（微生物学专业论文）微生物发酵过程还原糖光度传感器的研究.pdf

， i 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：翻j 困 日 期：红冱：之 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：幽导师签名：丕鱼垒丝e t期：丝碰墨趁 山东大学博士学位论文 微生物发酵过程还原糖光度传感器的研究 摘要 我国发酵工业是一个品种繁多，门类齐全，具有相当规模的独立工业体 系。产品包括酒类、有机酸、抗生素、酶制剂、淀粉糖、氨基酸、核苷酸、 维生素、有机溶剂、微生物杀虫剂、植物激素、单细胞蛋白等。应用领域涉 及医药、卫生、轻工、化工、农业、能源、环保等诸多行业；其中，味精、 柠檬酸、酶制剂、酵母产量居世界前列。发酵工业已成为国民经济的重要支 柱产业之一。 发酵过程的在线检测和自动控制是发酵工业技术进步的重要发展方向。 传感器技术作为发酵过程信息的发生源，对实现发酵过程的在线检测和自动 控制起到关键作用。然而，目前我国发酵生产上发酵过程自动化控制程度不 高，落后于其他领域。用于发酵生产中的传感器主要是进行罐内物化参数的 测定。此类传感器的性能较稳定，应用也较为普遍，实现了部分参数的在线 监控。但与发酵最优化的自动控制目标相去甚远，即难以成功建立对培养过 程进行系统的反馈性控制。因为发酵过程是一个非性线、多变量和随机性的 动态过程，发酵体系是一个复杂的被控对象。温度、溶氧、p h 、培养基成分、 细胞形态、细胞浓度、产物组成及含量等均是发酵过程的重要控制参数。随 着计算机及控制技术的突飞猛进，生物传感器技术的发展，发酵动力学模型 研究的完善，发酵过程控制系统愈来愈多，应用范围亦越来越广。但是，工 业上实现发酵过程最优化自动控制的实例却不多，仍以人工控制和半自动控 制为主。其发展滞后的重要原因之一就是基于细胞代谢的生化参数信息的缺 乏。 葡萄糖( 还原糖) 作为微生物的主要碳源和能源，是发酵过程中重要的 生化控制参数，它在培养基中的含量及在发酵过程中的浓度变化直接影响发 酵产品的质量、收率和生产成本。目前实际生产过程中常采用传统的手工滴 定法或比色法进行还原糖的测定，这些方法操作繁琐、人为误差大，给企业 生产管理带来很多麻烦，也严重阻碍了发酵过程在线检测和自动控制技术的 应用。解决还原糖测定的传感器技术成为发酵工业迫切需要解决的技术难题 山东大学博士学位论文 之一。 生化传感器是一种集电子科学、生物化学和材料科学于一体的新型的分 析技术，它是将生化物质( 待测物质) 通过敏感器件，定量和高选择性地转 化为可监测的光电信号，并由电子仪器进行信息分析、处理，得到相关环境 的生化物质的信息。它从上世纪8 0 年代起，生化传感器技术和市场有了较 快的发展，在环境监测、临床医学检测、食品安全检测、发酵过程控制、石 油化工等领域广泛应用。但有关还原糖检测的传感器技术研究和应用报道不 多。 很多分析仪器可以进行还原糖或葡萄糖的测定，但对于发酵样品中还原 糖测定，这些仪器分析方法操作繁琐、测定时间长，测定成本高，不能适合 发酵生产过程大批量、高频率测定的实际要求。本研究根据还原糖氧化还原 滴定原理，将生化技术与光、电技术相结合，建立一种智能化、实用化的生 化传感分析系统，用于微生物发酵生产过程还原糖的快速检测。 采用光度传感器作为信号检测器件，响应速度快，适用环境广，且传感 器不直接与反应溶液接触，性能更加稳定，比离子电极具有更大的优势。，但 对于发酵样品的特殊性，如菌体引起的液体浊度、发酵液的颜色等，光度传 感器与常规的吸光光谱分析方法一样面l | 缶光度测量的干扰问题；而且，发酵 过程菌体浊度随发酵时间的不同而变化；另外，还原糖化学分析过程常涉及 高温，斐林试剂滴定要在沸腾状态下进行。因此，解决样品的干扰和温度控 制这两方面的问题是本研究的主要技术难点。 在最初的设计方案中曾采用流动注射吸光光谱方法进行还原糖的测定。 这一测试系统可以对一些简单样品进行还原糖测定、如蜂蜜、葡萄糖试剂等。 对发酵样品仍需要离心、过滤、活性碳脱色后测定。因为，样品的浊度直接 影响到光吸收面积或峰值的大小。还原糖容量分析法是根据滴定终点滴定液 消耗体积来计算被测样品中还原糖含量。因此，只要通过光度测定准确判断 终点就可以完成测定。本研究采用单色光电二极管作为光源，硅光电池作为 光信号转换器，进行还原糖滴定反应终点颜色变化的判断。但在测定时，一 次进样量过多，液体浊度和颜色增加，影响传感器信号的产生。对2 6 小时 谷氨酸发酵液测定实验表明，进样量超过8 0 0ul ，传感器电压信号最大值低 于0 , 2 6 m v ，滴定终点不能出现可检测的突变电压信号。本系统通过调整反 2 应池体积和试剂浓度，控制进样量在5 0 0ul 以内，则发酵液浊度、颜色对 测定结果不产生影响。 温度控制要解决两个问题，一个是加热速度，一个是加热产生的气泡干 扰。传统的液体加热方式主要是采用电热丝，如电炉或加热棒。这种加热方 式简单、方便，但加热速度慢，温度滞后效应大。a n d r e ( 1 9 9 9 ) 曾在流动 注射分析中采用微波炉加热法测定葡萄酒中还原糖。该法能快速提升液体温 度，无温度滞后，但不具备实用价值。欧姆加热( o h m i ch e a t i n g ) ，也叫电 阻热( r e s i s t a n c eh e a t i n g ) ，焦耳加热( j o u l eh e a t i n g ) ，是食品加工领 域的一项新技术。其原理是利用交流电流通过液体内部产生的电阻抗特性加 热。特点是没有传热面( 或很小) ，不会产生传统换热器在高温下易结垢、 结焦的现象。本研究通过对电热丝加热和欧姆加热的比较，探讨了欧姆加热 方式在该系统中的应用特性，建立了欧姆加热的使用方法，使液体温度在2 5 s 内达到9 8 1 0 0 。 但加热产生的气泡对光电传感器电压信号有较大的干扰。特别是加热产 生的大气泡能引起电压信号的突变，其变化量接近或超过滴定终点的电压变 化，造成滴定终点误判。本系统中，滴定液经加热套预加热，使温度达到5 0 一6 0 后进入反应池，大大减少了反应池内加热电极的加热强度，减少了突 发性大气泡的产生。同时，该系统中连接光源和光电转换器之间有一个多孔 的光通道，在搅拌的作用下，反应液体和小气泡可以均匀透过，而液体中大 气泡不能直接通过。小气泡也能引起电压信号变化，但其变化量不足滴定终 点时的1 3 0 ，且分布均匀，不会引起检测器电压的突变。在终点时，指示剂 次甲级兰的颜色消失引起的光电电压变化明显高于气泡引起的变化。因此， 加热气泡不会干扰光电信号的采集。 针对发酵样品的特殊性和试验过程中遇到的问题，设计出还原糖传感器 电路和控制软件，设计出微型反应池和相应的测试系统硬件；研究了以l e d 光电检测系统为基础的斐林试剂测定还原糖的光学响应特征、光度测定的抗 干扰性能；建立了还原糖测定方法和淀粉糖化过程的在线检测技术。传感器 性能指标达到以下要求： 1 、传感器操作简单，测定时只需用微量注射器将被测样品注入反应池 即可全自动完成；测定速度快，测定时间在3 4 分钟；结果准确，还原糖 山东大学博士学位论文 在0 一1 0 范围内，线形相关系数为0 9 9 9 8 ，精密度( r s d ) 为1 1 4 ( n = 1 0 ) ： 抗干扰能力强，样品不需要过滤、脱色处理可直接测定，回收率为9 8 1 0 3 ： 测试成本较低，试剂消耗量低于常规滴定方法。 2 、在线检测系统对1 0 0 还原糖样品连续测定精密度( r s d ) 为2 3 2 ( n = 1 0 ) ；还原糖在0 1 8 范围内线性相关系数为0 9 9 3 2 ：在线检测滞后 时间小于7 分钟。在实际生产中可连续3 3 小时自动测定淀粉糖化生产过程 还原糖变化，系统运行正常。 在以上研究基础上，将还原糖测定与葡萄糖酶电极测定技术相结合，初 步研究了谷氨酸发酵过程微生物对葡萄糖、还原糖的代谢规律和淀粉糖化过 程葡萄糖、还原糖的变化特点。 对1 3 个淀粉糖化样品的测试结果表明：糖化样品d e 值在9 5 以上，且 颜色浅，透光率好，按常规质量标准衡量基本一致。但样品中葡萄糖还原 糖值变化较大。葡萄糖还原糖比值变化从8 0 一9 4 2 ；其中，1 1 、1 2 号 样品还原糖含量差别仅有o 2 ，而葡萄糖还原糖比值相差8 以上。 对谷氨酸发酵过程还原糖和葡萄糖含量变化的测定结果显示：发酵开始 时，发酵液中还原糖含量高于葡萄糖1 0 9 ；葡萄糖还原糖为9 2 ；在0 - 8 小时之间，还原糖代谢速率为0 2 1 5 ，葡萄糖为0 2 2 5 ；8 小时以后，谷 氨酸发酵代谢速率明显提高，在1 0 2 4 小时，还原糖与葡萄糖平均代谢速 率基本相同，在0 8 左右。2 6 小时以后，发酵进入后酵期，还原糖和葡萄 糖消耗速率下降。在发酵2 8 小时，葡萄糖含量接近零，而还原糖含量为1 0 。 2 8 3 2 小时的发酵是在葡萄糖几乎等于零的条件下进行。可以看出，在发酵 过程中，菌体首先消耗葡萄糖，说明葡萄糖是谷氨酸生产菌的优势碳源和能 源。糖液质量高，葡萄糖含量稳定，对提高和稳定发酵生产效率具有重要的 作用。发酵基质中葡萄糖还原糖比值是微生物发酵生产控制的重要生化指 标。 关键词：光度传感器，葡萄糖，还原糖，在线检测，斐林试剂，谷氨酸发酵 4 山东大学博士学位论文 ap h o t o s e n s o rf o rt h em o n i t o r i n go fr e d u c i n g s u g a rinm i c r o 引a lf e r m e n l - a t i o n a b s t r a c t f e r m e n t a t i o ni n d u s t r i e s ，i n c l u d i n gt h ep r o d u c t i o no fa l c o h o l ，o r g a n i ca c i d s e n z y m ep r e p a r a t i o n s ，a n t i b i o t i c s ，s t a r c hs u g a m ，a m i n oa c i d s ，v i t a m i n s ， b i o p e s t i c i d e s ，p l a n tg r o w t hr e g u l a t o r s ，s i n g l e c a l l p r o t e i ne t c h a v eb e e n e x t e n s i v e l yd e v e l o p e di nc h i n aa n dt h e i ra p p l i c a t i o nc o v e r st h ef i e l do fm e d i c i n e ， f o o d ，c h e m i c a l s ，a g n c u l t u r e e n e r g yr e s o u r c e ，e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o ne t c t h e s c a l eo fs o m ep r o d u c t ss u c ha sm o n o s o d i u mg l u t a m a t e ( m s g ) ，c i t d ca c i d ， e n z y m ep r e p a r a t i o na n dy e a s to c c u p i e sal e a d i n gp o s i t i o ni nt h ew o r l d t h e ya r e o n eo ft h em o s ti m p o r t a n ti n d u s t r i a l si nc h i n e s ee c o n o m y f e r m e n t a t i o np r o c e s sm o n i t o ra n dc o n t r o la r ea ni m p o r t a n tp a r ti nb i o p r o c a s s e n g i n e e r i n g s e n s o r sp l a yak e yr o l ei na c q u i r i n gd a t a 们mac e r t a i nb i o p r o c e s s a n dk e e p so nu p d a t i n gac o n t r o lm o d e l t h ec u r r e n ts e n s o r sh a v e b e e n d e v e l o p e dt om o n i t o rt h ep a r a m e t e r so ft e m p e r a t u r e ，d i s s o l v e do x y g e n p h ， p r e s s u r e ，v i s c i d i t y , t u r b i d i t yc o n v e n i e n t l ya n ds o m eo fw h i c hh a v eb e e na p p l i e d s u c c e s s f u l l yt oo n l i n ec o n t r o la n do p t i m i z a t i o ns y s t e m s i nf e r m e n t a t i o ni n d u s t r b s 。 w h i c hi sa s s u m e dt ob ef u l l yc h a r a c t e r i z e db yac o n s t r u c t e dm o d e l h o w e v e r , b e c a u s eo fm u l t i p l ev a n a b l e s ，s e r i o u sn o n l i n e a ra n dm u l t i p l ew o r km o d e s ，m a n y i n d u s t r i a lp r o c e s sa r et o oc o m p l e xt ob ed e s c r i b e db yam o d e lo n l yb a s e do n p h y s i c a lp a r a m e t e r s f u r t h e r m o r o t h ep r e s e n tm o d e l sn o to n l yr e d u c e st h e e s t i m a t ep r e c i s i o nb u ta l s oi n c r e a s e st h ec o m p u t a t i o n a lc o m p l e x i t y , b e c a u s e t h e r ea r el a c ko fe f f e c t i v eo n l i n ei n s t r u m e n tf o re f f i c i e n t l y m e a s u r i n g t h e b i o c h e m i c a i l n f o r m a t i o nt h a ta r ee s s e n t i a if o rt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s sc o n t r 0 1 5 山东大学博士学位论文 r e d u c i n gs u g a ro rg l u c o s e ，t h em a i nc o m p o n e n ta n de n e r g yr e s o u r c eo f m i c r o b e i sa ni m p o d a n tf a c t o rf o rm i c r o b i a lg r o w t ha n dm e t a b o l i s m ，w h i c hi s d o s er e l a t e dt ot h ep r o d u c t i v i t ya n dp r o d u c tq u a l i t yi nm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n c o n v e n t i o n a lm e t h o ds u c ha st i t r a t i o na n dc o l o rm e a s u r e m e n ta r ew e l i e s t a b l i s h e da n dw i d e l yu s e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fr e d u c i n gs u g a ri n f e r m e n t a t i o ni n d u s t r i e s t h e s em e t h o d sc o u l db ev e r ya c c u r a t e i fa l lt h e p r o c e d u r ei sp e r f o r m e dw i t hm u c hc a r ea n db ye x p e d e n c e da n a l y s t s h o w e v e e t h e i rm a i nd r a w b a c k sa r et h el o n gt i m ed e l a y , c o m p l i c a t e dp r o c e d u r e 。a n dh e a v y r e l i a n c eo nm a n u a ie x p e d e n c e w h i c hc a u s e sm u c ha t i e n t i o no nt h en e e df o r r a p i d ，s e n s i t i v e ，a n ds p e d f l cs e n s o rf o rt h i sd e t e r m i n a t i o n b i o c h e m i c a ls e n s o ri su s u a l l yf a b r i c a t e dw i t ht h ec o m p o n e n t sb a s e do n b i o c h e m i s t r y , e l e c t r o n i c sa n dn e wm a t e r i a l ，i nw h i c ht h eb i o r e a c t i o ni n f o r m a t i o n c a nb eo b t a i n e dq u a n t i t a t i v e l ya n ds e l e c t i v e l yb yas e n s i t i v ee l e c t r o n i c a l l y t r a n s i t i o nu n i t ，s i n c e19 8 0 sc o m m e r c i a lb i o c h e m i c a ls e n s o r sh a v eb e e nr a p i d l y d e v e l o p e da n dc a t e r e dt o a ne x t e n s i v er a n g eo fa p p l i c a t i o n h o w e v e r , t h e r ei s r a r e l yb i o c h e m i c a ls e n s o ra v a i l a b l ef o rt h ed e t e r m i n a t i o n o fr e d u c i n gs u g a ri n f e r m e n t a t i o ni n d u s t d e s a n a l y z e r so ra u t o m a t i c a li n s t r u m e n th a v eb e e nw i d e l yu s e df o rt h ed e t e c t i o n o fr e d u c i n gs u g a ro rg l u c o s e h o w e v er ，t h e s em e t h o d sa l s os h o wt h ed r a w b a c k s o fl o n gt i m ed e l a y , t e d i o u ss a m p l ep r e t r e a t m e n ta n dh i g h e rc o s t ，w h i c hi sn o t s u i t a b l ef o ri n d u s t r yr o u t i n ea n a i y s t s t h i sr e s e a r c hf o c u s e dm a i n l yo nt h e d e v e l o p m e n to fap h o t o - b i o c h e m i c a ls e n s o rt h a tc a nb ea d a p t i v e l yu s e dt ot h e m o n i t o r i n go fr e d u c i n gs u g a ri nf e r m e n t a t i o np r o c e s s p h o t o s e n s o rh a st h ea d v a n t a g eo fr a p i dr e s p o n s e ，h i g h e rs t a b i l i t y ，e a s yt o u s e ，i n e x p e n s i v ec o n s t r u c t i o n ，a n dn oc o n t a c to fo p t i c a lp a r t sw i t hu n f r i e n d l y m e d i ao v e ri o ne l e c t r o d e h o w e v e r , p h o t o s e n s o rr e m a i n se s s e n t i a l l yt h es a m e p r o b l e ma st h ec o n v e n t i o n a lo p t i c a l i n s t r u m e n tt h a tt h e r ei sa no b v i o u s 6 山东大学博士学位论文 i n t e r f e r e n c ec a u s e db yt h et u r b i d i t ya n dc o l o ri nf e r m e n t a t i o ns a m p l e m o r e o v e r , t h e ya l s of a c et h ed i f f i c u l t yt h a tt h eb i o c h e m i c a lr e a c t i o nf o rr e d u c i n gs u g a rt e s ti s u s u a l l yc o n d u c t e du n d e ra l k a l i n em e d i u ma n dh i g ht e m p e r a t u r e ( 1 0 0 。c ) s o t h et w op r o b l e m s ，o p t i c a li n t e r f e r e n c ea n dt e m p e r a t u r ec o n t r o l ，s h o u l db et a k e n i n t oa c c o u n tf o rt h i sr e s e a r c h f l o wi n j e c t i o nm e t h o du s i n gp h o t o m e t r i cm e a s u r e m e n th a s b e e ni n t r o d u c e d t ot h et e s ta tp r i m a r yd e s i g ns t a g eo ft h i sr e s e a r c h ，w h i c hc a nd e t e c tr e d u c i n g s u g a ri nat r a n s p a r e n ts a m p l es u c ha sg l u c o s er e a g e n t ，b e eh o n e ye c t b u t ，a p r e t r e a t m e n to ff e r m e n t a t i o ns a m p l es h o u l db em a d eb e f o r es a m p l ei n j e c t i o 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a w b a c k s o fs l o wh e a t i n gs p e e da n dl o n gt e m p e r a t u r el a g am i c r o w a v e a s s i s t e dh e a t i n g 7 山东大学博士学位论文 p r o c e d u r eh a sb e e np r o p o s e db ya n d r ei n 19 9 9f o rr e d u c i n gs u g a rd e t e c t i o n w i t hh i g he l e v a t i o nt e m p e r a t u r er a t e ( 46s ) a n dw i t h o u tt e m p e r a t u r el a g h o w e v e r ，s a f e t yc o n d i t i o ns h o u l db ei m p r o v e d f o rt h ea c c e - p t a n c eo ft h i s s t r a t e g y i n a n a l y t i c a l l a b o r a t o r i e s o h m i ch e a t i n g ，a l s oc a l l e de l e c t r i c a l r e s i s t a n c eh e a t i n g ，j o u l eh e a t i n g ，o re l e c t r o - h e a t i n g ，i sa na d v a n c e dt h e r m a l p r o c e s s i n gm e t h o d ，w h i c hs e r v e sa sa ne l e c t r i c a lr e s i s t o r t h es o l u t i o ni sh e a t e d b yp a s s i n ge l e c t r i c i t yt h r o u g hi t e l e c t r i c a le n e r g yi sd i s s i p a t e di n t oh e a t ，w h i c h r e s u l t si nr a p i da n du n i f o r mh e a t i n ga n dl e s sc l e a n i n gr e q u i r e m e n t sd u et o r e d u c e dp r o d u c tf o u l i n go nt h ec o n t a c ts u d a c e t h i sh e a t i n gm e t h o d sw a s a p p l i e dt ot h er e d u c i n gs u g a rs e n s o rs y s t e m ，w h i c hc o u l d e l e v a t e l i q u i d t e m p e r a t u r et o9 8 1 0 0 cw i t h i n2 5 s o n ep r e c a u t i o no rd i f f i c u l t yw a st h a tt h eb u b b l ep r o d u c e db yt h eh e a t i n g p r o c e d u r e sh a dag r e a ti n f l u e n c eo na c c u r a c y t h ea b s o r b a n c ec u r v ec o u l d p r e s e n t a nu n r e g u l a t e d c h a n g ec a u s e db yt h e b u b b l e st h a t i n t e r f e r e si n d e t e r m i n i n g t h e e n d p o i n tc o r r e c t l y t w o m e a s u r e s w e r e p r o p o s e d f o r o v e r c o m i n gt h el i m i t a t i o n a tf i r s t ，w h e nr e a g e n ts t r e a mp a s s e st h r o u g hr e a g e n t t u b e ，t h el i q u i dw a sh e a t e dt oat e m p e r a t u r eo f5 0 6 0 。cb e f o r eb e i n gr e l i e v e dt o t h er e a c t i o nc e l l ，w h i c hc o u l dw e a k e nt h eh e a t i n gi n t e n s i o ni nt h ec e l l s e c o n d ， o n ep o r o u st u b ew a sp l a c e db e t w e e nt h el i g h ts o u r c el e da n dt h e p h o t o t r a n s i s t o ra l o n gt h el i g h tp a t h ，w h i c ha l l o w e dr e a c t i o ns o l u t i o nm o v et h r o u g h t h et u b ef r e e l ya n dt h eb i g g e rb u b b l e st h a tc a nc a u s es h a r pi n c r e a s eo rd e c r e a s e o ft h ea b s o r b a n c ew e r el i m i t e dt om o v ei n t ot h el i g h tp a t h a l t h o u g ht h es m a l l b u b b l e sc o u l dm o v ei n t ot h el i g h tp a t ht h e r ew a sn oi n t e r f e r e n c eo nd e c i d i n ge n d p o i n tc o r r e c t l yb e c a u s et h er a n g eo fl i g h ta b s o r b a n c ea tt h ee n d - p o i n tw a s3 0 t i m e sh i g h e rt h a nt h a tc a u s e db yt h es m a l lb u b b l e s c o n s i d e r e dt h e p r o b l e m s o rl i m i t a t i o nm e n t i o n e da b o v e ，t h er e l a t e d h a r d w a r ea n ds o f t w a r ew e r ed e s i g n e da n dar e d u c i n gs u g a rs e n s o rs y s t e mw a s 8 山东大学博士学位论文 i n t e g r a t e d ，w i t hw h i c ht h ec h a r a c t e r i s t i c so fp h o t o s e n s o rr e s p o n s e ，r e p r o d u c i b i l i t y a n dr e l i a b i l i t yw e r es t u d i e d t h eo p e r a t i o np r o c e d u r ea n da no n l i n em o n i t o n n g t e c h n i q u ew e r ea l s oe s t a b l i s h e d t h em a i np a r a m e t e r so ft h es y s t e ma r el i s t e d a sf o l i o w s ： 1 t h es e n s o rc a nb ee m p l o y e dt oa n a l y z ei n d u s t r i a lr e d u c i n gs u g a rw i t h h i g h e ra c c u r a c ya n dp r e c i s i o n s a m p l ec a nb ei n j e c t e dd i r e c t l yi n t ot h er e a c t i o n c e l lw i t h o u ti n t e r f e r e n c ec a u s e db yt u r b i da n dc o l o r e ds u b s t a n c e s t h e r ew a sa g o o dl i n e a rc o r r e l a t i o ni nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f0 - 1 0 fr = 0 9 9 9 8 ) ；t h er s d w a s1 1 4 ( n = 1 0 ) ：t h er e c o v e r yr a t ew a sb e t w e e n9 8 - 1 0 3 i tt o o k3 - 4m i nf o r e a c hs a m p l ea n a l y s i sa n dl e s sr e a g e n tc o n s u m p t i o nt h a nc o n v e n i e n tm e t h o d 2 a no n l i n es y s t e mw a sa p p l i e dt oc o n t i n u o u sm o n i t o r i n gr e d u c i n gs u g a r t h el i n e a rc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a s0 9 9 3 2i nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f0 - 18 ： t h er s dw a s2 3 2 ( n = 1 0 ) ：t h el a gt i m ew a sl e s st h a n7m i n t h i ss y s t e mw a s u s e dt oi n d u s t r i a lp r o c e s sc o n t r o lf o ro n l i n ed e t e r m i n a t i o no fr e d u c i n gs u g a rw i t h g o o da d a p t a t i o ni n3 3 h r e d u c i n gs u g a ra n dg l u c o