 2 h 2 0 。 a p x 是以抗坏血酸为电子供体。自1 9 7 9 年首次在菠菜叶绿体中发现以来，已 在多种植物中检测到它的存在，此酶可能普遍存在于真核生物中，a p x 还存在于 一些蓝细菌中。叶绿体中此酶含量尤其高，但胞质中也有相关形式存在，两者均 为血红素蛋白，与除了g r 以外的几乎所有过氧化物酶相同，其亚基为2 8 3 4k d a 。 但两种酶的特性迥然不同：叶绿体中a p x 在无抗坏血酸介质中迅速失活【6 5 1 ，而胞 质中a p x 却可保持相当一段时间的稳定；除此之外叶绿体中a p x 对硫醇试剂和其 它抑制剂具有更高的敏感性。叶绿体中a p x 包括两种形式：可溶性的叶绿体基质 型( s a p x ) 和不溶性的类囊体膜结合型( 御) ( ) ，其中至少有一半为t a p x ，二者都 是单体，并且具有相似的酶学特征【7 3 1 。胞质中a p x 分布在叶绿体以外的其它部位， 包括胞质、线粒体、过氧化物体、乙醛酸循环体等。除了过氧化物体膜上结合的 a p x 为单体外，其它为同源二聚体。多数植物